Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian berlangsung selama 6 bulan, mulai bulan Juli sampai Desember 2007 bertempat di Laboratorium Teknologi Bioindustri BPPT, Puspiptek Serpong, Tangerang dan Laboratorium Terpadu UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS) Shimadzu QP2010, seperangkat alat fermentasi, rotarievaporator Heidolph Laborota 400, alat distilasi, termometer, neraca analitik Ohaus EP-214, pH-meter Mettler Toledo Delta-320, autoclave Iwaki ACV-2450 dan Webeco, waterbath Thermo Haake DC-10, inkubator statis Memmert, spektrofotometer Hitachi U-2001, alat sentrifugasi CR-216 Himac, laminar air flow Babcock-BSH, Moisture analysis MB45 Ohaus dan peralatan gelas.
Bahan yang digunakan antara lain, mikroba spesies E. aerogenes AD-H43 (Said 2007), limbah biodiesel yang berasal dari Crude Palm Oil (CPO) (Rekayasa Desain dan Sistem Teknologi BPPT Serpong), ekstrak khamir (Scharlau 07-079), tripton (Oxoid), KH2PO4 (Univar), K2HPO4 (Univar), Gliserol (Univar), unsur makro: (NH4)2SO4 (Merck), MgSO4.7.H2O (Merck), NH4OH (Merck), CaCl2.2H2O (Merck), Co(NO3)2.6H2O (Merck), Fe(NH4)2SO4.6H2O (Merck), unsur mikro:
Na2SeO3 (Merck), NiCl2, MnCl2.4H2O (Merck), H3BO3 (Merck), AlK(SO4)
2.12H2O (Merck), CuCl2.2H2O (Merck), Na2EDTA.2H2O (Merck), asam nikotinat (Merck), NaOH (Merck), H2SO4 (Merck), alkohol 70%, gas nitrogen dan akuades.
Metode Penelitian
1. Purifikasi Limbah Biodiesel (Setyaningsih et al. 2007)
Purifikasi dilakukan dengan memanaskan 200 ml limbah biodiesel (sambil dihomogenkan dengan pengaduk magnet) sampai mencapai temperatur 40 oC, kemudian ditambahkan H2SO4 pekat sebanyak 5 ml dengan menggunakan pipet.
Campuran kemudian didinginkan selama 30 menit, lalu disaring menggunakan kertas saring sehingga dihasilkan gliserol hasil purifikasi yang berupa cairan
bening. Sampel sebelum dan setelah purifikasi kemudian dianalisis dengan GC-MS (kromatografi gas-spektrometri massa).
2. Pembuatan Medium Pertumbuhan (Rachman et al. 1997) a. Pembuatan Media Pertumbuhan Kultur Stok 50 ml
Pembuatan media pertumbuhan kultur stok 50 ml dilakukan dengan cara sebagai berikut. Sebanyak 0,25 g ekstrak khamir, 0,25 g tripton, 0,5 ml unsur makro, 0,5 ml unsur mikro dan akuades hingga volume total menjadi 37,5 ml dimasukkkan ke dalam erlenmeyer 100 ml dan dihomogenkan dengan pengaduk magnet, ditambahkan NaOH 1 M tetes per tetes hingga pH tepat menjadi 6,8.
Medium tersebut kemudian dipanaskan dalam waterbath (100 oC) selama 20 menit. Medium didinginkan menggunakan es dan dipindahkan ke botol serum, kemudian dialiri gas N2 selama 30 detik. Botol serum ditutup dan disegel kemudian disterilisasi (121 oC selama 15 menit) dengan autoclave. Gliserol 10%
sebanyak 2,5 ml dan bufer fosfat sebanyak 5 ml disterilisasi dengan autoklaf secara terpisah dan ditambahkan ke dalam botol serum setelah proses sterilisasi selesai dengan menggunakan jarum suntik dalam laminar air flow.
b. Pembuatan Media Pertumbuhan Pra Pra Kultur 35 ml
Pembuatan media pertumbuhan pra pra kultur 35 ml dilakukan dengan cara sebagai berikut. Sebanyak 0,175 g ekstrak khamir, 0,175 g tripton, 0,35 ml unsur makro, 0,35 ml unsur mikro dan akuades akuades sebanyak 25,55 ml ml dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 ml dan dihomogenkan dengan pengaduk magnet. Selanjutnya ditambahkan NaOH 1 M tetes per tetes hingga pH tepat menjadi 6,8. Medium tersebut kemudian dipanaskan dalam waterbath (100 oC) selama 20 menit. Medium didinginkan menggunakan es dan dipindahkan ke botol serum, kemudian dialiri gas N2 selama 30 detik. Botol serum ditutup dan disegel kemudian disterilisasi (121 oC selama 15 menit) dengan autoclave. Gliserol 10%
sebanyak 1,75 ml dan bufer fosfat sebanyak 3,5 ml disterilisasi dengan autoclave secara terpisah dan setelah proses sterilisasi selesai gliserol dan bufer fosfat ditambahkan ke dalam botol serum dengan menggunakan jarum suntik dalam laminar air flow, sehingga total volume medium pertumbuhan adalah 31,5 ml.
