Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dimulai dari bulan Juli hingga Desember 2007. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmasi dan Laboratorium Patologi Klinik dan Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Bahandan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain simplisia rimpang kunyit (Curcuma longa Linn.), etanol 96%, hexan, amonia, kloroform, Meyer, pelarut Rx Wagner, metanol, logam Magnesium, NaOH 10%, FeCL3 1%, NaOH 15%, pakan (pelet apung), eter, cairan pengencer (Hayem), cairan pengencer (Turk), larutan HCl 0.01 N dan aquadest steril.
Peralatan yang digunakan antara lain timbangan, sendok tanduk, erlenmeyer, plastik penutup cawan, maserator, batang pengaduk, kertas saring, cawan penguap, oven, evaporator, vacum, corong pisah, mortar, tube tidak berwarna, spatula, tabung reaksi, penangas air, spoit, kandang tikus, skalpel, gunting, pinset, venul jek, tabung kapiler, sentrifuse, mikrohematokrit reader, alat penyumbat tabung kapiler (crestoseal), hemoglobinometer Sahli (hemeometer), pipet tetes (Mohr), gelas objek, cover glass, mikroskop, dan hand counter.
Hewan percobaan
Hewan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah 46 ekor Mencit putih (Mus musculus albinus) jantan dengan berat 20-40 gram, berumur 2 bulan.
Metode Penelitian Ekstraksi
Ekstrak diperoleh dengan cara maserasi sesuai dengan farkmakope Indonesia (1995) dengan menggunakan etanol 96% dan hexan. Satu bagian simplisia rimpang kunyit dimasukkan ke dalam maserator, ditambah 10 bagian etanol 96%, direndam selama 6 jam sekali-kali diaduk sampai homogen dan
kemudian ditutup rapat agar tidak terjadi penguapan dan kontaminasi dari luar, kemudian didiamkan sampai 24 jam. Maserat dipisahkan dan diproses ulang 3 kali (triplo) dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Semua filtrat dikumpulkan dan diuapkan (evaporasi) dengan evaporator hingga diperoleh ekstrak semi padat. Hasilnya kemudian dioven dengan temperatur 40oC hingga diperoleh ekstrak kental. Rendemen yang diperoleh ditimbang dan dicatat.
Rendemen = Berat ekstrak kental x 100% Berat simplisia
Ekstrak kental dilarutkan dengan etanol 96% hingga terbentuk larutan ekstrak. Kemudian ditambahkan larutan hexan (non polar) dengan perbandingan 1:1 dan dimasukkan ke dalam corong pisah. Dikocok dengan kecepatan sedang dan berhati-hati agar tidak terjadi emulsi (busa), sehingga terbentuk dua lapis pelarut. Lapisan di bawah adalah hexan, sedangkan etanol di lapisan atas. Kemudian ditampung secara terpisah. Fraksinasi ini diulangi hingga 3 kali (triplo) agar optimal. Fraksi hexan yang diperoleh dikumpulkan dan diuapkan (evaporasi) dengan avaporator hingga diperoleh ekstrak semi padat. Hasilnya kemudian di oven dengan temperatur 40oC. Rendemen yang diperoleh ditimbang dan dicatat.
Setelah diperoleh ekstrak etanol dan fraksi hexan selanjutnya dilakukan penapisan fitokimia terhadap alkaloid, flavonoid, polifenol, tannin, saponin, dan kuinon. Secara garis besar skema/bagan alur cara ekstraksi rimpang kunyit terlihat pada Gambar 4.
Kunyit
Maserasi ethanol 96% (pelarut polar)
Filtrat etanol Maserat
Diuapkan
Ekstrak kental (etanol)
Fraksinasi hexan (pelarut non polar)
Fraksi hexan
Bahan bioaktif terpilih Bahan bioaktif terpilih
Uji in vitro pada mencit
Penapisan Fitokimia
Dilakukan penapisan fitokimia dari hasil ekstraksi untuk mengetahui kandungan bahan aktif dengan manggunakan metode Harbone (1987) sebagai berikut :
Uji Alkaloid
Serbuk simplisia dibasakan dengan 3 tetes amonia, kemudian ditambahkan kloroform. Filtrat ditambahkan 10 tetes H2SO4 2M. Hasil positif apabila ditambahkan Meyer menjadi endapan putih dan coklat dengan penambahan pelarut Rx Wagner.
Uji Flavonoid
Serbuk simplisia dipanaskan dengan campuran metanol dan logam Magnesium. Adanya flavonoid akan menyebabkan filtrat berwarna merah setelah penambahan 5 tetes NaOH 10%.
