METODOLOGI PENELITIAN - Efek Antiinflamasi Ekstrak Jahe Merah (Zingiber officinalle roscoe) pad

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis dan Rancangan Penelitian

4.1.1 Jenis Penelitian : Eksperimental Laboratorium 4.1.2 Rancangan Penelitian : Rancangan Acak Lengkap

4.2. Tempat dan Waktu Penelitian 4.2.1 Tempat Penelitian

 Laboratorium Obat Tradisional dan Laboratorium Farmakologi Farmasi USU

 Laboratorium Patologi Anatomi FK USU

4.2.2 Waktu Penelitian

Waktu penelitian adalah September 2014 sampai Juni 2015.

4.3 Populasi, Sampel, dan Besar Sampel 4.3.1 Populasi : Kelinci Jantan

4.3.2 Sampel : Gigi Kelinci Jantan

Kriteria inklusi kelompok sampel :

 Kelinci Jantan dengan berat badan 1,5-2 kg  Kelinci Jantan dengan rentang umur 3-5 bulan

 Kelinci Jantan yang memiliki gigi insisivus atas dan bawah

Kriteria eksklusi kelompok sampel :

 Kelinci Jantan yang tidak memiliki gigi insisivus atas dan bawah

4.3.3 Besar Sampel

Pada hari 1 :

Pada setiap kelinci, diaplikasikan :

 Esktrak jahe merah 1% : gigi insisivus 1 kanan atas  Ekstrak jahe merah 2% : gigi insisivus 1 kiri atas  Eugenol : gigi insisivus 1 kanan bawah  Kontrol negatif (-) : gigi insisivus 1 kiri bawah

Pada hari 3 :

Pada setiap kelinci, diaplikasikan :

Pada hari 7 :

Pada setiap kelinci, diaplikasikan :

(12-1)(r-1) ≥ 15 r ≥ 2,3 r ≥ 3

dengan, t : Jumlah kelompok perlakuan r : Jumlah sampel tiap kelompok

Jadi besar sampel untuk setiap kelompok perlakuan adalah 3 gigi, sehingga besar sampal pada setiap kelompok hari adalah 12 gigi. Pengamatan dilakukan berdasarkan waktu yaitu pada hari 1, 3, dan 7, sehingga jumlah gigi adalah 36 gigi.

4.4 Variabel Penelitian

Variabel terikat

 Efek antiinflamasi yang diukur berdasarkan penurunan sel-sel radang dan penyembuhan

Variabel bebas

 Ekstrak Jahe Merah 1% dan 2%, Eugenol

Variabel terkendali

 Jenis kelamin kelinci jantan  Berat kelinci 1,5-2 kg  Umur kelinci 3-5 bulan  Makanan kelinci

 Jadwal makan kelinci (pukul 09.00 dan 16.00)

 Lama waktu adaptasi kelinci dalam kandang 1 minggu

 Suhu kandang kelinci (32°C)  Jenis dan bentuk mata bur (bur

intan bulat kecil, no.1)

 1 bur intan bulat untuk 1 gigi yang dipreparasi

 Kecepatan putar dari bur 35000 rpm

 Jumlah larutan yang diaplikasi ke ruang pulpa (20µl)

 Tumpatan RM-GIC untuk menutup kavitas

 Light cure selama 20 detik

 Waktu pengamatan dilakukan pada hari ke 1,3 dan 7

 Keterampilan operator

Variabel tidak terkendali

 Suhu dan lamanya waktu penyimpanan jahe merah setelah dipetik sampai ekstraksi jahe merah

 Lamanya waktu penyimpanan ekstrak jahe merah dari disimpan sampai digunakan

 Perlakuan kelinci dari lahir sampai digunakan sebagai hewan coba

 Variasi struktur anatomis gigi rahang atas kelinci

4.4.1 Variabel bebas: ekstrak jahe merah 1%, ekstrak jahe merah 2%, dan eugenol.

4.4.2 Variabel terikat: efek antiinflamasi yang diukur berdasarkan penurunan sel-sel radang dan penyembuhan (neutrofil, limfosit, makrofag, sel plasma, fibroblas).

