FLAVONOID BUAH ANDALIMAN (
Zanthoxylum
acanthopodium
DC) SEBAGAI ANTIOKSIDAN DAN
INHIBITOR
α
-GLUKOSIDASE
SOFYAN GULTOM
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Flavonoid Buah Andaliman
(Zanthoxylum acantopodium DC.) sebagai Antioksidan dan Inhibitor α
-glukosidase adalah karya saya dengan arahan dari Komisi Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, 02 Agustus 2011
Sofyan Gultom
SOFYAN GULTOM. Flavonoid of Zanthoxylum achanthopodium Fruit as an Antioxidant and α-Glucosidase Inhibitors. Under direction of IRMA HERAWATI SUPARTO and IRMANIDA BATUBARA.
Diabetes Mellitus could be caused by the presence of free radicals which damaged the pancreas cell membrane. Previous research showed that extract of andaliman (Zanthoxylum acantophodium DC.) fruit possessed activity as antioxidant. However, there has been no scientific report concerning its activities as antidiabetic. The main objective of this research was to evaluate the in vitro mechanism of Z. acantophodium fruit extract as antioxidant and α-glucosidase inhibitor. Andaliman macerated by four solvents, namely n-hexane, ethyl acetate, methanol and water, as solvent for extraction. Antioxidant activity was measured
by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2-azinobis -3- ethylbenzathiazolin
-6-sulfonic acid (ABTS) method, and inhibition of enzyme α-glucosidase using
substrate p-nitrofeyl-α-D-glucopyranoside. Results of this research showed that methanol extract had the highest activities, both as antioxidant and α-glucosidase inhibitor. This extract was separated by column chromatography yielded six fractions (A-F). The most active fraction as α-glucosidase inhibitor was fraction C and for antioxidant was fraction E. These two fractions were further separated using preparative thin layer chromatography. The best antioxidants with DPPH method was fraction E2 (IC50 137.46 ppm), for ABTS method was crude
methanol extract (IC50 30.04 ppm), while for α-glucosidase inhibitors was the
fraction C (IC50 16 ppm). Based on the results of data analysis by Infrared and
UV-Vis, showed that the main active compound contained in fraction C2 and E2 were the of aurones and flavanones of flavanoid group.
RINGKASAN
SOFYAN GULTOM. Flavonoid Buah Andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium DC) sebagai Antioksidan dan Inhibitor Enzim α-glukosidase.
Dibimbing oleh IRMA HERAWATI SUPARTO dan IRMANIDA BATUBARA. Diabetes Melitus (DM) merupakan penyakit berbahaya yang ditandai dengan hiperglikemia, yaitu meningkatnya kadar gula darah hingga melebihi normal (80-120 mg/dl). Hiperglikemia umumnya disebabkan oleh rusaknya sel pankreas sehingga kerja insulin tidak bisa berfungsi dengan maksimal. Di dalam tubuh terdapat enzim α-glukosidase yang berfungsi untuk menghidrolisis karbohidrat menjadi gula sederhana (glukosa) pada usus. Pada intinya, penyakit ini disebabkan rusaknya sel dan kadar gula yang berlebih, oleh karena itu asupan antioksidan dan hambatan kerja enzim α-glukosidase merupakan solusi yang tepat untuk mengatasi penyakit ini, karena antioksidan akan mereduksi radikal bebas sebagai pemicu rusaknya sel-sel dalam tubuh, begitu juga dengan menghambat kerja enzim α-glukosidase akan memperkecil produksi glukosa pada usus.
Flavonoid adalah salah satu senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan dan obat antidiabetes. Senyawa flavonoid telah banyak diisolasi dari bahan alam. Buah andaliman salah satu tanaman yang mengandung senyawa tersebut. Secara ilmiah buah andaliman mengandung senyawa bioaktif yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan dan antibakteri. Berdasarkan data ilmiah tersebut perlu dikaji lebih lanjut mengenai mekanisme buah andaliman sebagai antihiperglikemia, apakah karena sifat antioksidasinya atau sebagai inhibitor α-glukosidase, yaitu enzim yang berperan dalam penyerapan glukosa di usus sehingga kadar glukosa di dalam darah dapat diturunkan.
Penelitian ini dilakukan untuk menguji aktivitas antioksidan senyawa flavonoid buah andaliman dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrihydrazyl), dan ABTS (Asam 2,2-azinobis-3-etilbenzatiazolin-6-sulfonat) dan menguji aktivitas inhibitor enzim α-glukosidase. Sampel yang di uji terdiri atas: ekstrak buah andaliman dengan pelarut n-heksana, etilasetat, metanol, dan air, fraksi dari hasil pemisahan dengan kolom dan fraksi dari hasil pemisahan dengan Kromatograpi Lapis Tipis Preparatif (KLTP). Fraksi teraktif dari hasil pemisahan dengan KLTP dianalisis dengan UV-Vis (Ultraviolet-visible) dan Infrared (IR). Hasil penelitian ini menunjukkan, ekstrak yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan adalah ekstrak etilasetat, metanol dan air, sedangkan sebagai inhibitor α-glukosidase ekstrak yang aktif adalah ekstrak etilasetat dan metanol. Berdasarkan nilai IC50, ekstrak metanol memiliki aktivitas paling tinggi sebagai
antioksidan dan sebagai inhibitor α-glukosidase IC50 sebagai berikut; antioksidan
390,92 ppm (metode DPPH), 30,04 ppm (metode ABTS), dan 323 ppm untuk inhibitor α-glukosidase. Dari proses fraksinasi dengan kromatografi kolom diperoleh enam fraksi (A-F), setelah diuji aktivitas, fraksi C memiliki aktivitas tertinggi sebagai inhibitor α-glukosidase dengan nilai IC50= 16 ppm dan fraksi E
sebagai antioksidan dengan nilai IC50 444,77 ppm (DPPH), dan 181,79 ppm
dan E2 adalah fraksi yang paling baik sebagai antioksidan dengan masing-masing nilai IC50 sebesar 137,46 ppm (DPPH), dan 74,02 ppm (ABTS). Berdasarkan data
yang diperoleh hasil identifikasi UV-Vis dan IR, diduga senyawa aktif utama yang terkandung dalam fraksi C2 dan E2 yang berpotensi sebagai inhibitor α -glukosidase dan antioksidan adalah senyawa flavonoid golongan auron dan flavanon.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
FLAVONOID BUAH ANDALIMAN (
Zanthoxylum
acanthopodium
DC) SEBAGAI ANTIOKSIDAN DAN
INHIBITOR
α
-GLUKOSIDASE
SOFYAN GULTOM
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan karunia Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan dengan baik. Tak lupa penulis panjatkan shalawat beriring salam bagi teladan Nabi Muhammad SAW. Karya ilmiah ini berjudul Flavonoid Buah Andaliman (Zanthoxylum
acantopodium DC) Sebagai Antioksidan dan Inhibitor α-Glukosidase disusun
berdasarkan penelitian yang dilaksanakan mulai bulan Nopember 2010 hingga Juli 2011 di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, dan Laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor (IPB).
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. dr. Irma herawati Suparto, MS dan Dr. Irmanida Batubara, SSi, MSi yang telah memberikan bimbingan dan saran selama pelaksanaan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Kepada Direktur Jendral Departemen Agama, saya ucapkan terima kasih banyak yang telah mendanai penulis selama studi. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada orang tua, adik, abang yang telah memberi dukungan materi, non materi, dan do’a kepada penulis dalam penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada teman-teman seperjuangan mahasiswa Pascasarjana Kimia angkatan 2009 yang selalu memberikan motivasi selama menjalani studi dan penelitian, dan pak Eman, ibu Nunung selaku staf Laboratorium Kimia Analitik FMIPA IPB, serta Mbak Salina, mbak Nunuk, Mas Endi, Mas Nio selaku staf laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB atas semua kerjasamanya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2011
Penulis dilahirkan di Tarutung pada tanggal 10 Desember 1976 dari ayah H. Ibrahim Gultom dan ibu Nurlela Munthe. Penulis merupakan anak keenam dari tujuh bersaudara. Tahun 1996, penulis terdaftar sebagai mahasiswa pada program sarjana, Jurusan kimia, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan alam Institut Keguruan dan Ilmu Pendidikan (IKIP) Medan (sekarang Universitas Negeri Medan) dan menamatkannya pada tahun 2001. Penulis bekerja sebagi guru bidang studi kimia di Madrasah Aliyah Negeri (MAN) Binanga, Kecamatan Barumun Tengah, Kabupaten Padang Lawas, Propinsi Sumatera Utara mulai tahun 2004. Kesempatan untuk melanjutkan program pascasarjana S2 pada program studi yang sama diperoleh pada tahun 2009.