c. Pembuatan Media Pertumbuhan Pra Kultur 350 ml
Pembuatan media pertumbuhan pra kultur 350 ml dilakukan dengan cara sebagai berikut. Sebanyak 1,75 g ekstrak khamir, 1,75 g tripton, 3,5 ml unsur makro, 3,5 ml unsur mikro dan akuades akuades sebanyak 255,5 ml ml dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml dan dihomogenkan dengan pengaduk magnet. Selanjutnya ditambahkan NaOH 6 M tetes per tetes hingga pH tepat menjadi 6,8. Medium tersebut kemudian dipanaskan dalam waterbath (100 oC) selama 20 menit. Medium didinginkan menggunakan es, kemudian dialiri gas N2
selama 1 menit. Erlenmeyer 500 ml kemudian ditutup dengan kain kasa kemudian disterilisasi (121 oC selama 15 menit) dengan autoclave. Gliserol 10% sebanyak 17,5 ml dan bufer fosfat sebanyak 35 ml disterilisasi dengan autoclave secara terpisah dan setelah proses sterilisasi selesai gliserol dan bufer fosfat ditambahkan ke dalam erlenmeyer 500 ml dalam laminar air flow, sehingga total volume medium pertumbuhan adalah 315 ml.
d. Pembuatan Media Pertumbuhan Kultur Utama 3500 ml
Pembuatan media pertumbuhan kultur utama 3500 ml dilakukan dengan cara sebagai berikut. Sebanyak 175 g ekstrak khamir, 175 g tripton, 35 ml unsur makro, 35 ml unsur mikro dan akuades akuades sebanyak 2555 ml ml dimasukkan ke dalam erlenmeyer 5000 ml dan dihomogenkan dengan pengaduk magnet.
Selanjutnya ditambahkan NaOH 6 M tetes per tetes hingga pH tepat menjadi 6,8.
Medium tersebut selanjutnya dipanaskan dalam waterbath (100 oC) selama 20 menit kemudian didinginkan menggunakan es. Erlenmeyer 5000 ml ditutup dengan kain kasa kemudian disterilisasi (121 oC selama 15 menit) dengan autoclave. Gliserol hasil purifikasi sebanyak 175 ml dan bufer fosfat sebanyak 350 ml disterilisasi dengan autoclave secara terpisah dan kemudian ditambahkan ke dalam erlenmeyer 5000 ml. Selanjutnya erlenmeyer 5000 ml yang berisi 3150 ml medium dialiri gas N2 selama 3 menit.
3. Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Kurva pertumbuhan dibuat dengan mengambil 1 ml kultur mutan E. aerogenes AD-H43 yang disimpan pada -80 oC kemudian dimasukkan dalam
botol serum 125 ml yang telah berisi 50 ml media pertumbuhan. Kultur tersebut kemudian diinkubasi dalam inkubator statis pada suhu 37 oC. Penghitungan optical density (OD) dilakukan pada jam ke 0, 4, 8, 12, 16 dan ke 20 menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang (λ) = 680 nm (Rachman et al. 1997).
4. Pembuatan Kultur (Rachman et al. 1997) a. Pembuatan Kultur Stok 50 ml
Kultur stok 50 ml dibuat dengan mengambil 1 ml kultur mutan E. aerogenes AD-H43 yang disimpan pada -80 oC kemudian dimasukkan dalam botol serum 125 ml yang berisi 50 ml media pertumbuhan dengan menggunakan jarum suntik, kemudian diinkubasi dalam inkubator statis selama 8 jam pada temperatur 37 oC. Kultur kemudian disimpan dalam cool chamber dan diremajakan setiap 2 minggu sekali.
b. Pembuatan Pra Pra Kultur 35 ml
Pembuatan pra pra kultur 35 ml dilakukan dengan cara sebagai berikut.
Kultur stok 50 ml yang disimpan dalam cool chamber diambil sebanyak 3,5 ml kemudian dimasukkan dalam botol serum 125 ml yang berisi 31,5 ml media pertumbuhan dengan menggunakan jarum suntik, kemudian diinkubasi dalam inkubator statis selama 8 jam pada temperatur 37 oC. Pengukuran pH dan optical density (OD) dilakukan sebelum dan setelah inkubasi.
c. Pembuatan Pra Kultur 350 ml
Pembuatan pra pra kultur 350 ml dilakukan dengan cara sebagai berikut.