Uji Saponin
Serbuk simplisia dipanaskan dengan air dalam tabung reaksi. Kemudian dikocok kuat-kuat selama lebih kurang 30 detik. Pembentukan busa 10 menit kemudian menunjukkan bahwa dalam sampel terdapat saponin.
Uji Tanin
Serbuk simplisia ditambahkan dengan air, kemudian dididihkan. Kepada filtrat ditambahkan larutan 5 tetes FeCL3 1%. Sehingga terbentuk warna biru tua atau hitam kehijauan. Hal ini menunjukkan bahwa sampel tersebut positif mengandung tanin.
Uji Kuinon
Serbuk simplisia ditambahkan air kemudian dididihkan. Kepada filtrat diberi NaOH 15%. Adanya senyawa kuinon ditandai dengan terjadinya warna kuning hingga merah.
Uji Fenol
Serbuk simplisia ditambahkan larutan pereaksi FeCl3 1% sebanyak 5 tetes. Adanya senyawa fenol ditandai dengan terbentuknya warna ungu, biru atau hijau.
Pembuatan Salep
Fraksi etanol rimpang kunyit dan fraksi hexan rimpang kunyit dibuat salep. Satu bagian fraksi etanol rimpang kunyit ditambah dengan empat bagian vaselin kuning. Dihomogenkan di mortar dengan stamphis dan kemudian disimpan dalam tube tidak berwarna yang tertutup. Begitu juga dengan fraksi hexan rimpang kunyit. Salep siap digunakan.
Pengelompokan Mencit
Mencit diadaptasikan selama 10 hari sebelum diberikan perlakuan. Mencit dipelihara dalam kandang plastik yang berukuran 20 x 30 cm. Pada bagian atas kandang ditutup dengan kawat kasa, hal ini bertujuan agar mencit tidak lepas dan aman dari pemangsa namun udara tetap bebas bersirkulasi. Pada bagian dasar diberi serbuk gergaji/sekam untuk menjaga agar suhu tetap optimal. Mencit diberi makan pelet dan minum. Sebanyak 6 ekor mencit digunakan sebagai kontrol sebelum dilakukan perlukaan. Sedangkan 40 ekor mencit lainnya dikelompokkan menjadi 4 kelompok, masing-masing kelompok terdiri atas 10 ekor.
K+ : kelompok kontrol positif, yaitu kelompok mencit yang diberi obat persembuhan luka komersial yang mengandung neomycin sulfat 5%. K- : kelompok kontrol negatif yang tidak diberi sediaan apapun.
P1 : kelompok mencit yang diberi salep ekstrak etanol rimpang kunyit. P2 : kelompok mencit yang diberi salep fraksi hexan rimpang kunyit.
Perlukaan mencit
Perlukaan dilakukan pada punggung mencit dengan membuat sayatan sepanjang ±1.5 cm sejajar os vertebrae dengan menggunakan skalpel steril. Sebelum dilakukan perlukaan, bulu disekitar punggung dicukur dan dibersihkan dengan alkohol.
Pemberian ekstrak terpilih rimpang kunyit
Ekstrak yang terpilih akan diberikan dengan cara mengoleskan pada bagian luka mencit setiap hari. Pemberian ekstrak dilakukan dua kali sehari dari hari ke-1 sampai hari ke-21 pasca perlukaan. Sebagai pembanding digunakan
kontrol negatif yaitu mencit yang tidak diberi sediaan apapun serta kontrol positif yaitu mencit yang diberi obat persembuhan luka komersial yang mengandung neomycin sulfat 5%.
Pengambilan Darah
Pengambilan darah dilakukan pada hari ke-2, 4, 7, 14, dan 21 setelah perlukaan secara intra cardial. Karena volume darah yang diperlukan dalam jumlah banyak, pengambilan darah diperoleh dari jantung. Agar tidak menyakiti hewan sebelum pengambilan darah dilakukan anasthesi. Eter adalah obat paling sering dipakai untuk anasthesi mencit. Eter diberikan dengan cara tetes terbuka, misalnya kapas dibasahi dengan eter diletakkan dalam sebuah piala, hewan dimasukkan dan piala ditutup sampai terjadi anasthesi. Sistem ini mudah dan murah. Mula-mula mencit diletakkan pada punggungnya sesudah dianestesi, bagian dada didesinfeksi, lalu dengan jarum sepanjang 2.5 cm, ukuran 25 (25
gauge) dengan spoit 2 ml, jarum ditusukkan sedikit di belakang cartilago xyphoidea dan sedikit ke bawah dan ke depan sehingga jarum tersebut menusuk jantung. Darah yang telah diambil dengan spoit segera dimasukkan kedalam tabung yang sudah berisi antikoagulan EDTA (Ethylendiamine tetraacetic acid). Kemudian dilakukan pemeriksaan aspek hematologis. Parameter yang diamati adalah jumlah eritrosit, nilai hematokrit, kadar hemoglobin, dan jumlah leukosit. Sampel darah diambil dari 2 ekor mencit dari setiap kelompok perlakuan.