Halaman
DAFTAR TABEL ... xii
DAFTAR GAMBAR ... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiv
PENDAHULUAN ... 1
Tujuan Penelitian ... 2
Manfaat Penelitian ... 2
Hipotesis ... 2
TINJAUAN PUSTAKA ... 3
Diabetes Melitus ... 3
Aktivitas Inhibitor α-Glukosidase ... 3
Senyawa Antioksidan ... 4
Metode Uji Aktivitas Antioksidan ... 5
Flavonoid ... 7
Andaliman ... 8
METODOLOGI PENELITIAN ... 11
Waktu dan Tempat ... 11
Bahan dan Alat ... 11
Metode Penelitian ... 11
Preparasi Sampel ... 11
Penentuan Kadar Air ... 12
Penentuan Kadar Abu ... 12
Ekstraksi Buah Andaliman ... 12
Analisis Kualitatif Total Fenol ... 13
Uji Fitokimia ... 13
Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH dadn ABTS ... 14
Uji Aktivitas Inhibitor α-Glukosidase ... 14
Penentuan Eluen Terbaik ... 15
Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) ... 16
Identifikasi Senyawa ... 16
HASIL DAN PEMBAHASAN ... 17
Persiapan dan Ekstraksi Sampel ... 17
Uji Aktivitas dan Pemilihan Ekstrak Terbaik ... 17
Pencarian Eluen Terbaik ... 19
Fraksinasi Ekstrak Teraktif ... 20
Pemilihan Fraksi Terbaik Hasil Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom ... 21
Identifikasi dan Pendugaan Senyawa Aktif ... 25
SIMPULAN DAN SARAN ... 29
DAFTAR PUSTAKA ... 31
Halaman
1 Hasil uji fitokimia ekstrak kasar buah andaliman ... 18 2 Uji total fenol, dan IC50 aktivitas ekstrak kasar andaliman ... 18
3 Data IC50 aktivitas fraksi hasil fraksinasi dengan kromatografi
kolom ... 22 4 Uji fitokimia dan IC50 aktivitas ekstrak fraksi hasil kromatografi
kolom ... 23 5 Nilai IC50 aktivitas untuk fraksi hasil fraksinasi dengan
kromatograpi lapis tipis preparatif (KLTP) ... 24 6 Serapan infra merah gugus fungsi fraksi C2 dan E2 ... 27 7 Nilai panjang gelombang maksimum senyawa dalam fraksi
Halaman
1 Struktur troloks ... 5
2 Reaksi antara DPPH• dan antioksidan dalam pembentukan DPPH .. 5
3 Reaksi pembentukan radikal bebas stabil ABTS ... 6
4 Konfigurasi C6-C3-C6 kerangka dasar flavonoid ... 7
5 Daun dan buah andaliman ... 8
6 Profil eluen terbaik dengan pelarut tunggal ... 20
7 Profil eluen terbaik dengan perbandingan cloroform dan metanol ... 20
8 Profil KLT fraksi hasil fraksinasi dengan kolom ... 21
9 Profil spot fraksi hasil fraksinasi dengan KLTP ... 23
Halaman
1 Diagram alir penelitian ... 34
2 Determinasi tanaman andaliman ... 36
3 Penentuan rendemen ekstrak kasar ... 37
4 Penentuan total fenol ... 38
5 Perhitungan IC50 ekstrak kasar buah andaliman untuk uji aktivitas antioksidan dan inhibitor α-glukosidase ... 39
6 Nilai Rf setiap tabung hasil fraksinasi ekstrak metanol dengan kolom ... 41
7 Nilai Rf dan penentuan rendemen setiap fraksi dari hasil penggabungan setiap tabung dari fraksinasi dengan kromatografi kolom ... 42
8 Contoh perhitungan IC50 fraksi hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom ... 43
9 Nilai rendemen dan Rf fraksi hasil fraksinasi dengan kromatografi lapis preparatif ... 45
Diabetes Melitus (DM) adalah penyakit metabolit yang ditandai dengan hiperglikemia, yaitu meningkatnya kadar gula darah yang melebihi kadar normal (80-120 mg/dl), umumnya disebabkan oleh malfungsi sekresi insulin atau kerja insulin yang tidak memadai (Lee 2007). Penderita DM di Indonesia menempati urutan keempat setelah Amerika Serikat, India, dan Cina (Mistra 2004). Oleh karena itu, diperlukan suatu penanganan dan cara pengobatan yang efektif tanpa menimbulkan efek samping yang besar. Salah satu alternatif pendekatan yang dapat dilakukan adalah mencegah hidrolisis karbohidrat menjadi gula sederhana (glukosa) pada usus dengan cara menghambat enzim α-glukosidase, sehingga menghambat peningkatan gula darah pascamakan (postprandial) dan menghambat terjadinya pembentukan radikal bebas dengan antioksidan (Alfarabi 2010). Antioksidan adalah suatu senyawa yang dalam konsentrasi rendah dibandingkan dengan substrat yang dapat teroksidasi, secara signifikan atau mencegah radikal bebas dan menghambat reaksi oksidasi substrat yang dipicu oleh oksigen atau peroksida. Kebanyakan tumbuhan yang mengandung senyawa bioaktif seperti glikosida, alkaloid, terpenoid, dan flavonoid mempunyai aktivitas sebagai antioksidan dan antidiabetes (Suarsana et al. 2008).
Buah andaliman merupakan salah satu jenis rempah yang belum banyak dikenal oleh masyarakat Indonesia. Penelitian mengenai buah tersebut masih sangat terbatas sehingga tidak banyak publikasi atau data ilmiah yang dapat diperoleh (Wijaya 1999). Dari uji fitokimia yang dilakukan oleh Tensiska et al.
(2001), buah andaliman positif mengandung senyawa flavonoid dan polifenol yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan melalui uji antioksidan dengan metode ransimat. Flavonoid juga dilaporkan memiliki aktivitas penghambat terhadap enzimα-glukosidase seperti pada ekstrak metanol tempe (Suarsana et al.
2008). Aktivitas penghambat enzimα-glukosidasedan antioksidan adalah dua hal yang berpengaruh terhadap penyakit diabetes mellitus.
untuk diteliti. Identifikasi komponen aktifnya juga perlu dilakukan dengan spektrofotometer ultraviolet-visible (UV-Vis) dan inframerah (IR).
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini untuk mengidentifikasi senyawa flavonoid buah andaliman sebagai antioksidan dengan metode 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH) dan asam 2,2-azinobis-3-etilbenzatiazolin-6-sulfonat (ABTS), serta aktivitasnya sebagai inhibitor enzim α-glukosidase secara in vitro.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang potensi senyawa flavonoid buah andaliman sebagai antioksidan dan inhibitor α -glukosidase, serta dapat digunakan sebagai salah satu alternatif untuk pengobatan diabetes.
Hipotesis
TINJAUAN PUSTAKA
Diabetes Melitus
Diabetes Melitus salah satu penyakit komplikasi yang sangat berbahaya. Komplikasi yang dapat disebabkan penyakit ini adalah penyakit jantung, koroner, stroke, kebutaan, gagal ginjal, neuropatik, dan luka yang sulit sembuh sampai mengalami pembusukan. Umumnya penyakit ini disebabkan oleh malfungsi sekresi insulin atau kerja insulin yang tidak memadai (resistensi insulin). Hiperglikemia kronis pada penderita diabetes biasanya berhubungan dengan disfungsi/kerusakan sel-sel beta pankreas. Salah satu penyebab kerusakan sel-sel beta pankreas adalah radikal bebas atau infeksi virus (Suarsana et al. 2008).
Menurut Suyono (2002), fungsi organ pankreas ialah sebagai penghasil hormon insulin. Penyakit DM dibagi menjadi dua tipe, yaitu tipe 1 dan tipe 2. Penyakit DM tipe 1 bergantung pada insulin, peningkatan kadar glukosa darah akibat kurangnya kelenjar pankreas mensekresikan hormon insulin. Hormon insulin yang dihasilkan tidak mencukupi untuk mengubah glukosa darah menjadi glukosa intraseluler. Hal ini disebabkan karena sebagian besar sel beta pankreas yang memproduksi insulin mengalami kerusakan sehingga kadar insulin menjadi kurang dan tidak ada. Penyakit DM tipe 2 tidak bergantung pada insulin, jumlah insulin normal bahkan melebihi jumlah batas normal, tetapi jumlah reseptor insulin yang terdapat pada permukaan sel kurang sehingga glukosa ke dalam sel terhambat. Keadaan ini akan menyebabkan meningkatnya kadar glukosa darah dan menurunnya kadar glukosa intraseluler. Penyakit ini disebabkan oleh obesitas, diet tinggi lemak, karbohidrat, dan kurang gerak badan sehingga tidak dapat memproduksi insulin yang menyebabkan kadar gula darahnya naik.
Aktivitas Inhibitor Enzim α-Glukosidase
Enzim ini terlibat dalam degradasi glikogen dengan mengkatalisis hidrolisis residu glukosa yang berikatan α-1,4 pada berbagai substrat dan dihasilkan α -D-glukosa. Enzim α-glukosidase menghidrolisis ikatan α-glukosidik pada oligosakarida dan α-D-glikosida. Enzim tersebut merupakan katalis pada langkah akhir pemecahan karbohidrat (Sou 2000). Inhibitor α-glukosidase menjadi obat umum yang sering digunakan untuk mengontrol postprandial hiperglikemia sejak diperkenalkan tahun 1990-an. Salah satu obat sintetiknya adalah akarbosa yang dapat mengurangi kadar gula dengan mengintervensi penyerapan sari pati dalam usus. Namun, kelemahan penggunaan obat sintetik ini yait dapat menyebabkan efek samping, misalnya kembung, diare, dan kram usus. Oleh karena itu, perlu diteliti peran dari bahan alam yang memiliki potensi tinggi sebagai penghambat aktivitas α-glukosidase dengan efek samping yang minimal seperti Saurhus
chinensis, Commelina communis L, dan bunga Punica grantum (Lee 2007).
Alfarabi (2010) melaporkan senyawa aktif dari daun sirih merah (Piper crocatum) dapat berpotensi sebagai antioksidan dan penghambat enzim α-glukosidase.