4.4.3 Variabel terkendali

 Jenis kelamin kelinci jantan  Berat kelinci 1,5-2 kg  Umur kelinci 3-5 bulan  Makanan kelinci

 Jadwal makan kelinci (pukul 09.00 dan 16.00)

 Lama waktu adaptasi kelinci dalam kandang 1 minggu  Suhu kandang kelinci (32°C)

 Jenis dan bentuk mata bur (bur intan bulat kecil, no.1)  1 bur intan bulat untuk 1 gigi yang dipreparasi

 Kecepatan putar dari bur 35000 rpm

 Jumlah larutan yang diaplikasi ke ruang pulpa (20µl)  Tumpatan RM-GIC untuk menutup kavitas

 Light cure selama 20 detik

 Waktu pengamatan dilakukan pada hari ke 1,3 dan 7  Keterampilan operator

4.4.4 Variabel tidak terkendali

 Suhu dan lamanya waktu penyimpanan jahe merah setelah dipetik sampai ekstraksi jahe merah

 Lamanya waktu penyimpanan ekstrak jahe merah dari disimpan sampai digunakan

 Perlakuan kelinci dari lahir sampai digunakan sebagai hewan coba  Variasi struktur anatomis gigi rahang atas kelinci

4.5 Definisi Operasional

Tabel 1. Definisi operasional variabel bebas No Variabel

Terikat

Definisi Operasional Alat Ukur Satuan Ukur

Skala Ukur

1. Ekstrak Jahe Merah

Ekstrak jahe merah diperoleh dengan menimbang 0,1 gram dan 0,2 gram kemudian dilarutkan dalam 10 ml larutan CMC 0,2% sehingga menghasilkan konsentrasi 1% dan 2%

Spuit Gram dan Mililiter

Nominal

2. Eugenol Bahan pereda yang sering digunakan dalam meredakan nyeri pulpa,

dengan merek

Biodinamica

Tabel 2. Definisi operasional variabel terikat No Variabel

Terikat

Definisi Operasional Alat Ukur Satuan Ukur Skala Ukur 1. a. b. Efek antiinflamasi Neutrofil Makrofag

Efek antiinflamasi dilihat dari penurunan sel radang dan penyembuhan (neutrofil, makrofag, limfosit, sel plasma, fibroblas)

Neutrofil merupakan sel pertama yang muncul pada radang akut. Neutrofil mempunyai bentuk seperti tapal kuda, berdiameter 9-12μm, dan memiliki inti yang multi lobus (3-4 lobus) yang dihubungkan oleh benang kromatin. Inti terisi penuh oleh butir kromatin sehingga sangat mengikat zat warna basa menjadi biru atau ungu.26,27 Sel ini dijumpai pada inflamasi akut. Makrofag merupakan sel hasil diferensiasi monosit yang bermigrasi dari aliran darah ke jaringan ikat. Makrofag mempunyai ukuran 10 sampai 30μm dan memiliki bentuk ireguler, dengan nukleus berbentuk seperti ginjal yang terletak eksentris.27 Makrofag adalah sel bernukleus tunggal, yang dapat menyatu dengan makrofag lain untuk memproduksi sel

Mikroskop cahaya (Olympus) Perbesaran 400x, skor: 1= normal 2= ringan 3 = sedang 4 = berat Ordinal

4.6 Bahan dan Alat Penelitian 4.6.1 Bahan Penelitian

 Ekstrak Jahe Merah

 Eugenol ( Biodinamica, USA ) c. d. e. Sel Plasma Limfosit Fibroblas

besar yang bernukleus banyak yang disebut giant cells.26 Sel ini dijumpai pada inflamasi akut.

Sel plasma memiliki bentuk lonjong dan besar, diameter 20μm dengan nukleus yang terletak eksentris, dengan heterokromatin yang mengelilingi nukleus dan terlihat terang. Sitoplasmanya basofilik yang merupakan hasil dari banyaknya retikulum endoplasma yang kasar.26,27 Sel ini dijumpai pada inflamasi kronis. Limfosit yang paling dominan dalam darah memiliki ukuran yang kecil dengan diameter 8-10μm dan berinti bulat dan berwarna gelap. Sitoplasmanya basofilik dan sedikit, serta mengelilingi nukleus.26 Sel ini dijumpai pada inflamasi kronis.

