Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan mulai bulan November 2010 sampai Juli 2011 di Laboratorium Kimia, Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (LPPM) Institut Pertanian Bogor, serta Laboratorium Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong.
Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah buah andaliman yang berasal dari Sumatera Utara (Medan). Bahan kimia yang dibutuhkan adalah pereaksi uji fitokimia, berbagai jenis pelarut organik teknis dan proanalis yang biasa digunakan seperti: n-heksana etanol, metanol, kloroform, etilasetat, akuades. enzim α-glukosidase, p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (PNG), tablet akarbosa (Glukobay), DPPH (1,1- diphenyl 2-ficrylhydrazyl), pereaksi ABTS (Asam
2,2-Azinobis (3-etilbenzatiazolin -6-sulfonat ) (Sigma), Folin Ciocalteu, asam galat,
silika gel 60 (70-230 mesh) untuk kromatografi kolom, dan kertas Whatman 42. Alat yang digunakan adalah freeze drier, penggojong, rotavapor, Spektropotometer UV-Vis (Shimadzu model UV-160), Microplate reader, Pelat kromatografi lapis tipis (KLT), pelat kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP), silica gel 60 GF254 ukuran 20 X 20 cm tabung reaksi, kolom ukuran; panjang 62 cm, diameter 2,5 cm, pipet mikro, spektroskopi Infrared (IR), vorteks, dan alat- alat gelas untuk keperluan analisis.
Metode Penelitian Persiapan Sampel
Persiapan sampel dimulai dengan mencuci buah segar andaliman dengan air kran sebanyak dua kali, kemudian dikeringanginkan selama satu malam. Untuk mencegah terjadinya perubahan kimia, pengeringan dilanjutkan dalam oven pada suhu 40-60 oC. Setelah buah andaliman benar-benar kering yang ditandai dengan
warna hitam lalu dihaluskan sampai ukuran 80 mesh. Serbuk buah andaliman siap digunakan untuk analisis selanjutnya.
Penentuan Kadar Air (AOAC 2006)
Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 oC selama 30 menit. Kemudian cawan didinginkan dalam eksikator. Sebanyak 3 g serbuk buah andaliman dimasukkan ke dalam cawan porselin dan dipanaskan dalam oven pada suhu 105
o
C selama 3 jam, kemudian, cawan diangkat dan didinginkan dalam eksikator selama 30 menit. Cawan dengan serbuk sampel ditimbang hingga bobot konstan.
Penentuan Kadar Abu
Cawan porselin dikeringkan pada temperatur 600 oC selama 30 menit dan didinginkan dalam eksikator, kemudian ditimbang bobotnya. Sebanyak 2 g sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan porselin. Cawan dan isinya dipanaskan dengan nyala bunsen sampai tidak berasap lagi. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam tanur listrik dengan temperatur 600 oC sampai contoh benar-benar menjadi abu (kira-kira 30 menit). Setelah didinginkan dalam eksikator, lalu cawan ditimbang. Hal ini dilakukan sebanyak tiga kali ulangan (triplo). Kadar abu dapat dihitung dengan rumus:
Kadar abu = a b
Keterangan: a = bobot abu b =bobot contoh
Ekstraksi Buah Andaliman
Ekstraksi yang dilakukan merujuk pada ekstraksi yang dilakukan Parhusip (2006) dan Yamazaki et al. (2007), yaitu ekstraksi dengan cara bertingkat. Sebanyak 951,15 g sampel serbuk kering dimaserasi dengan masing-masing 4 L pelarut non polar (n-heksana) untuk menghilangkan lipid dan memisahkan ekstrak non polar yang terkandung dalam andaliman. Ampas kering dari hasil penyaringan maserasi dengan pelarut n-heksana, dengan cara yang sama dimaserasi kembali dengan pelarut etilasetat untuk memperoleh ekstrak semipolar,
masing-masing dilakukan sampai 3 kali ulangan. Kemudian dilanjutkan maserasi dengan pelarut polar (metanol) dan air. Ekstrak hasil ekstraksi kemudian dilanjutkan dengan epavorasi. Selanjutnya ekstrak yang sudah dievaporasi dihitung rendemennya, diuji fitokimia, dan diuji aktivitas (antioksidan & inhibitor enzim α-glukosidase).