Senyawa Antioksidan
Berdasarkan fungsinya, antioksidan dikelompokkan menjadi antioksidan primer dan antioksidan sekunder. Antioksidan primer (antioksidan pemecah rantai), yaitu antioksidan yang dapat bereaksi dengan radikal lipid lalu mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil, suatu molekul antioksidan disebut antioksidan primer (AH), apabila dapat mendonorkan atom hidrogennya secara cepat ke radikal lipid (RO•) dan radikal turunan antioksidan tersebut (A•) lebih stabil dibanding radikal lipid, atau mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil. Antioksidan sekunder (antioksidan pencegah) didefinisikan sebagai suatu senyawa yang dapat memperlambat laju reaksi autooksidasi lipid. Antioksidan ini bekerja dengan berbagai mekanisme, seperti mengikat ion logam, menangkap oksigen, memecah hidroperoksida ke bentuk-bentuk non radikal, menyerap radiasi ultra violet atau mendeaktifkan singlet oksigen (Gordon 1990).
Troloks
6-
hidroksil-2,5,7,8- tetrametilkroman-2-asam karboksilat (Gambar 1). Berdasarkan metode ransimat troloks memiliki indeks kapasitas antioksidasi, yaitu empat. Senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan dapat dinyatakan sebagai Troloks
Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) konsentrasi troloks yang memiliki
kapasitas antioksidan ekivalen dengan sampel yang dianalisis (Apac et al. 2004).
Gambar 1 Struktur troloks.
Metode Uji Aktivitas Antioksidan
Aktivitas antioksidan dapat ditentukan dengan beberapa metode seperti metode penangkapan radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), dan ABTS (asam 2,2-Azinobis-3-etilbenzatiazolin-6-sulfonat).
Metode DPPH
Metode ini menggunakan DPPH sebagai model radikal bebas, Senyawa yang aktif sebagai antioksidan mereduksi radikal bebas DPPH menjadi senyawa
diphenil picryl hydrazyl (Amic et al. 2003) (Gambar 2).
Gambar 2 Reaksi antara DPPH• dan antioksidan dalam pembentukan DPPH.
Ketika larutan DPPH dicampur dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, maka warna ungu dari larutan akan hilang seiring dengan
2,2-diphenil-1-Picryl hydrazyl
(DPPH)
2,2-diphenil-1-Pikryl hydrazyl
tereduksinya DPPH oleh antioksidan. Absorban yang dihasilkan oleh hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan persen inhibisi. Prinsip metode ini adalah reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH dari zat antioksidan (Gambar 2).
Metode ABTS
Pereaksi ABTS merupakan substrat dari peroksidase, yang ketika ABTS dioksidasi dengan kehadiran H2O2 akan terbentuk senyawa radikal kation
metastabil. Suatu radikal ABTS stabil diproduksi dengan cara oksidasi kalium persulfat ABTS sebelum penambahan antioksidan (Gambar 3) dengan karakteristik menunjukkan absorbansi kuat pada panjang gelombang 414 nm. ABTS merupakan senyawa larut dalam air dan stabil secara kimia. Uji ABTS disebut juga uji radikal ABTS, telah banyak digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan komponen dalam makanan dan minuman karena dapat diterapkan pada fase air dan lipid.
Gambar 3 Reaksi pembentukan radikal bebas stabil ABTS dari ABTS dengan potasium persulfat (kalium persulfat). (Rohim et al. 2008)
dari ABTS, yaitu mengukur absorbansi pengurangan radikal kation dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 734 nm sebagai persentase penghambatan.
Flavonoid
Flavonoid merupakan salah satu golongan fenol alam terbesar yang banyak ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan hijau. Diperkirakan 2 % dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan diubah menjadi flavonoid atau senyawa yang berkaitan dengannya (Markham 1988). Selanjutnya, Harborne (1987) menyebutkan bahwa sebenarnya flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau, sehingga dapat ditemukan pada setiap telaah ekstrak tumbuhan. Flavonoid terdiri atas beberapa kelas antara lain, antosianin, flavonol, flavon, glikoflavon, iflavonil, flavanon, kalkon dan auron serta isoflavon.
Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon dengan cincin benzena (C6) terikat pada suatu rantai propan (C3), membentuk konfigurasi C6-C3-C6, yang dapat menghasilkan 3 jenis struktur, yakni 1,2-diaril propan atau flavonoid, 1,2-diaril propan atau isoflavonoid, dan 1,2-diaril propan atau neoflavonoid (Gambar 4).
Gambar 4 Konfigurasi C6-C3-C6 kerangka dasar flavonoid.
Senyawa-senyawa flavonoid dapat mempunyai kerangka 2-fenilkroman, dimana posisi orto dari cincin A dan atom karbon yang terikat pada cincin B dari 1,3-diaril propan dihubungkan oleh jembatan oksigen, sehingga membentuk suatu cincin heterosiklik yang baru seperti pada Gambar 4 (Markham 1988). Telah
A B C4 C3 C2 O
2 -f en i l k ro m an
C1 C2 C3
F l a v o n o id
C1
C2
C3
Is o f la v o n o i d
A A A B B B C1 C2 C3
N e o f l a v o n o i d
banyak penelitian yang dilakukan mengenai penggunaan senyawa flavonoid. Diantara senyawa-senyawa antioksidan alami, yang terpenting adalah senyawa golongan flavonoid. Suryanto et al (2004) melaporkan senyawa yang berpotensi sebagai penangkap radikal bebas (antioksidan) adalah fenolik (flavonoid). Beberapa studi in vitro menunjukkan aktivitas antioksidan flavonoid, yaitu mencegah bergabungnya oksigen dengan zat lain sehingga tidak menimbulkan kerusakan pada sel-sel tubuh. Senyawa flavonoid bersifat antibakteri, antiinflamasi, antialergi, antimutagen, antineoplastik, dan antitrombosit (Miller 1996). Senyawa aktif yang berpotensi sebagai antioksidan dan inhibitor α -glukosidase ekstrak daun sirih merah diduga kuat senyawa flavonoid (Alfarabi, 2010). Suarsana et al. (2008) melaporkan bahwa senyawa bioaktif pada ekstrak etanol tempe yang mampu menghambat kerja enzim α-glukosidase adalah isoflavon genistein.
Andaliman
Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) adalah salah satu rempah yang digunakan masyarakat adat Batak Angkola dan Batak Toba dengan nama daerah Sinyar-nyar (Angkola) dan Andaliman (Toba). Tanaman ini tergolong perdu dengan tinggi 3-8 m, batang dan cabang merah kasar, berbulu halus dan berduri. Tumbuhan ini berasal dari daerah Himalaya subtropis. Di Indonesia, tumbuhan ini terdapat di Sumatera Utara dan ditemukan liar di pegunungan pada ketinggian 1400 m dpl, dengan temperatur 15-18 oC.
Gambar 5 (A) daun dan (B) buah tanaman andaliman.
Buahnya bulat kecil berwarna hijau (Gambar 5), bila digigit mengeluarkan aroma yang wangi dan rasa tajam yang khas, serta dapat merangsang produksi air liur karena bersifat karminativum (Sirait 1992). Di tempat asalnya masyarakat Himalaya, Tibet dan sekitarnya, buah dari tanaman ini biasa digunakan sebagai bahan aromatik, tonik, perangsang nafsu makan, dan obat sakit perut. Klasifikasi tumbuhan andaliman menurut Keng (1978) adalah sebagai berikut: divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dicotyledonae, ordo Eraniales, famili Rutaceae, marga Zanthoxylum, dan spesies Zanthoxylum acanthopodium
METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan mulai bulan November 2010 sampai Juli 2011 di Laboratorium Kimia, Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (LPPM) Institut Pertanian Bogor, serta Laboratorium Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong.
Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah buah andaliman yang berasal dari Sumatera Utara (Medan). Bahan kimia yang dibutuhkan adalah pereaksi uji fitokimia, berbagai jenis pelarut organik teknis dan proanalis yang biasa digunakan seperti: n-heksana etanol, metanol, kloroform, etilasetat, akuades. enzim α-glukosidase, p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (PNG), tablet akarbosa (Glukobay), DPPH (1,1- diphenyl 2-ficrylhydrazyl), pereaksi ABTS (Asam
2,2-Azinobis (3-etilbenzatiazolin -6-sulfonat ) (Sigma), Folin Ciocalteu, asam galat,
silika gel 60 (70-230 mesh) untuk kromatografi kolom, dan kertas Whatman 42. Alat yang digunakan adalah freeze drier, penggojong, rotavapor, Spektropotometer UV-Vis (Shimadzu model UV-160), Microplate reader, Pelat kromatografi lapis tipis (KLT), pelat kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP), silica gel 60 GF254 ukuran 20 X 20 cm tabung reaksi, kolom ukuran; panjang 62
cm, diameter 2,5 cm, pipet mikro, spektroskopi Infrared (IR), vorteks, dan alat- alat gelas untuk keperluan analisis.
Metode Penelitian Persiapan Sampel
warna hitam lalu dihaluskan sampai ukuran 80 mesh. Serbuk buah andaliman siap digunakan untuk analisis selanjutnya.
Penentuan Kadar Air (AOAC 2006)
Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 oC selama 30 menit. Kemudian cawan didinginkan dalam eksikator. Sebanyak 3 g serbuk buah andaliman dimasukkan ke dalam cawan porselin dan dipanaskan dalam oven pada suhu 105
o
C selama 3 jam, kemudian, cawan diangkat dan didinginkan dalam eksikator selama 30 menit. Cawan dengan serbuk sampel ditimbang hingga bobot konstan.
