METODOLOGI PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian deskriptif yang bertujuan untuk menggambarkan sifat dari suatu keadaan secara sistematis, yaitu untuk identifikasi dan penetapan kadar Rhodamin B dari beberapa jenis jajanan anak di sekolah dasar.
3.1 Alat-Alat dan Bahan-bahan yang digunakan
Alat-alat yang digunakan terdiri dari spektrofotometer UV Mini-1240 (Shimadzu) yang dihubungkan dengan printer Epson LQ 300, neraca analitis (Vibra), penangas air, dan alat-alat gelas seperti erlenmeyer, gelas ukur, gelas beaker, corong pisah, cawan penguap dan chamber, Kertas whatman dan benang wool.
Bahan bahan yang digunakan dalam penelitian ini jika dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis (E.Merck), yaitu natrium hidroksida, asam asetat glasial, asam klorida, amonium hidroksida, butanol, dietil eter, n-heksan, etanol dan akuades.
3.2 Sampel
Metode pengambilan sampel yang dilakukan adalah secara purposif yaitu didasarkan pada jajanan anak-anak yang beredar pada sekolah-sekolah dasar. Tempat pengambilan sampel dilakukan pada 20 Sekolah Dasar yang ada di Kecamatan Tiga lingga Kabupaten Dairi. Sampel yang diambil adalah jajanan anak Sekolah Dasar yang berwarna merah seperti saus, minuman, permen, kembang gula dan kerupuk.
3.3 Pembuatan Pereaksi
dididihkan selama 5 menit atau lebih dan didiamkan sampai dingin dan tidak boleh menyerap karbondioksida dari udara. NaOH 10% dibuat dengan cara melarutkan 10 gram natrium hidroksida dengan air suling bebas CO2 hingga 100 ml, NaOH 0,5% dibuat
dengan cara melarutkan 500 mg natrium hidroksida dalam air bebas CO2 hingga 100 ml,
HCl 0,1N dibuat dengan cara mengencerkan 8,5 ml HCl 37% dengan air suling hingga 1000 ml (Ditjen POM, 1995). Sedangkan larutan amonia 2% dibuat dengan cara melarutkan 2 ml amonia pekat dengan etanol 70% hingga 200 ml (BBPOM, 2006).
3.4 Prosedur Kerja
3.4.1 Analisa Kualitatif Rhodamin B
Pemeriksaan Kualitatif Rhodamin B pada sampel menggunakan metode Kromatografi Kertas dan Spektrofotometer Sinar Tampak.
3.4.1.1 Spektrofotometri Sinar Tampak
Metode Spektrofotometer Sinar Tampak berdasarkan prosedur dari BBPOM, 2006. Prinsip dari metode ini adalah dengan membandingkan kurva absorbansi yang diukur dengan spektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 450-750nm. Prosedur ini dimulai dengan pembuatan larutan baku pembanding dan larutan uji.
Pembuatan Larutan Baku Pembanding dan Larutan Uji
Baku pembanding Rhodamin B dibuat dengan cara melarutkan 50 mg Rhodamin B dengan HCl 0,1 N dalam labu tentukur 50 ml sampai batas tanda. Dari larutan ini dipipet 2,5 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml diencerkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda, lalu dikocok homogen. Kemudian dipipet 2 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dan diencerkan dengan HCl 0,1 N sampai batas tanda.
Ditimbang sampel masing-masing berturut-turut kerupuk (± 15 g) dihomogenkan, kembang gula (± 15 g), saus (± 45 g), dan es doger (± 90 g), kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml, ditambah dengan 100 ml larutan amonia 2% kemudian ditutup dan didiamkan semalam sehingga semua pewarna larut. Larutan disaring dan diuapkan diatas penangas air hingga kering. Residu dilarutkan dengan 30 ml air, dimasukkan kedalam corong pisah 250 ml, ditambahkan 6 ml larutan natrium hidroksida 10%. Lalu diekstraksi dengan 30 ml dietil eter. Ekstrak eter dipisahkan dan dicuci dengan 10 ml larutan natrium hidroksida 0,5% dan lapisan airnya dibuang. Ekstrak eter diekstraksi tiga kali, tiap kalinya dengan 10 ml asam klorida 0,1 N hingga lapisan eter tidak berwarna lagi, lapisan eter dibuang dan ekstrak asam klorida 0,1 N ditampung dalam labu tentukur 50 ml dan ditambahkan asam klorida 0,1 N sampai tanda. Kemudian baku pembanding dan sampel diukur dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak pada panjang gelombang 450-750 nm (BBPOM., 2006).