Pra kultur 35 ml yang disimpan dalam cool chamber dimasukkan dalam erlenmeyer 500 ml yang berisi 315 ml media pertumbuhan dalam laminar air flow, kemudian diinkubasi dalam inkubator statis selama 8 jam pada temperatur 37 oC. Pengukuran pH dan optical density (OD) dilakukan sebelum dan setelah inkubasi.
d.Pembuatan Kultur Utama (Main Culture) 3500 ml
Pra kultur 350 ml yang telah disimpan dalam inkubator selama 8 jam dalam inkubator statis kemudian dimasukkan dalam fermentor 6 liter (T=37 oC, 40 rpm) yang telah berisi 3150 ml media pertumbuhan. Pengukuran pH dan optical density (OD) dilakukan pada jam ke 0, 4, 8, 12, 16 dan ke 20.
5. Uji Kadar Senyawa yang Menguap di bawah Temperatur 105 oC dan 190 oC
Alat moisture analysis diatur untuk menguapkan sampel di bawah 105 oC, kemudian sampel sebanyak 3 g dimasukkan dalam tempat sampel. Alat kemudian dioperasikan selama 20 menit, dilakukan triplo. Hal yang sama dilakukan untuk uji senyawa yang menguap di bawah 190 oC, dengan mengatur alat moisture analysis untuk menguapkan sampel di bawah 190 oC, kemudian sampel sebanyak 3 g dimasukkan dalam tempat sampel. Alat kemudian dioperasikan selama 20 menit, dilakukan triplo
6. Separasi 1,3-propanadiol hasil fermentasi
a. Separasi 1,3-propanadiol hasil fermentasi dengan cara distilas pada tekanan udara normal
Larutan hasil fermentasi terlebih dahulu disentrifugasi (12.000 rpm) untuk menghilangkan sel-sel mikroba dan pengotor padatan. Selanjutnya filtrat hasil sentrifus dimasukkan dalam labu distilasi untuk mengambil fraksi di bawah 100
oC (etanol dan air) dipisah dengan cara distilasi (T=105 oC) sampai tidak ada sampel yang menetes. Kemudian distilasi dilanjutkan pada temperatur maksimum 190 oC. Distilasi dihentikan sampai tidak ada lagi sampel yang menetes. Distilasi diteruskan sampai temperatur dalam labu distilasi sebesar 215 oC dan dihentikan sampai tidak ada lagi sampel yang menetes. Setiap sampel yang diambil kemudian dianalisis dengan GC-MS.
b. Separasi 1,3-propanadiol hasil fermentasi dengan cara distilasi vakum menggunakan alat rotari evaporator.
Larutan hasil fermentasi terlebih dahulu disentrifugasi untuk menghilangkan sel-sel mikroba dan pengotor padatan. Kemudian filtrat dievaporasi (T=40 oC dan P=3,9 mmHg) dalam Rotovap Buchi sampai volume
tersisa hanya 5% dari volume awal. Kemudian larutan disaring untuk memisahkannya dari padatan. Larutan sebelum dan setelah evaporasi dianalisis dengan GC-MS.
7. Analisis GC-MS
Analisis GC-MS dilakukan pada limbah biodiesel tanpa purifikasi dan setelah purifikasi. Analisis GC-MS juga dilakukan pada hasil fermentasi sebelum separasi dan setelah separasi dengan menggunakan distilasi dan rotari evaporator.
Analisis GC-MS dilakukan dengan menggunakan GC-MS QP2010 Shimadzu dengan automatic sampling system yang mampu menganalisis 50 scans perdetik. Kolom yang digunakan Rtx®-1MS (Fused Silica) dengan bahan pengisi 100% dimethyl polysiloxane, yang mampu menganalisis senyawa essential oils, hydrocarbons, semivolatiles dan pesticides. Metode pengaturan alat pada GC-MS dapat dilihat pada Lampiran 5.
Analisis GC-MS dilakukan dengan menggunakan pelarut akuades dengan gas pembawa helium dengan kondisi pengaturan temperatur pada alat GC-MS (Colom, Injection, Ion Source dan Interface).
Spektrum massanya dibandingkan dengan data base National Institute Standar and Tecnology (NIST) yaitu NIST 27 dan NIST 147 serta data base WILEY 7 yang memiliki 338.000 spektra (Lampiran 16).
8. Analisis HPLC
Analisis kuantitatif limbah biodiesel hasil purifikasi menggunakan alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) Shimadzu LC-20 Prominence dengan menggunakan kolom Phenomenex Rezex ROA-Organik Acid, pelarut yang digunakan adalah 5 mN H2SO4 dengan laju alir 0,6 ml/menit, temperatur kolom 60 0C, volume injeksi 25 µl. Detektor yang digunakan adalah RI-Detektor (35
0C). Waktu analisis selama 30 menit dengan menggunakan standar internal dengan konsentrasi sebesar 5% Pentanadiol (v/v).