Penentuan Kadar Abu
Cawan porselin dikeringkan pada temperatur 600 oC selama 30 menit dan didinginkan dalam eksikator, kemudian ditimbang bobotnya. Sebanyak 2 g sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan porselin. Cawan dan isinya dipanaskan dengan nyala bunsen sampai tidak berasap lagi. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam tanur listrik dengan temperatur 600 oC sampai contoh benar-benar menjadi abu (kira-kira 30 menit). Setelah didinginkan dalam eksikator, lalu cawan ditimbang. Hal ini dilakukan sebanyak tiga kali ulangan (triplo). Kadar abu dapat dihitung dengan rumus:
Kadar abu = a b
Keterangan: a = bobot abu b =bobot contoh
Ekstraksi Buah Andaliman
Ekstraksi yang dilakukan merujuk pada ekstraksi yang dilakukan Parhusip (2006) dan Yamazaki et al. (2007), yaitu ekstraksi dengan cara bertingkat. Sebanyak 951,15 g sampel serbuk kering dimaserasi dengan masing-masing 4 L pelarut non polar (n-heksana) untuk menghilangkan lipid dan memisahkan ekstrak non polar yang terkandung dalam andaliman. Ampas kering dari hasil penyaringan maserasi dengan pelarut n-heksana, dengan cara yang sama dimaserasi kembali dengan pelarut etilasetat untuk memperoleh ekstrak semipolar,
masing-masing dilakukan sampai 3 kali ulangan. Kemudian dilanjutkan maserasi dengan pelarut polar (metanol) dan air. Ekstrak hasil ekstraksi kemudian dilanjutkan dengan epavorasi. Selanjutnya ekstrak yang sudah dievaporasi dihitung rendemennya, diuji fitokimia, dan diuji aktivitas (antioksidan & inhibitor enzim α-glukosidase).
Analisis Kualitatif Total Fenol
Sebanyak 0,025 g ekstrak dilarutkan dengan 2 mL etanol dalam tabung reaksi dan ditambah 0,5 mL aquades 1 mL pereaksi Folin-Ciocalteu (50 %). Kemudian campuran ini divorteks selama 3 menit, kemudian ke dalam tabung ditambahkan 1 mL larutan Na2CO3 5%. Selanjutnya campuran disimpan di tempat
yang gelap selama 30 menit. Absorbansi ekstrak diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum ( max). Hasilnya dinyatakan sebagai mg asam galat/100 g ekstrak. Larutan asam galat digunakan sebagai zat untuk membuat kurva kalibrasi.
Uji Fitokimia (Harborne 1987)
Uji flavonoid. Sebanyak 0,1 g ekstrak/serbuk andaliman ditambahkan 10 mL air panas kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 10 mL filtrat ditambahkan 0,5 g serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol. Campuran dikocok kuat-kuat. Uji positif ditandai dengan munculnya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol.
Uji triterpenoid dan steroid. Uji ini menggunakan pereaksi Lieberman-Buchard. Pada pengujian ini, sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak andaliman dilarutkan dengan 25 mL etanol (50 ºC), disaring dan residu ditambahkan eter. Filtrat ditambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat secara berurutan. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu untuk triterpenoid serta hijau atau biru untuk steroid.
Uji alkaloid. Sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak dilarutkan dengan 10 mL kloroform dan beberapa tetes NH4OH dan disaring ke dalam tabung reaksi
tetes H2SO4 2 M kemudian lapisan asamnya dipindahkan ke dalam tabung reaksi
yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada pelat tetes dan ditambahkan pereaksi Meyer, Wagner, dan Dragendorf yang akan menimbulkan endapan warna berturut-turut putih, cokelat, dan merah jingga.
Uji saponin. Sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak andaliman ditambahkan ke dalam 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat dikocok dalam tabung reaksi tertutup selama 10 detik, kemudian dibiarkan selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih stabil.
Uji tanin. Sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak andaliman ditambahkan ke dalam 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat ditambahkan dengan 10 mL FeCl3 1%. Uji positif ditandai munculnya warna hijau kehitaman.
Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH dan ABTS
Larutan sampel disiapkan dengan beberapa konsentrasi 500, 400, 300, 200, 100, 50, dan 25 ppm. Kemudian 100 L larutan DPPH (0,0118 g dalam 100 mL etanol) (Batubara et al. 2009) dan ABTS (ABTS dalam K2SO4) (Rohim et al.
2008) ditambahkan pada masing-masing sumur mikro untuk metode DPPH dan ABTS. Setelah diinkubasi selama 30 menit absorbansi diukur pada panjang gelombang 517 nm untuk metode DPPH dan 414 nm untuk metode ABTS. Kontrol positif yang digunakan adalah troloksdalam etanol.
Persen inhibisi antioksidan metode DPPH dan metode ABTS dihitung dengan rumus berikut:
% Inhibisi Absorban blanko Absorban sampelAbsorbansi blanko X %
Ablanko adalah absorbansi campuran etanol dan pereaksi (DPPH dan ABTS).
Setiap konsentrasi sampel dan kontrol positif (Troloks) diuji tiga kali pengulangan.
Uji Aktivitas Inhibitor α-Glukosidase (Suarsana et al 2008)
7,0) kemudian ditambahkan 200 mg SBA yang telah dilarutkan dalam bufer fosfat 100 mM (pH 7,0). Sebelum digunakan, 1 mL larutan enzim tersebut diencerkan 25 kali dengan bufer fosfat 100 mM (pH 7,0). Campuran reaksi terdiri atas 25 µL PNG 20 mM sebagai substrat, 50 µL larutan bufer fosfat 100 mM (pH 7,0), dan 50 µL larutan sampel dalam DMSO. Campuran reaksi diinkubasi selama 15 menit dan ditambahkan 25 µL larutan α-glukosidase, kemudian diinkubasi selama 15 menit. Reaksi enzim dihentikan dengan penambahan 1000 µL Na2CO3 dan p
-nitrofenol yang dihasilkan dibaca absorbannya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm. Tablet akarbosa (Glukobay) dilarutkan dalam bufer dan HCl 2N (1:1) dengan konsentrasi 6; 3; 1,5; 0,75; 0,375; 0,188; 0,094 % b/v sebagai kontrol positif. Absorbansi hasil reaksi tersebut diukur dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm. Pengukuran absorbans sampel dan kontrol positif dilakukan dengan dua kali ulangan (duplo). Data kontrol positif digunakan sebagai pembanding terhadap sampel yang diuji. Persentasi inhibisi dapat dihitung dengan rumus:
% inhibisi K SK X %
S = S1 – S0
% inhibisi K SK S
Keterangan:
K = Absorban kontrol (DMSO) tanpa sampel (kontrol blanko/kontrol negatif) S1 = Absorban sampel dengan penambahan enzim.
S0 = Absorban sampel tanpa penambahan enzim.
Penentuan Eluen Terbaik
Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)
Fraksinasi adalah proses pemisahan komponen dalam suatu ekstrak menjadi kelompok-kelompok senyawa yang memiliki kemiripan karakteristik secara kimia (Rouessac dan Rouessac 2007). Kromatografi kolom dan KLTP merupakan teknik analisis dalam penentuan jumlah komponen senyawa tertentu dari campurannya. kromatografi bertujuan untuk mengetahui komponen-komponen senyawa aktif kimia yang dapat terpisah (Hayani 2007). Dalam pemisahan dengan kromatografi kolom ini, suatu pengelusi dialirkan secara terus menerus melalui kolom. Komponen-komponen (eluat) yang keluar dari kolom ditampung kedalam tabung reaksi dengan volume masing-masing sebanyak 5 mL dan digabung berdasarkan pola spot atau nilai Rf dari setiap tabung yang diuji dengan KLT untuk menentukan jumlah fraksi yang terbentuk. Untuk memperoleh senyawa yang lebih murni, selanjutnya dapat dilakukan dengan KLTP. Kromatografi lapis tipis preparatif merupakan kromatografi preparatif yang dapat digunakan untuk memurnikan komponen yang diperoleh dari pemisahan dengan kromatografi kolom. Kelebihan KLTP adalah merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sedikit baik penyerap maupun cuplikannya, kemudian dapat digunakan untuk mencari eluen terbaik untuk kromatografi kolom.
Identifikasi Senyawa (harborne 1987)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Persiapan dan Ekstraksi Sampel
Sebanyak 5 kg buah segar tanaman andaliman asal Medan diperoleh dari Pasar Senen, Jakarta. Hasil identifikasi yang dilakukan oleh Pusat Penelitian Biologi LIPI, Bogor, menunjukkan buah tanaman andaliman yang digunakan dalam penelitian ini termasuk dalam jenis Zanthoxylum acanthopodium DC, suku Rutaceae (Lampiran 2). Secara berturut-turut besarnya kadar air, dan kadar abu buah andaliman adalah 9,59 % dan 28,42 %. Berdasarkan hasil ekstraksi dengan menggunakan pelarut n-heksana etilasetat, metanol, dan air diperoleh ekstrak pekat dengan urutan nilai rendemen masing-masing sebesar 1,79 %; 2,57 % ;4,22 %; dan 4,90 % (Lampiran 3). Dari nilai rendemen yang diperoleh menunjukkan, pelarut air dapat mengekstraksi komponen lebih banyak dibanding pelarut yang lain, hal ini dimungkinkan karena pelarut air bersifat lebih polar, sehingga semua komponen yang belum terekstrak oleh pelarut n-heksana, etilasetat, dan metanol akan terekstraksi oleh air.
Uji Aktivitas dan Pemilihan Ekstrak Terbaik Buah Andaliman
Parameter utama yang digunakan dalam pemilihan ekstrak terbaik adalah nilai IC50 dari hasil uji aktivitas antioksidan, dan inhibitor enzim α-glukosidase.