3.4.1.2 Kromatografi Kertas
Metode Kromatografi Kertas (KKt) berdasarkan prosedur dari BBPOM, 2007. Sampel ditimbang 30 gram larutkan masing-masing sampel dalam 50 ml akuades kemudian tambahkan asam asetat 6%, masukkan benang wool dan panaskan diatas penangas air sambil diaduk-aduk sampai 10 menit. Ambil Benang wool, cuci berulang- ulang dengan akuades hingga bersih. Benang wool yang telah bersih dimasukkan ke dalam cawan penguap, tambahkan larutan ammonia encer secukupnya, dipanaskan diatas penangas air hingga warna benang wool luntur. Larutan berwarna yang dperoleh dikumpulkan dalam cawan porselin dan diuapkan diatas penangas air hingga kering dan dilarutkan dalam 2 ml air.
Baku pembanding dibuat dengan cara melarutkan 50 mg Rhodamin B dengan 100 ml akuades. Campuran dan baku pembanding dibuat dengan cara melarutkan 30 mg
masing-masing sampel dalam 50 ml aquades, ditambahkan 50 mg Rhodamin B dalam masing-masing larutan sampel, campur homogen tambahkan asam asetat 6%, kemudian dibuat perlakuan yang sama dengan pembuatan larutan sampel (Ditjen POM, 2000).
Plat KKt berukuran 20 x 20 cm. Larutan sampel, baku pembanding, dan campuran sampel dan baku pembanding, masing-masing ditotolkan pada plat dengan menggunakan pipa kapiler pada jarak 2 cm dari bagian bawah plat dan jarak antar noda adalah 2 cm. kemudian dibiarkan beberapa saat hingga mengering. Plat KKt yang telah mengandung cuplikan dimasukkan kedalam chamber yang terlebih dahulu telah dijenuhkan dengan fase gerak berupa n-butanol, asam asetat glasial, dan akuades (40 : 10 : 24). Dibiarkan fase bergerak sampai hampir mendekati batas atas plat. Kemudian plat KKt diangkat dan dibiarkan kering di udara. Diamati noda secara visual kemudian dihitung harga Rf nya dan dibawah sinar UV, jika secara visual noda berwarna merah jambu dan dibawah sinar UV 254 nm berfluoresensi kuning, menunjukkan adanya Rhodamin B (Ditjen POM, 2000).
3.4.2 Analisa Kuantitatif Rhodamin B
Penetapan Kadar Rhodamin B pada sampel menggunakan prosedur dari
BPOM, 2006. Prosedur ini dimulai dengan pembuatan larutan baku rhodamin B, penentuan panjang gelombang, penentuan waktu kerja, kurva kalibrasi larutan rhodamin B dan penetapan kadar rhodamin B pada sampel.
3.4.2.1 Pembuatan Induk Larutan Baku Pembanding
Ditimbang dengan seksama 50 mg BPFI Rhodamin B kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, larutkan dengan HCl 0,1 N hingga larut, cukupkan volume sampai 50 ml, larutan ini disebut larutan induk baku I (LIB I).
Dipipet 2,5 ml larutan induk baku I, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml diencerkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda, lalu dikocok sampi homogen. Diperoleh larutan dengan konsentrasi 50mcg/ml (LIB II).
3.4.2.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Dipipet 2 ml dari larutan induk baku II dan dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml, dicukupkan dengan HCl 0,1 N sampai 50 ml (konsentrasi 2 mcg/ml). Diukur serapan pada panjang gelombang 450-750 nm, dengan menggunakan blanko. Sebagai blanko digunakan HCl 0,1N.
3.4.2.3 Penentuan Waktu Kerja Larutan Rhodamin B
Dipipet 2 ml larutan induk baku II dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, lalu ditambahkan HCl 0,1N sampai ke garis tanda (konsentrasi 2 mcg/ml). Diukur pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh selama 30 menit.