Fibroblas mempunyai bentuk yang bervariasi, dari bentuk seperti sigaret sampai bentuk seperti bintang dengan cabangnya yang pendek. Sel ini dijumpai pada proses penyembuhan (healing).27

 Cotton Pellet

 Saline ( Kimia Farma, Indonesia )

 Alkohol 70% 1 liter ( Kimia Farma, Indonesia )  Ketamin (Kimia Farma, Indonesia)

 RM-GIC (Ionoseal, VOCO)

4.6.2 Alat Penelitian

 Bur akses kecil ( Dentsply )  Mikromotor (Woodpecker, China)  Handpiece (Woodpecker, China)  Pasungan kelinci

 Kandang kelinci

 Pinset, sonde, kaca mulut, instrument plastis ( Dentica )  Spuit 1 ml ( Terumo, Japan )

 Spuit 5 ml ( Terumo, Japan )

 Mikroskop cahaya ( Olympus, Japan )  Light Cure

4.7 Prosedur Penelitian 4.7.1 Persiapan bahan coba

Ekstrak jahe merah diperoleh dari penelitian Tati Saida Ratna (2009) (Gambar 6). Dari ekstrak ini dibuat ekstrak jahe merah 1% dan ekstrak jahe merah 2%.

4.7.1.1 Pembuatan ekstrak jahe merah konsentrasi 1%

Panaskan aquadest sebanyak 10 ml dan pindahkan ke lumpang (Gambar 7). Sebanyak 20 mg bubuk CMC (Carboxy Methil Cellulose) ditimbang dengan menggunakan neraca analitik elektrik (Sartorius, Germany) (Gambar 8), kemudian ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi aquadest 10 ml (Gambar 9). Diamkan selama 30 menit (Gambar 10) hingga diperoleh masa transparan, kemudian digerus hingga berbentuk gel atau masa yang kental dan homogen. (Gambar 11).

Timbang ekstrak sebanyak 0,1 gram (Gambar 12) ditambahkan larutan CMC 10 ml sedikit demi sedikit sambil digerus (Gambar 13), kemudian disimpan dalam botol vial (Gambar 14).

Gambar 7. 10 ml aquadest dipanaskan Gambar 8. 20 mg bubuk CMC

Gambar 9. 20 mg bubuk CMC Gambar 10. Diamkan ditaburkan ke dalam 30 menit lumpang yang berisi

Gambar 11. Penggerusan Gambar 12. Ekstrak jahe merah CMC hingga ditimbang 0,1 gram homogen

Gambar 13. Ekstrak jahe merah Gambar 14. Ekstrak jahe dan larutan CMC merah 1% digerus hingga

homogen

4.7.1.2 Pembuatan ekstrak jahe merah konsentrasi 2%

Timbang ekstrak sebanyak 0,2 gram (Gambar 15) ditambahkan larutan CMC 10 ml sedikit demi sedikit sambil digerus (Gambar 16), kemudian disimpan dalam botol vial (Gambar 17).

Gambar 15. Ekstrak jahe Gambar 16. Ekstrak jahe merah Gambar 17. Ekstrak jahe merah ditimbang dan larutan CMC merah 2% 0,2 gram digerus hingga

homogen

4.7.2 Persiapan hewan coba

Hewan yang digunakan adalah kelinci jantan dengan berat 1,5-2 kg, umur 3-5 bulan, dibagi menjadi 3 kelompok pengamatan yaitu hari 1,3, dan 7. Setiap ekor diberi perlakuan bahan coba pada 4 gigi. Jumlah gigi yang dipakai sebanyak 36 gigi.

Hewan coba diadaptasi selama 1 minggu dan dipelihara dalam kandang (Gambar 18). Kandang hewan coba dibersihkan setiap hari dari kotoran dan sisa makanan agar tetap kering. Hewan coba diberi makan 2 kali sehari pukul 09.00 dan 16.00 WIB.

4.7.2.1 Perlakuan hewan coba

Kelinci dimasukkan ke dalam tempat pasungan kelinci (Gambar 19). Telinga kanan kelinci dibersihkan dengan alkohol 70%. Bulu pada telinga tangan kelinci yang berada di atas pembuluh darah vena (marginal ear vein) dicukur dengan gunting, kemudian dianastesi dengan spuit 1 ml secara intravena dengan ketamin (15 mg/kg) (Gambar 20).