Uji fitokimia merupakan uji kualitatif yang digunakan untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dalam suatu sampel (bahan). Uji ini dilakukan terhadap serbuk kering, ekstrak kasar, dan fraksi dari hasil proses fraksinasi buah andaliman. Dari hasil uji aktivitas, diperoleh ekstrak metanol memiliki aktivitas yang paling baik sebagai antioksidan dan inhibitor α -glukosidase, karena memiliki IC50 yang lebih rendah dibanding ekstrak yang lain
Hal ini juga berarti bahwa ekstrak metanol didominasi oleh senyawa flavonoid. Namun, nilai rendemen, dan total fenol ekstrak metanol lebih rendah dibanding ekstrak air, berarti bahwa nilai rendemen dan nilai total fenol tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap aktivitas suatu bahan.
Tabel 2 Uji total fenol, dan IC50 aktivitas ekstrak kasar andaliman
Ekstrak Rendemen (%)
Total fenol (mg asam galat/100 g
ekstrak)
IC50 (ppm)
DPPH ABTS Inhibitor α -glukosidase
n-Heksana 1,79 38,75
Etilasetat 2,57 184,91 895,04 52,83 5574 Metanol 4,22 375,54 390,92 30,04 323
Air 4,90 460,91 71,61
Kontrol positif
Troloks 10,17 25,67
Akarbosa 0,54
Tanda ( ): Tidak aktif: IC50 melebihi konsentrasi maksimum sampel: antioksidan (800 ppm), inhibitor α-glukosidase (10.000 ppm)
Tabel 1 Hasil uji fitokimia ekstrak kasar buah andaliman
Senyawa Ekstrak
n-heksana etilasetat metanol air Flavonoid + ++ +++ ++ Saponin + + +
Tanin + + +
Alkaloid + + + ++ terpenoid + + + + Steroid + + + +
[image:34.595.87.482.468.694.2]Rendemen adalah persentasi bobot produk akhir dibandingkan terhadap bobot awal, dalam hal ini rendemen merupakan kadar komponen yang terekstraksi (terbawa oleh pelarut) sesuai dengan tingkat kepolaran di dalam serbuk buah andaliman yang dinyatakan dengan persen. Total fenol adalah banyaknya senyawa fenolik yang terdapat dalam suatu ekstrak. Senyawa-senyawa fenolik memiliki aktivitas antioksidan karena kemampuannya mendonorkan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya kepada senyawa radikal. Senyawa fenol tumbuhan dapat menimbulkan gangguan besar karena kemampuannya membentuk kompleks dengan protein dengan cepat sekali melalui ikatan hidrogen (Harborne 1987). Senyawa fenol terbagi atas 3 kelompok, yaitu (1). golongan fenol sederhana (Vanilin, gingerol, shogaol, gualakol, dan eugenol); (2). Asam fenol (p-kresol, 3-etilfenol, hidrokuinon, dan asam galat); dan (3) flavonoid (antosianin, flavonon, flavonol dan tanin) (Parhusip 2006). Berdasarkan nilai total fenol dan rendemen serta nilai IC50 dapat disimpulkan, ekstrak air yang memiliki
rendemen dan total fenol yang lebih tinggi, tetapi aktivitasnya lebih rendah dibanding dengan ekstrak metanol. Hal ini disebabkan karena ekstrak metanol lebih banyak mengandung senyawa flavonoid yang aktif sebagai antioksidan dan inhibitor enzim α-glukosidase.
Pencarian Eluen Terbaik
Berdasarkan analisis KLT dengan eluen tunggal, kloroform dan metanol menunjukkan keterpisahan yang bagus, hal ini berdasarkan keterpisahan dan jumlah spot yang terbentuk lebih banyak (Gambar 6). Untuk mengetahui keterpisahannya, dilakukan analisis pencarian eluen KLT dengan menggunakan perbandingan antara kloroform dan metanol pada 1:1; 2:1; 3:1; 6:1; dan 9:1. Dari hasil analisis yang diperoleh menggunakan KLT GF254, menunjukkan bahwa
Gambar 6 Profil spot pencarian eluen terbaik dengan pelarut tunggal dari kiri ke kanan: n-heksana, diklorometana, klorofom, etilasetat, aseton, etanol dan metanol.
[image:36.595.174.387.85.262.2]Noda pemisahan dideteksi di bawah lampu UV 254 dan 366 nm. Eluen terbaik yang diperoleh selanjutnya akan digunakan untuk analisis KLT fraksi hasil dari fraksinasi dengan kromatografi kolom.
Gambar 7 Profil spot pencarian eluen terbaik dengan perbandingan kloroform-metanol, dengan urutan perbandingan dari kiri ke kanan (1:1); (2:1); (3:1); (6:1); dan (9:1).
Fraksinasi Ekstrak Teraktif
Fraksinasi dilakukan terhadap ekstrak metanol sebagai ekstrak yang paling aktif. Pemisahan dilakukan dalam kolom dengan metode step gradient
dimasukkan secara perlahan ke dalam kolom untuk 4 kali ulangan. Elusi dimulai dengan pelarut n-heksana, kemudian dilanjutkan dengan perbandingan n-heksan dan etilasetat pada perbandingan 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 dan etilasetat 100%, dengan cara yang sama dilanjutkan dengan perbandingan etilasetat dan metanol dan diakhiri perbandingan metanol dan air. Hasil pemisahan ekstrak ditampung sebanyak 5.0 ml dalam setiap tabung reaksi dan dimonitor melalui kromatografi lapis tipis (KLT) dengan menggunakan eluen terbaik yang dicari sebelumnya (klorofom-metanol = 9:1). Berdasarkan pemisahan yang dilakukan diperoleh 358 tabung.
Gambar 8 Profil KLT 6 fraksi (A-F) hasil fraksinasi kromatografi kolom dengan eluen step gradien.
Penggabungan dilakukan berdasarkan nilai Rf pada KLT dan kesamaan pola spot dari setiap tabung (Lampiran 6), dari hasil penggabungan diperoleh enam fraksi (A-F). Kemudian setelah semua fraksi (A-F) diuapkan hingga pekat diperoleh urutan nilai rendemen masing-masing sebesar 6,15; 12,27; 5,49; 27,04; 7,47; dan 10.21 % (b/b) (Lampiran 7).
Pemilihan fraksi terbaik hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom Berdasarkan uji aktivitas, fraksi C dan E memiliki aktivitas paling baik sebagai inhibitor α-glukosidase dan antioksidan. Pemilihan fraksi terbaik berdasarkan
nilai IC50 (Tabel 3). Semakin kecil nilai IC50, aktivitasnya semakin baik. Dari
[image:38.595.80.486.269.524.2]hasil uji fitokimia flavonoid (Tabel 4), menunjukkan fraksi C dan E memiliki warna jingga yang lebih tajam pada lapisan amil alkoholnya. Hal ini menunjukkan, bahwa fraksi C dan E didominasi oleh senyawa flavonoid, sehingga dapat disimplukan, bahwa senyawa utama yang berpotensi sebagai antioksidan maupun sebagai inhibitor α-glukosidase seperti yang terdapat fraksi C dan E adalah senyawa flavonoid, tentu hal ini pengaruh dari peranan atom hidrogen.
Tabel 3 Data IC50 aktivitas fraksi hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom
Fraksi Rendemen (%) IC50 (ppm)
DPPH ABTS Inhibitor α -glukosidase
A 6,13 81,00
B 12,27 527,32 117,00
C 5,49 720,39 498,86 16,00
D 27,04 601,17 710,64 39,00
E 7,47 444,77 181,79 27,00
F 10,21 1687,88 906,58
Kontrol positif
Troloks 10,17 25,67
Akarbosa 0,54
Keterangan: ( ): IC50 melebihi konsentrasi maksimum: 800 ppm untuk antioksidan 2600 ppm untuk inhibitor α-glukosidase.
Tabel 4 Uji fitokimia dan IC50 aktivitas ekstrak fraksi hasil kromatografi kolom
Parameter Fraksi
A B C D E F
Flavonoid + ++ +++ ++ +++ ++
Saponin
Tanin
Alkaloid ++ + + +++ + +
Steroid + ++
Terpenoid + + ++ +++
Keterangan: ( ): tidak terdeteksi
Fraksinasi Fraksi Terbaik Dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Fraksi C dan E merupakan fraksi teraktif sebagai inhibitor α-glukosidase dan antioksidan lebih lanjut dimurnikan dengan KLTP. Pemisahan dengan KLTP menggunakan perbandingan pelarut kloroform : metanol (9:1) untuk fraksi C dan klorofom-metanol-heksana (3:1:1) untuk fraksi E sebagai eluen terbaiknya yang sudah dicari sebelumnya. Alasan perbedaan eluen terbaik yang digunakan adalah karena fraksi E memiliki satu spot pada saat dimonitor dengan pelat KLT sehingga diduga adanya penumpukan senyawa.
Gambar 9 Profil pola spot fraksi hasil KLTP fraksi C dan E berturut-turut dari kiri ke kanan fraksi (a). FC1- FC10 dan (b). FE1- FE8 (Visualisasi spot:
UV 254 nm)
[image:39.595.111.510.524.693.2]Pemisahan ini menggunakan adsorben silika gel. Berdasarkan pemisahan yang dilakukan, untuk fraksi C diperoleh 10 fraksi (FC1-FC10) dan untuk fraksi E diperoleh 8 fraksi (FE1-FE2). Spot yang terbentuk dideteksi dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Nilai Rf ke-10 fraksi dari fraksi E (C1-C10) dan 8 fraksi dari fraksi E (E1-E2) dapat dilihat pada Lampiran 9.
Pemilihan Fraksi Terbaik Hasil Fraksinasi Dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)
[image:40.595.85.484.207.761.2]Dari hasil uji aktivitas terhadap fraksi hasil fraksinasi dengan KLTP menunjukkan bahwa Fraksi C2 dan E2 adalah fraksi yang memberikan sifat inhibisi yang paling baik sebagai inhibitor α-glukosidase dan antioksidan, karena kedua fraksi memiliki nilai IC50 yang lebih rendah (Tabel 5).