3.4.2.4 Penentuan Kurva Kalibrasi
Dari larutan induk baku II dipipet sebanyak 1ml, 1,5ml, 2ml, 2,5ml dan 3 ml dengan menggunkan maat pipet dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml dan masing- masing diencerkan dengan HCl 0,1N sampai garis tanda (konsentrasi masing-masing larutan 1; 1,5; 2; 2,5; dan 3mcg/ml). Kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh dan sebagai blanko digunakan HCl 0,1N akan diperoleh kurva konsentrasi vs absorban.
3.4.2.5 Penetapan Kadar Rhodamin B pada Sampel
Diekstraksi Rhodamin B dari sampel, prosedur kerjanya sama dengan pembuatan larutan sampel (dilihat pada 2.4.1.1). hasil ekstraksi diukur pada panjang gelombang 557nm dan sebagai blanko digunakan HCl 0,1 N. Konsentrasi Rhodamin Bdalam sampel
dapat ditentukan berdasarkan persamaan garis regresi linier dari kurva kalibrasi y = ax + b, dan kadar Rhodamin B dalam sampel ditentukan dengan menggunakan rumus:
Rumus Perhitungan Kadar Rhodamin B.
s Fp V Β Χ = Κ . .
Keterangan K = Kadar total Rhodamin B dalam sampel (mcg/g)
X = Kadar Rhodamin B sesudah pengenceran
V = Volume sampel (ml)
Fp = Faktor Pengenceran
Bs = Berat sampel
3.5 Uji Validasi Metode Analisis
Validasi dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis yang dilakukan akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Uji validasi yang digunakan yaitu uji akurasi dengan parameter uji perolehan kembali, uji presisi, batas deteksi dan batas kuantitasi.
3.5.1 Penentuan Uji Perolehan Kembali
Uji perolehan kembali dilakukan dengan menambahkan larutan baku Rhodamin B dengan konsentrasi 50 mcg/ml sebanyak 1 ml kedalam sampel kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama pada sampel.
Menurut WHO (1992), perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus sebagai
berikut : Uji perolehan kembali (%) =
A C CA CF * − x 100%
Keterangan : CF = Konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan
CA = Konsentrasi sampel sebelum penambahan larutan baku.
C*A = Konsentrasi larutan baku yang ditambahkan. 3.5.2 Uji Ketelitian
Adapun parameter uji ketelitian yaitu koefisien variasi atau relative standard deviation (%RSD). Harga persentase koefisien variasi (%RSD) ditentukan dengan rumus:
RSD =
X SD
x 100%
Keterangan : SD = Standar Deviasi
X = Kadar rata-rata setelah ditambah larutan baku (WHO, 1992).
3.5.3 Penentuan Batas Deteksi Dan Batas Kuantitatif
Batas Deteksi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi yang masih memberi respon signifikan dibandingkan dengan blanko (WHO., 1992).
Batas deteksi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Batas Deteksi =
slope
SD
x
3
Batas Kuantitasi adalah kuantitatif analit terkecil dalam sampel yang masih memiliki kriteria cermat dan seksama (WHO,1992).
Batas kuantitasi dapat dihitung dengan rumus :
Batas Kuantitasi =
slope
SD
x
3.6 Analisa Data Secara Statistik
Untuk mengetahui data diterima atau ditolak dapat dilakukan uji statistika distribusi t. Dimana kadar Rhodamin B yang diperoleh dianalisa secara statistika dengan metode standar deviasi dengan rumus:
SD =
1
n
X
Xi
2 _−
−
∑
Keterangan : Xi = Kadar sampel
X = Kadar rata-rata sampel n = Jumlah perlakuan untuk mencari thitung digunakan rumus :
t
hitung=
n SD
- Xi X−
sebagai dasar penolakan data hasil uji analisisnya t
hitung>t
tabel.
Untuk mencari kadar yang sebenarnya dengan interval kepercayaan 95%
dengan nilai α = 0,05 ; dk = n-1, dapat dipergunakan rumus :
Kadar Rhodamin B (μ) =
X± t(1 - ½ α) x SD/
n
Keterangan :
μ = Interval kepercayaan kadar sampel
X