Gambar 19. Kelinci dipasung Gambar 20. Anastesi intravena melalui pembuluh marginal ear vein

4.7.2.2 Perlakuan gigi hewan coba

 Preparasi gigi insisivus atas kanan kelinci pada sisi labial dengan menggunakan bur intan bulat kecil dengan kecepatan 35.000 rpm (Gambar 21) hingga mencapai ruang pulpa dan berdarah (Gambar 22).

 Setelah perforasi, kavitas diirigasi dengan spuit 5 ml saline dan dikeringan dengan cotton pellet steril (Gambar 23).

 Pada gigi insisivus atas kanan diaplikasikan ekstrak jahe merah 1% sebanyak 20μl (0,02ml) dengan menggunakan spuit 1 ml (Gambar 24).

 Letakkan cotton pellet, lalu tambal dengan RM-GIC (Gambar 25) kemudian disinar dengan light cure (Gambar 26).

 Preparasi gigi insisivus atas kiri kelinci pada sisi labial dengan menggunakan bur intan bulat kecil dengan kecepatan 35.000 rpm hingga mencapai ruang pulpa dan berdarah.

 Setelah perforasi, kavitas diirigasi dengan spuit 5 ml saline dan dikeringan dengan cotton pellet steril.

 Pada gigi insisivus atas kiri diaplikasikan ekstrak jahe merah 2% sebanyak 20μl (0,02ml) dengan menggunakan spuit 1 ml.

 Letakkan cotton pellet, lalu tambal dengan RM-GIC kemudian disinar dengan light cure.

 Preparasi gigi insisivus bawah kanan kelinci pada sisi labial dengan menggunakan bur intan bulat kecil dengan kecepatan 35.000 rpm hingga mencapai ruang pulpa dan berdarah.

 Setelah perforasi, kavitas diirigasi dengan spuit 5 ml saline dan dikeringan dengan cotton pellet steril.

 Pada gigi insisivus bawah kanan diaplikasikan eugenol sebanyak 20μl (0,02ml) dengan menggunakan spuit 1 ml.

 Letakkan cotton pellet, lalu tambal dengan RM-GIC kemudian disinar dengan light cure.

 Preparasi gigi insisivus bawah kiri kelinci pada sisi labial dengan menggunakan bur intan bulat kecil dengan kecepatan 35.000 rpm hingga mencapai ruang pulpa dan berdarah.

 Setelah perforasi, kavitas diirigasi dengan spuit 5 ml saline dan dikeringan dengan cotton pellet steril.

 Letakkan cotton pellet, lalu tambal dengan RM-GIC kemudian disinar dengan light cure.

 Total keseluruhan adalah 4 gigi insisivus tiap kelinci.

 Pada hari ke-1 setelah perlakuan terhadap 4 gigi insisivus setiap kelinci, kelinci didekapitasi dengan anastesi laten (Gambar 28). Kemudian rahang kelinci dipotong (Gambar 29) dan gigi-gigi pada rahang tersebut diekstraksi (Gambar 30), kemudian dimasukkan ke dalam botol eppendorf (Gambar 31). Kemudian diberikan ke laboratorium Patologi Anatomi untuk dilakukan pembuatan preparat histopatologi (Gambar 32).

 Pada hari ke-3, setelah perlakuan terhadap 4 gigi insisivus setiap kelinci, kelinci didekapitasi dengan anastesi laten. Kemudian rahang kelinci dipotong dan gigi-gigi pada rahang tersebut diekstraksi, kemudian dimasukkan ke dalam botol eppendorf. Kemudian diberikan ke laboratorium Patologi Anatomi untuk dilakukan pembuatan preparat histopatologi.

 Pada hari ke-7, setelah perlakuan terhadap 4 gigi insisivus setiap kelinci, kelinci didekapitasi dengan anastesi laten. Kemudian rahang kelinci dipotong dan gigi-gigi pada rahang tersebut diekstraksi, kemudian dimasukkan ke dalam botol eppendorf. Kemudian diberikan ke laboratorium Patologi Anatomi untuk dilakukan pembuatan preparat histopatologi.