Tabel 5 Nilai IC50 aktivitas untuk fraksi hasil fraksinasi dengan kromatograpi
lapis tipis preparatif (KLTP)
Fraksi C Rendemen (%)
IC50 (ppm)
Inhibitor α-glukosidase
Fraksi E Rendemen (%)
IC50 (ppm)
DPPH ABTS
C1 5,44 80,65 E1 22,09 386,61 168,26 C2 6,31 34,72 E2 7,44 137,46 74,02
C3 2,32 E3 4,04 126,95
C4 7,47 E4 2,71 249,82
C5 4,63 E5 1,61 338,44
C6 3,99 E6 0,94 309,93
C7 3,59 E7 1,69
C8 2,12 E8 1,38
C9 0,39 C10 2,32
Kontrol positif
Akarbosa 0,54
Troloks 10,17 25,67
Secara keseluruhan nilai IC50 Ekstrak kasar dan fraksi buah andaliman lebih
besar dibanding kontrol positif, berarti aktivitas kontrol positif masih lebih baik bila dibandingkan dengan ekstrak kasar dan fraksi buah andaliman. Hal ini dimungkinkan senyawa yang terdapat dalam sampel belum murni seperti halnya troloks dan akarbosa. Apabila hasil ini dibandingkan dengan tumbuhan lain seperti ekstrak etanol 70% daun sirih merah (IC50 = 85,82 ppm) dengan metode
DPPH (Alfarabi 2010), buah andaliman memiliki nilai IC50 yang lebih besar,
Berarti aktivitas antioksidan daun sirih merah lebih tinggi dari pada buah andaliman, namun untuk aktivitas inhibitor α-glukosidase, berdasarkan nilai IC50
ekstrak metanol, fraksi C dan fraksi C2 buah andaliman masing-masing sebesar: 322 ppm; 16 ppm; dan 34,72 ppm, tentu hasil ini menunjukkan bahwa aktivitas inhibitor α-glukosidase ekstrak buah andaliman jauh lebih tinggi dibanding daun sirih merah yang memiliki inhibisi terbesar 39,62 % pada konsentrasi 1 % (10.000 ppm) dan inhibisi terkecil sebesar 1,26 % pada konsentrasi 0,1 % (1000 ppm).
Identifikasi dan Pendugaan Senyawa Aktif
Pendugaan senyawa aktif utama yang berpotensi sebagai antioksidan dan inhibitor α-glukosidase pada fraksi C2 dan E2 dilakukan berdasarkan data yang diperoleh dari hasil identifikasi dengan menggunakan spektrofotometer IR dan data panjang gelombang maksimum dari hasil identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis.
Berdasarkan hasil analisis dengan Fourier Transform Infrared Spectroscopy
Gambar 10 Spektrum inframerah (A) fraksi E2 dan (B) fraksi C2.
Dugaan ini didukung oleh nilai panjang gelombang maksimum masing-masing fraksi C2 dan E2, yaitu 234 nm dan 226 nm (Tabel 6). Pada umumnya, panjang gelombang maksimum spektrum khas flavonoid utama berada pada rentang 230 – 280 nm (Markham 1988). Berdasarkan data panjang gelombang maksimum senyawa golongan flavonoid menurut literatur, bahwa fraksi C2 dan E2 secara berturut diduga termasuk pada senyawa flavonoid golongan auron dan flavanon (Markham 1988 dan Harborne 1987).
(A)
Tabel 6 Serapan infra merah gugus fungsi fraksi C2 dan E2
Sumber *): Silverstein et al. 1986
Tabel 7 Nilai panjang gelombang maksimum senyawa dalam fraksi C2 dan E2
Fraksi Maks (nm) Golongan flavonoid Pengukuran Literatur
C2 234 230 -270** Auron**
E2 226 225* Flavanon*
Sumber: * Markham (1988), ** Harborne (1987)
Bilangan gelombang
(cm-1) Literatur*
(cm-1) Gugus dugaan C2 E2
3389,57 3372 3200-3500 uluran OH 2925,32 2959,45
2695-2900 renggang C-H alifatik 2928,8
2339,85 2112,17 2100-2260 renggang C-H aromatik 1670,76 1604,83 1540-1800 ulur karbonil (C=O) 1455,90 1409,68
1300-1475 lentur C-H 1418,56 1463,2
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Buah andaliman berpotensi sebagai inhibitor α-glukosidase dan antioksidan. Ekstrak metanol buah andaliman memiliki aktivitas yang paling baik sebagai antioksidan dengan IC50 sebesar 30,04 ppm. Berdasarkan hasil pemisahan, yang
paling aktif sebagai inhibitor α-glukosidase adalah fraksi C (IC50 16 ppm) yang
diperoleh dari hasil pemisahan dengan kromatografi kolom. Hasil identifikasi dengan IR dan UV-Vis menunjukkan, bahwa senyawa aktif utama yang berpotensi sebagai inhibitor α-glukosidase dan antioksidan diduga merupakan senyawa flavonoid golongan auron dan flavanon.
Saran
Saran bagi penelitian selanjutnya adalah melakukan proses pemurnian lebih lanjut untuk memperoleh senyawa murni dan identifikasi dengan spektroskopi
Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS), dan Nuclear Magnetic
Resonance (NMR), serta perlu dikaji mekanisme antioksidasi dan antidiabetes
DAFTAR PUSTAKA
Alfarabi M. 2010. Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper
crocatum) in vitro [Tesis], Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian
Bogor.
Amic D, Beslo D, Trinajstic N, Davidovic. 2003. Structure-radical scavenging activity relationships of flavonoids. Croatia Chem Acta 76(1): 55-61.
[AOAC] The Association of Official Analytical chemist. 2006. Official Methods
of Analysis. Ed ke-18. Washington DC: Association of Official Analytical
Chemist.
Apak R, Guclu K, Demirata B, Ozyurek M, Celik SE, Bektasoglu B, Berker K dan Ozyurt D. 2007. Comparative evaluation of various total antioxidan
capacity assay applied to phenolic compounds with the CUPRAC assay.
Molecules 12:1496-1547.
Batubara I, Tohru M, & Hideo Ohashi. 2009. Screening Antiacne Potency of
Indonesian Medicinal Plants : Antibacterial, Lipase Inhibition, and
Antioxidant Activities. Journal Wood Science. 55:230-235.
Gordon MH. 1990. The mechanism of antioxidants action in vitro. Di dalam: B.J.F. Hudson, editor. Food Antioxidants. Elesever Applied Science, London.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. (Terjemaha kedalam Bahasa Indonesia oleh Kosasih P. Dan Iwang S). Penerbit ITB. Bandung.
Hayani E. 2007. Pemisahan rimpang temu kunci secara kromatografi kolom.
Buletin Teknik Pertanian 12 (1) : 35-37.
Keng H. 1978. Orders and Families of Malayan Seed Plants. Singapore University Press.
Lee SK. 2007. Inhibitory activity Euonimusalatus against α-glukosidase invitro
and invivo. Nutrition research and practice 1 (3) : 184-188.
Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Padmawinata. K, penerjemah. Bandung. ITB. Bandung. Terjemahan dari: Phytochemical
Metode.
Mistra R. 2004. Tiga jurus melawan diabetes mellitus. Jakarta : Puspa swara. Parhusip A.J.N. 2006. Kajian mekanisme Antibakteri Ekstrak Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC) Terhadap Bakteri Patogen Pangan [Disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Rohim A. Rocca E, Steinmetz J, Kassim M, Ibrahim M, Osman H. 2008. Antixidant activities of mangrove Rhizophora apiculata bark extract. J. Food Chemistry 107: 200 – 207.
Silverstein RM, Basler GC, morril TC. 1986. Penydikan spektrometrik Senyawa
Organik. Hartono AJ, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari:
Spectrometric Identification of Oeganic Compounds.
Sirait M. 1992. Pemeriksaan Minyak Atsiri dan Isolasi Senyawa Getir Dari Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC). [Skripsi]. Bandung. Fakultas matematika dan Ilmu pengetahuan Alam. Institut Teknologi Bandung. Sou S. 2000. Novel α-glukosidase inhibitor with a tetrachloro pthlamida skeleton.
Bioorganik & medical chemistry letters 10 : 1081-1084. Tokyo : Institute of
molecular and cellular biosciences.
Suarsana NI, Priosoeryanto BP, Bintang M, Wresdiyati T. 2008. Aktivitas hipoglikemik dan antioksidatif ekstrak metanol tempe pada tikus diabetes. J
Veteriner 9:122-127.
Suryanto E, Sastrohamidjojo H, Raharjo S, Tranggono. 2004. Antiradical activity of andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) fruit Extract. J Indonesian
Food and Nutrition Progress 11:15-19.
Suyono. 2002. Kecenderungan Peningkatan Jumlah Pasien Diabetes Melitus
Terpadu. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Tensiska, Wijaya CH, Andarwulan N. 2001. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) Dalam Beberapa Sistem Kestabilan Pangan Dan Kestabilan Aktivitasnya Terhadap Kondisi Suhu Dan pH. J Teknol Industri Pangan 14:29-39.
Wijaya CH. 1999. Andaliman rempah tradisional sumut dengan aktivitas antioksidan dan antimikroba. Bul Teknol Industri Pangan 2: 59-61.
Wijaya CH. 2000. Isolasi dan identifikasi senyawa trigeminal aktif buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC). J Hayati 7:91-95.