Pemeriksaan Darah
Perhitungan Jumlah Eritrosit (RBC)
Sampel darah dihisap dengan menggunakan pipet eritrosit hingga mencapai tanda tera 0.5 dengan aspirator. Ujung pipet dibersihkan dengan menggunakan tissue, kemudian cairan pengencer (Hayem) dihisap hingga mencapai tanda 101. untuk menghomogenkan, pipet diputar dengan membentuk angka delapan selama tiga menit. Setelah homogen cairan yang tidak terkocok pada ujung pipet dibuang dengan menempelkan ujung pipet pada tissue. Setelah itu dengan hati-hati diteteskan satu tetes ke dalam haemocytometer agar udara tidak masuk. Setelah dibiarkan beberapa saat hingga cairan mengendap,
perhitungan dapat dilakukan. Agar tidak terjadi penghitungan yang berulang (ganda), sebaiknya menggunakan hand counter di bawah mikroskop dengan pembesaran 45x10. Untuk menghitung eritrosit dalam haemocytometer, digunakan kotak eritrosit yang berjumlah 25 kotak dengan mengambil bagian sebagai berikut : satu kotak pojok kiri atas, satu kotak pojok kanan atas, satu kotak di tengah, satu kotak pojok kiri bawah dan satu kotak pojok kanan bawah. Untuk membedakan kotak eritrosit dengan leukosit, luas kotak eritrosit relatif lebih kecil dibandingkan kotak leukosit. Setelah jumlah eritrosit didapatkan maka jumlah darah dikalikan dengan 104, untuk mengetahui jumlah eritrosit dalam 1 µl darah.
Perhitungan Nilai Hematokrit
Sampel darah dimasukkan ke dalam pipa mikrokapiler dengan cara memiringkan venul jek yang berisi sampel darah dengan menempatkan ujung mikrokapiler yang bertanda merah. Pipa mikrokapiler diisi hingga mencapai ⅔
bagian kemudian ujung pipa ditutup dengan crestoseal. Setelah itu pipa mikrokapiler yang telah berisi sampel darah disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Nilai hematokrit dapat dibaca dengan menggunakan
hematokrit reader.
Perhitungan Kadar Hemoglobin
Metode yang digunakan untuk mengetahui kadar hemoglobin dalam penelitian ini adalah metode Sahli. Larutan HCl 0.01 N diteteskan ke dalam tabung sahli hingga mencapai tanda tera 0.1 atau garis batas bawah, kemudian sampel darah dihisap dengan menggunakan pipet sahli hingga mencapai tanda tera atas (2.0 ml). Sampel darah segera dimasukkan ke dalam tabung dan ditunggu selama 3 menit atau hingga berubah warna menjadi cokelat kehitaman akibat reaksi antara HCl dengan hemoglobin membentuk asam hematid. Setelah itu larutan ditambah dengan aquadest sedikit demi sedikit sambil diaduk hingga warna larutan sama dengan warna standar hemoglobinometer.
Perhitungan Jumlah Leukosit (WBC)
Sampel darah dihisap dengan menggunakan pipet leukosit hingga mencapai tanda tera 0.5 dengan aspirator. Ujung pipet dibersihkan dengan menggunakan tissue, lalu cairan pengencer (Turk) dihisap hingga tanda 11. Untuk menghomogenkan, pipet kemudian diputar dengan membentuk angka delapan selama 3 menit. Setelah homogen cairan yang tidak terkocok pada ujung pipet dibuang dengan menempelkan ujung pipet pada tissue. Setelah itu dengan hati-hati satu tetes cairan diteteskan ke dalam haemocytometer agar udara tidak masuk. Setelah dibiarkan beberapa saat hingga cairan mengendap, perhitungan dapat dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 45x10. Agar tidak terjadi penghitungan yang berulang (ganda), sebaiknya menggunakan hand counter. Untuk menghitung leukosit dalam haemocytometer, digunakan kotak leukosit. Jumlah kotak leukosit yang diperoleh dalam penghitngan dikalikan 50 untuk mengetahui jumlah leukosit dalam setiap 1 µl.
Analisa Data
Data yang diperoleh dianalisa menggunakan Analisis Sidik Ragam (ANOVA) dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dan dilanjutkan dengan Uji
Jarak Berganda Duncan (Duncan’s Multiple Range Test) untuk mengetahui perbedaan perlakuan yang ada (Mattjik dan Sumertajaya 1999).