Gambar 21. Pengeburan gigi kelinci Gambar 22. Perforasi gigi kelinci

Gambar 23. Pembersihan area kerja Gambar 24. Injeksi ekstrak jahe dengan spuit 5 ml merah 1%, 2%, dan eugenol pada I1 atas, I2 atas, dan I1 bawah

Gambar 25. Aplikasi RM-GIC Gambar 26. Penyinaran light cure

Gambar 27. 4 gigi insisivus yang Gambar 28. Pemberian anastesi telah ditambal laten

Gambar 29. Pengambilan rahang kelinci Gambar 30. Gigi yang telah

Gambar 31. Gigi yang dimasukkan Gambar 32. Preparat histopatologi gigi dalam botol eppendorf kelinci

4.7.3 Persiapan sampel untuk Hematoksilin-Eosin

Sesuai dengan SOP PA FK USU:

Jaringan gigi didekalsifikasi dengan larutan HCl selama 1-4 hari. Kemudian larutan diganti setiap hari. Cuci dengan air mengalir selama 24 jam. Kemudian dinetralkan dengan formalin 10%. Selanjutnya blok jaringan dilakukan penarikan air (dehydrating) dengan cara direndam dengan alkohol bertingkat mulai dari alkohol 80%-95%-95%-100%-100%-100% masing-masing selama 2 jam, kemudian dilakukan penjernihan (clearing) terhadap alkohol dengan merendam di dalam larutan xylol 2 kali perendaman (xylol 1- xylol 2) masing-masing selama 1,5 jam. Kemudian dilakukan pemasukan (infiltrasi) parafin ke dalam blok jaringan dengan merendamnya di dalam parafin cair 3 kali (parafin 1-2-3) masing-masing selama 2 jam. Setelah proses infiltrasi selesai dilanjutkan dengan penanaman (embedding) di dalam cetakan parafin blok untuk dilakukan pemotongan. Proses pemotongan (sectioning) blok jaringan dengan menggunakan pisau mikrotom setebal 5 -6 μm dan diletakkan pada kaca objek (object glass). Kaca objek yang berisikan parafin direndam di dalam larutan xylol masing-masing 2 kali, alkohol masing-masing 2 kali selama 1 menit, alkohol 95% masing-masing selama 1 menit, larutan iodin selama 10 menit, kemudian dicelupkan 4 kali dalam air mengalir, direndam di dalam larutan hematoksilin harris selama 15 menit, dicelupkan 4 kali dalam air mengalir,

dicelupkan 3-10 kali dalam asam alkohol, dibasuh kembali di air mengalir, direndam ke dalam larutan eosin selama 2 menit, direndam di dalam alkohol 95% masing- masing 2 kali selama 1 menit, direndam di dalam alkohol 100% masing-masing 2 kali selama 1 menit dan direndam di dalam xylol masing-masing 3 kali selama 2 menit dan dioleskan (mounting) dengan Canada Balsam dan terakhir ditutup dengan kaca penutup (cover glass).

4.7.3.1 Pengamatan sediaan Histopatologi

Pengamatan secara hispatologi dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x. Penilaian tersebut menggunakan kriteria berdasarkan penelitian terdahulu Soerono Akbar(1987)40 sebagai berikut :

 1 = normal = fibroblas

 2 = ringan = fibroblas, limfosit, neutrofil, sel plasma, makrofag meningkat.  3 = sedang = makrofag, neutrofil dominan.

 4 = berat = limfosit, sel plasma dominan.

4.8 Analisa Data

Data dianalisa secara non parametrik dengan menggunakan 2 uji statistik yaitu: 1. Analisis Uji Kruskal-Wallis Test (α= 0,05), untuk melihat ada tidaknya efek antiinflamasi ekstrak jahe merah 1%, ekstrak jahe merah 2%, dan eugenol pada hari ke-1, 3, dan 7.

2. Analisis Uji Mann-Whitney Test (α= 0,05), untuk melihat ada tidaknya perbedaan efek antiinflamasi antara ekstrak jahe merah 1% dan ekstrak jahe merah 2% terhadap eugenol.

Dalam dokumen Efek Antiinflamasi Ekstrak Jahe Merah (Zingiber officinalle roscoe) pada Gigi Kelinci (Oryctolagus cuniculus) (Penelitian In Vivo) (Halaman 40-57)