Yamazaki et al. 2007. Antioxidant activity of japenese pepper (Zanthoxylum
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Sampel basah
Dikeringkan dan dihaluskan
Ekstrak air
Serbuk kering
Determinasi
Kadar air & kadar abu Maserasi dengan n-heksana
Disaring
Ekstrak n-heksana
Residu Ekstrak etilasetat
Ekstrak metanol
Residu
Maserasi dengan etilasetat
Disaring Disaring Disaring
Residu
Maserasi dengan metanol
Residu
Ekstrak terbaik
Maserasi dengan air
Rendemen, total penol, uji fitokimia, uji akfivitas antioksidan & inhibitor α- glukosidase
Diuapkan
Diuapkan
Diuapkan
Lampiran 1 (lanjutan)
Rendemen
Uji aktivitas antioksidan
Uji aktivitas antioksidan
Rendemen
Uji fitokimia Ekstrak teraktif
Pemilihan eluen terbaik
Fraksinasi dengan romatografi kolom
Fraksi A Fraksi B Fraksi C Fraksi nx
Fraksi teraktif
Fraksinasi dengan KLTP
Identifikasi senyawa (UV-VIS, IR)
Uji akfivitas inhibitor α-glukosidase
Inhibitor enzimα-glukosidase Fraksi Bx
Fraksi Ax Fraksi Cx Fraksi n
Lampiran 3 Hasil penentuan rendemen ekstrak kasar
No Ekstrak Bobot awal (g)
Bobot ekstrak (g)
Kadar air (%)
Rendemen (%)
1 n-heksan 15,3637
9,59
1,7866 2 Etil asetat 951,15 22,1139 2,5716
3 Metanol 36,3187 4,2234
4 Air 42,2086 4,9083
Contoh Perhitungan:
Rendemen Bobot kering Bobot ekstrakkadar air X %
Rendemen , g , g , X %
Rendemen , , g X %
Lampiran 4 Penentuan total fenol
Sampel Ulangan Absorban Total fenol mg asam galat/ 100 g ekstrak
Ekstrak n-heksana
1 0,334 38,7500 2 0,335 3 0,335 Rata-rata 0,335 Ekstrak etilasetat 1 1,505 184,9125 2 1,505 3 1,503 Rata-rata 1,5043 Ekstrak metanol 1 3,068 375,5375 2 3,01 3 3,01 Rata-rata 3,0293 Ekstrak Air 1 3,612 460,9125 2 3,612 3 3,913 Rata-rata 3,712 Contoh perhitungan:
Y = 0,008x + 0,025 0,335 = 0,008x + 0,025
X = 38,7500, jadi total fenol = 38,7500 mg asam galat /100 g ekstrak y = 0,008x + 0,025
R² = 0,995
0 0.5 1 1.5
0 50 100 150
Absorban
Konsentrasi (ppm)
Kurva standar (asam galat)
Series1
Lampiran 5 Contoh perhitungan IC50 ekstrak kasar buah andaliman untuk uji
aktivitas antioksidan dan inhibitor α-glukosidase 1. Antioksidan
% Inhibisi Abs. blanko Abs. sampelAbs. blanko x %
% Inhibisi , , , x %
% Inhibisi ,
Contoh perhitungan IC50 :
Y= 0,087x + 15,99 50= 0,087x + 15,99 X = 390,9195 ppm
y = 0,087x + 15,99 R² = 0,950
0 20 40 60 80 100
0 200 400 600 800 1000
% Inhibisi Konsentrasi (ppm)
Ekstrak metanol
Series1 Linear (Series1) Konsentrasi (ppm) Abs. sampel % Inhibisi800 0,165 81,0563 700 0,2 77,0379 600 0,236 72,9047 500 0,329 62,2273 400 0,374 57,0609 300 0,517 40,6429 200 0,622 28,5878 blanko 0,871
Lampiran 5 (lanjutan) 2. Inhibitor α-glukosidase
Konsentrasi (%)
Ekstrak metanol Abs
(S0)
S1 S1-S0 % Inhibisi U1 U2 U1 U2 U1 U2
1 1,349 1,736 1,695 0,387 0,346 87,1981 88,5544 0,5 0,784 1,224 1,222 0,44 0,438 85,4449 85,5111 0,25 0,435 0,976 0,993 0,541 0,558 82,1039 81,5415 0,125 0,281 1,082 1,128 0,801 0,847 73,5031 71,9815 0,0625 0,181 1,526 1,565 1,345 1,384 55,5078 54,2177 0,0313 0,158 1,744 1,804 1,586 1,646 47,5356 45,5508 Blanko 0,093 3,266 2,966 3,173 2,873
Rerata blanko = 3,023 Rerata IC50 = 0,0323 %
Keterangan : S1= campuran dengan penambahan enzim S0= campuran tanpa penambahan enzim
Contoh Perhitungan:
% Inhibisi , , , x %
% Inhibisi , %
Y = 12,23 ln(x) + 93,08 50 = 12,23 ln(x) + 93,08 Ln(x) = -3,5225
X = anti ln (-3,5225) = 0,0295
Jadi IC50 rata-rata , , ,
Jadi IC50 rata-rata = , %
y = 12,23ln(x) + 93,08 R² = 0,907 y = 13,13ln(x) + 93,97
R² = 0,928 0
50 100
0 0.5 1 1.5
Lampiran 6 Nilai Rf setiap tabung hasil fraksinasi ekstrak metanol dengan kromatografi kolom
Tabung Jlh spot
Jarak spot(cm)
Jarak eluen (cm)
Rf Fraksi Warna
1-31 1 8
8.3
0.93 A Hijau muda
32-45 1 4.5 0.52 B Hijau tua
46-150 1 2.5 0.29 C Hijau
151-185 1 2 0.23 D Coklat
186-238 2 1;0.6 0.12; 0.07 E Kuning 239-358 1 0.3 0.035 F Coklat muda
Contoh perhitungan:
Jarak tempuh spot dari garis awal Jarak tempuh eluen dari garis awal
cm . cm
Lampiran 7 Nilai Rf dan penentuan rendemen setiap fraksi hasil penggabungan setiap tabung dari fraksinasi dengan kromatografi kolom
a. Nilai Rf
Fraksi Jumlah spot
Jarak spot(cm)
Jarak eluen
(cm)
Rf Warna
A 1 6,5
8.3
0,8072 Hijau muda B 2 1,6; 4 0,1928; 0,4819 Hijau tua
C 2 1,6; 3,1 0,1928; 0,3855 Hijau D 2 0,6; 1,7 0,0723; 0,3855 Coklat
E 1 0,6 0,0723 Kuning
F 1 0 0 Coklat muda
b. Contoh perhitungan rendemen fraksi hasil fraksinasi dengan kolom
Fraksi Bobot (g) Bobot ekstrak (g) Rendemen (%) A 0.5274
8.6071
6,1275
B 1.0557 12,2655
C 0.4724 5,4885
D 2.3276 27,0428
E 0.6426 7,4659
F 0.8785 10,2067
Contoh perhitungan:
Rendemen Bobot ekstrak gBobot fraksi g
Rendemen .. g g x %
Lampiran 8 Contoh perhitungan IC50 fraksi hasil fraksinasi ekstrak terbaik
dengan kromatografi kolom untuk uji aktivitas antioksidan dan inhibitor α-glukosidase.