Analisis Kualitatif Total Fenol
Sebanyak 0,025 g ekstrak dilarutkan dengan 2 mL etanol dalam tabung reaksi dan ditambah 0,5 mL aquades 1 mL pereaksi Folin-Ciocalteu (50 %). Kemudian campuran ini divorteks selama 3 menit, kemudian ke dalam tabung ditambahkan 1 mL larutan Na2CO3 5%. Selanjutnya campuran disimpan di tempat yang gelap selama 30 menit. Absorbansi ekstrak diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum ( max). Hasilnya dinyatakan sebagai mg asam galat/100 g ekstrak. Larutan asam galat digunakan sebagai zat untuk membuat kurva kalibrasi.
Uji Fitokimia (Harborne 1987)
Uji flavonoid. Sebanyak 0,1 g ekstrak/serbuk andaliman ditambahkan 10 mL air panas kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 10 mL filtrat ditambahkan 0,5 g serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol. Campuran dikocok kuat-kuat. Uji positif ditandai dengan munculnya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol.
Uji triterpenoid dan steroid. Uji ini menggunakan pereaksi Lieberman-Buchard. Pada pengujian ini, sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak andaliman dilarutkan dengan 25 mL etanol (50 ºC), disaring dan residu ditambahkan eter. Filtrat ditambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat secara berurutan. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu untuk triterpenoid serta hijau atau biru untuk steroid.
Uji alkaloid. Sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak dilarutkan dengan 10 mL kloroform dan beberapa tetes NH4OH dan disaring ke dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan penambahan 10
tetes H2SO4 2 M kemudian lapisan asamnya dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada pelat tetes dan ditambahkan pereaksi Meyer, Wagner, dan Dragendorf yang akan menimbulkan endapan warna berturut-turut putih, cokelat, dan merah jingga.
Uji saponin. Sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak andaliman ditambahkan ke dalam 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat dikocok dalam tabung reaksi tertutup selama 10 detik, kemudian dibiarkan selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih stabil.
Uji tanin. Sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak andaliman ditambahkan ke dalam 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat ditambahkan dengan 10 mL FeCl3 1%. Uji positif ditandai munculnya warna hijau kehitaman.
Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH dan ABTS
Larutan sampel disiapkan dengan beberapa konsentrasi 500, 400, 300, 200, 100, 50, dan 25 ppm. Kemudian 100 L larutan DPPH (0,0118 g dalam 100 mL etanol) (Batubara et al. 2009) dan ABTS (ABTS dalam K2SO4) (Rohim et al.
2008) ditambahkan pada masing-masing sumur mikro untuk metode DPPH dan ABTS. Setelah diinkubasi selama 30 menit absorbansi diukur pada panjang gelombang 517 nm untuk metode DPPH dan 414 nm untuk metode ABTS. Kontrol positif yang digunakan adalah troloksdalam etanol.
Persen inhibisi antioksidan metode DPPH dan metode ABTS dihitung dengan rumus berikut:
% Inhibisi Absorban blanko Absorban sampelAbsorbansi blanko X %
Ablanko adalah absorbansi campuran etanol dan pereaksi (DPPH dan ABTS).
Setiap konsentrasi sampel dan kontrol positif (Troloks) diuji tiga kali pengulangan.