a. Antioksidan
% Inhibisi , , , x %
%Inhibisi ,
Y = 25,43 Ln(x) – 120,6
Ln x ,
x anti Ln , 812,4 ppm Jadi IC50 = 812,4 ppm
y = 32,80ln(x) - 150,0 R² = 0,910
-100 -50 0 50 100
0 200 400 600 800 1000
% Inhibisi Konsentrasi (ppm) Series1 Log. (Series1) Konsentrasi (ppm) Fraksi E
Absorban % Inhibisi
800 0,121 78,3929
700 0,137 75,5357
600 0,171 69,4643
500 0,266 52,5
400 0,316 43,5714
300 0,498 11,0714
200 0,473 15,5357
100 0,553 1,25
50 0,72 -28,5714
25 0,722 -28,9286
blanko 0,56
Lampiran 8 (lanjutan) b. Inhibitor α-glukosidase
Konsentrasi (%)
Fraksi C
S S0 S-S0 % Inhibisi
U1 U2 U1 U2 U1 U2
0,26 3,711 3,71 3,611 0,1 0,099 95,5556 95,6 0,13 2,417 2,464 2,196 0,221 0,268 90,1778 88,0889 0,065 1,628 1,595 1,251 0,377 0,344 83,2444 84,7111 0,0325 1,103 1,097 0,72 0,383 0,377 82,9778 83,2444 0,01625 0,863 0,846 0,407 0,456 0,439 79,7333 80,4889 0,00812 0,984 0,978 0,278 0,706 0,7 68,6222 68,8889 0,00406 1,322 1,354 0,194 1,128 1,16 49,8667 48,4444 Blanko 2,428 2,326 0,127 Abs.blanko rata-rata = 2,25
IC50 rata-rata = 0,0016 %
% Inhibisi K SK S x %
% Inhibisi , , , x %
% Inhibisi ,
Y = 9,464 Ln (x) + 111 IC50 = anti Ln ( , ,
IC50 rata-rata = , , , %
y = 9,464ln(x) + 111,0 R² = 0,867
y = 9,485ln(x) + 111 R² = 0,837
0 20 40 60 80 100 120
0 0.1 0.2 0.3
% Inhibisi
Konsentrasi (%)
Lampiran 9 Nilai rendemen dan Rf fraksi C dan E dari hasil KLTP
Fraksi C (0,2503 g) Fraksi E (0,2178 g)
Fraksi Bobot (g)
Rendemen
(%)
Jlh
spot Rf Fraksi
Bobot
(g)
Rendemen
(%)
Jlh
spot Rf
FC1 0,0136 5,43 1 0,1219 FE1 0,0481 22,08 1 0,0811
FC2 0,0158 6,31 1 0,2439 FE2 0,0162 7,44 1 0,1216
FC3 0,0058 2,32 1 0,3171 FE3 0,0088 4,04 1 0,2027
FC4 0,0187 7,47 1 0,4268 FE4 0,0059 2,71 2
0,1622;
0,4729
FC5 0,0116 4,63 1 0,5366 FE5 0,0035 1,61 1 0,5135
FC6 0,0100 3,99 1 0,6341 FE6 0,0021 0,96 1 0,6351
FC7 0,0090 3,59 1 0,7073 FE7 0,0037 1,69 2
0,5;
0,7027
FC8 0,0053 2,12 1 0,8049 FE8 0,003 1,38 1 0,8108
FC9 0,0010 0,39 1 0,8902 - - - - -
FC10 0,0058 2,32 1 0,9268 - - - - -
Contoh Perhitungan:
Bobot fraksi
Bobot ekstrak X %
,
, X %
Lampiran 10 Perhitungan nilai IC50 fraksi yang diperoleh dari hasil KLTP
sebagai antioksidan dan inhibitor α-glukosidase
a. Antioksidan
FE2 Konsentrasi
(ppm)
Absorbansi sampel % Inhibisi
U1 U2 U1 U2
500 0,143 0,138 79,2453 79,9709 400 0,176 0,181 74,4557 73,7300 300 0,187 0,186 72,8592 73,0044 200 0,193 0,189 71,9884 72,5689 100 0,476 0,432 30,9144 37,3004 50 0,532 0,523 22,7866 24,0929 25 0,707 0,733 -2,6125 -6,3861 blanko 0,715 0,663
Blanko rata-rata 0,689
IC50 (ppm) 122,2034
143,7821 Rerata = 132,9928
% Inhibisi Abs. blanko Abs. sampel
Abs. blanko x %
% Inhibisi , , , x %
Lampiran 10 (lanjutan)
Y = 29,54 Ln(x) – 91,96 50 = 29,54 Ln(x) – 91,96
Ln x ,,
Ln x ,
x anti Ln , ppm
IC50 = 122,2034 ppm
IC50 rata-rata = , ,
IC50 rata-rata = 132,9928 ppm
b Inhibitor α-glukosida
Konsentrasi (ppm) S1 S0 S1-S0 % Inhibisi
500 0,453 0,436 0,017 90,8602
250 0,31 0,276 0,034 81,7204
125 0,27 0,195 0,075 59,6774
62,5 0,229 0,152 0,077 58,6022 31,25 0,216 0,13 0,086 53,7634 15,625 0,221 0,121 0,1 46,2366 7,8125 0,26 0,112 0,148 20,4301
Blanko 0,296 0,11 0,186
y = 28,54ln(x) - 91,96 R² = 0,950
y = 28,39ln(x) - 91,05 R² = 0,943
-20 0 20 40 60 80 100
0 100 200 300 400 500 600
% Inhibisi Konsentrasi (ppm) FE2 DPPH Series1 series 2 Log. (Series1)
Lampiran 10 (lanjutan)
% Inhibisi K SK S x %
% Inhibisi , , , x %
% Inhibisi , %
Y = 14,84 Ln(x) – 2,643 50 = 14,84 Ln(x) – 2,643 Ln(x) = 3,5474
X = anti ln (3,5474) = 34,7219 ppm. y = 14,84ln(x) - 2,643
R² = 0,924
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 100 200 300 400 500 600
%
Inhibisi
Konsentrasi (ppm)
Series1
Diabetes Melitus (DM) adalah penyakit metabolit yang ditandai dengan hiperglikemia, yaitu meningkatnya kadar gula darah yang melebihi kadar normal (80-120 mg/dl), umumnya disebabkan oleh malfungsi sekresi insulin atau kerja insulin yang tidak memadai (Lee 2007). Penderita DM di Indonesia menempati urutan keempat setelah Amerika Serikat, India, dan Cina (Mistra 2004). Oleh karena itu, diperlukan suatu penanganan dan cara pengobatan yang efektif tanpa menimbulkan efek samping yang besar. Salah satu alternatif pendekatan yang dapat dilakukan adalah mencegah hidrolisis karbohidrat menjadi gula sederhana (glukosa) pada usus dengan cara menghambat enzim α-glukosidase, sehingga menghambat peningkatan gula darah pascamakan (postprandial) dan menghambat terjadinya pembentukan radikal bebas dengan antioksidan (Alfarabi 2010). Antioksidan adalah suatu senyawa yang dalam konsentrasi rendah dibandingkan dengan substrat yang dapat teroksidasi, secara signifikan atau mencegah radikal bebas dan menghambat reaksi oksidasi substrat yang dipicu oleh oksigen atau peroksida. Kebanyakan tumbuhan yang mengandung senyawa bioaktif seperti glikosida, alkaloid, terpenoid, dan flavonoid mempunyai aktivitas sebagai antioksidan dan antidiabetes (Suarsana et al. 2008).
Buah andaliman merupakan salah satu jenis rempah yang belum banyak dikenal oleh masyarakat Indonesia. Penelitian mengenai buah tersebut masih sangat terbatas sehingga tidak banyak publikasi atau data ilmiah yang dapat diperoleh (Wijaya 1999). Dari uji fitokimia yang dilakukan oleh Tensiska et al.
(2001), buah andaliman positif mengandung senyawa flavonoid dan polifenol yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan melalui uji antioksidan dengan metode ransimat. Flavonoid juga dilaporkan memiliki aktivitas penghambat terhadap enzimα-glukosidase seperti pada ekstrak metanol tempe (Suarsana et al.
2008). Aktivitas penghambat enzimα-glukosidasedan antioksidan adalah dua hal yang berpengaruh terhadap penyakit diabetes mellitus.
untuk diteliti. Identifikasi komponen aktifnya juga perlu dilakukan dengan spektrofotometer ultraviolet-visible (UV-Vis) dan inframerah (IR).
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini untuk mengidentifikasi senyawa flavonoid buah andaliman sebagai antioksidan dengan metode 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH) dan asam 2,2-azinobis-3-etilbenzatiazolin-6-sulfonat (ABTS), serta aktivitasnya sebagai inhibitor enzim α-glukosidase secara in vitro.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang potensi senyawa flavonoid buah andaliman sebagai antioksidan dan inhibitor α -glukosidase, serta dapat digunakan sebagai salah satu alternatif untuk pengobatan diabetes.
Hipotesis
TINJAUAN PUSTAKA
Diabetes Melitus
Diabetes Melitus salah satu penyakit komplikasi yang sangat berbahaya. Komplikasi yang dapat disebabkan penyakit ini adalah penyakit jantung, koroner, stroke, kebutaan, gagal ginjal, neuropatik, dan luka yang sulit sembuh sampai mengalami pembusukan. Umumnya penyakit ini disebabkan oleh malfungsi sekresi insulin atau kerja insulin yang tidak memadai (resistensi insulin). Hiperglikemia kronis pada penderita diabetes biasanya berhubungan dengan disfungsi/kerusakan sel-sel beta pankreas. Salah satu penyebab kerusakan sel-sel beta pankreas adalah radikal bebas atau infeksi virus (Suarsana et al. 2008).
Menurut Suyono (2002), fungsi organ pankreas ialah sebagai penghasil hormon insulin. Penyakit DM dibagi menjadi dua tipe, yaitu tipe 1 dan tipe 2. Penyakit DM tipe 1 bergantung pada insulin, peningkatan kadar glukosa darah akibat kurangnya kelenjar pankreas mensekresikan hormon insulin. Hormon insulin yang dihasilkan tidak mencukupi untuk mengubah glukosa darah menjadi glukosa intraseluler. Hal ini disebabkan karena sebagian besar sel beta pankreas yang memproduksi insulin mengalami kerusakan sehingga kadar insulin menjadi kurang dan tidak ada. Penyakit DM tipe 2 tidak bergantung pada insulin, jumlah insulin normal bahkan melebihi jumlah batas normal, tetapi jumlah reseptor insulin yang terdapat pada permukaan sel kurang sehingga glukosa ke dalam sel terhambat. Keadaan ini akan menyebabkan meningkatnya kadar glukosa darah dan menurunnya kadar glukosa intraseluler. Penyakit ini disebabkan oleh obesitas, diet tinggi lemak, karbohidrat, dan kurang gerak badan sehingga tidak dapat memproduksi insulin yang menyebabkan kadar gula darahnya naik.
Aktivitas Inhibitor Enzim α-Glukosidase
Enzim ini terlibat dalam degradasi glikogen dengan mengkatalisis hidrolisis residu glukosa yang berikatan α-1,4 pada berbagai substrat dan dihasilkan α -D-glukosa. Enzim α-glukosidase menghidrolisis ikatan α-glukosidik pada oligosakarida dan α-D-glikosida. Enzim tersebut merupakan katalis pada langkah akhir pemecahan karbohidrat (Sou 2000). Inhibitor α-glukosidase menjadi obat umum yang sering digunakan untuk mengontrol postprandial hiperglikemia sejak diperkenalkan tahun 1990-an. Salah satu obat sintetiknya adalah akarbosa yang dapat mengurangi kadar gula dengan mengintervensi penyerapan sari pati dalam usus. Namun, kelemahan penggunaan obat sintetik ini yait dapat menyebabkan efek samping, misalnya kembung, diare, dan k