Uji Aktivitas Inhibitor α-Glukosidase (Suarsana et al 2008)
Sampel yang diuji dilarutkan dalam pelarut dimetil sulfoksida (DMSO) dengan konsentrasi 0,26; 0,13; 0,065; 0,0325; 0,01625; dan 0,00813 % (b/v). Sebanyak 1,0 mg α-glukosidase dilarutkan dalam 1 mL bufer fosfat 100 mM (pH
7,0) kemudian ditambahkan 200 mg SBA yang telah dilarutkan dalam bufer fosfat 100 mM (pH 7,0). Sebelum digunakan, 1 mL larutan enzim tersebut diencerkan 25 kali dengan bufer fosfat 100 mM (pH 7,0). Campuran reaksi terdiri atas 25 µL PNG 20 mM sebagai substrat, 50 µL larutan bufer fosfat 100 mM (pH 7,0), dan 50 µL larutan sampel dalam DMSO. Campuran reaksi diinkubasi selama 15 menit dan ditambahkan 25 µL larutan α-glukosidase, kemudian diinkubasi selama 15 menit. Reaksi enzim dihentikan dengan penambahan 1000 µL Na2CO3 dan p -nitrofenol yang dihasilkan dibaca absorbannya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm. Tablet akarbosa (Glukobay) dilarutkan dalam bufer dan HCl 2N (1:1) dengan konsentrasi 6; 3; 1,5; 0,75; 0,375; 0,188; 0,094 % b/v sebagai kontrol positif. Absorbansi hasil reaksi tersebut diukur dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm. Pengukuran absorbans sampel dan kontrol positif dilakukan dengan dua kali ulangan (duplo). Data kontrol positif digunakan sebagai pembanding terhadap sampel yang diuji. Persentasi inhibisi dapat dihitung dengan rumus:
% inhibisi K SK X %
S = S1 – S0
% inhibisi K SK S
Keterangan:
K = Absorban kontrol (DMSO) tanpa sampel (kontrol blanko/kontrol negatif) S1 = Absorban sampel dengan penambahan enzim.
S0 = Absorban sampel tanpa penambahan enzim.
Penentuan Eluen Terbaik
Ekstrak pekat buah andaliman dilarutkan dalam pelarut asal yang sesuai dan ditotolkan pada pelat KLT. Setelah kering langsung dielusi dalam bejana yang telah dijenuhkan oleh uap eluen pengembang. Elusi pengembang dimulai dengan menggunakan pelarut tunggal (n-heksana, etilasetat, kloroform, asam asetat, etanol, metanol). kemudian dilanjutkan dengan perbandingan beberapa eluen tunggal terbaik. Noda hasil elusi diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm.
Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)
Fraksinasi adalah proses pemisahan komponen dalam suatu ekstrak menjadi kelompok-kelompok senyawa yang memiliki kemiripan karakteristik secara kimia (Rouessac dan Rouessac 2007). Kromatografi kolom dan KLTP merupakan teknik analisis dalam penentuan jumlah komponen senyawa tertentu dari campurannya. kromatografi bertujuan untuk mengetahui komponen-komponen senyawa aktif kimia yang dapat terpisah (Hayani 2007). Dalam pemisahan dengan kromatografi kolom ini, suatu pengelusi dialirkan secara terus menerus melalui kolom. Komponen-komponen (eluat) yang keluar dari kolom ditampung kedalam tabung reaksi dengan volume masing-masing sebanyak 5 mL dan digabung berdasarkan pola spot atau nilai Rf dari setiap tabung yang diuji dengan KLT untuk menentukan jumlah fraksi yang terbentuk. Untuk memperoleh senyawa yang lebih murni, selanjutnya dapat dilakukan dengan KLTP. Kromatografi lapis tipis preparatif merupakan kromatografi preparatif yang dapat digunakan untuk memurnikan komponen yang diperoleh dari pemisahan dengan kromatografi kolom. Kelebihan KLTP adalah merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sedikit baik penyerap maupun cuplikannya, kemudian dapat digunakan untuk mencari eluen terbaik untuk kromatografi kolom.
Identifikasi Senyawa (harborne 1987)
Identifikasi senyawa menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan IR. Spektrofotometer UV-Vis digunakan untuk mengukur spektrum serapan senyawa dalam sampel pada panjang gelombang 200 – 400 nm. Identifikasi dengan menggunakan IR dilakukan dengan cara menghaluskan sampel bersamaan dengan serbuk KBr dalam mortar agat. Setelah dihaluskan dan bercampur, kemudian serbuk ini dimasukkan ke dalam alat pencetak pelat KBr, sehingga diperoleh serbuk lempeng yang transparan. Lempeng yang diperoleh dimasukkan kedalam spektrofotometer IR untuk dilakukan analisis spektrum FTIR.