Haptor Posterior
METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2011 sampai Maret 2012 di Laboratorium Helmintologi Bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan dan Laboratorium Bakteriologi Bagian Mikrobiologi Medis, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB.
Alat dan Bahan Penelitian Alat-Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya aquarium berukuran 1 x 0.5 x 0.5 m3, timbangan digital, alas bedah berupa gabus yang dilapisi plastik hitam, seperangkat alat bedah (dissecting kit), cawan petri, pinset, kait, pipet tetes, gunting, botol kaca, spidol, label nama, gelas objek dan kaca penutup, kulkas 4 °C, lap, kaca pembesar, mikroskop cahaya, mikroskop stereo, dan video mikrometer, tabung reaksi, ose, needle, inkubator, dan bunsen.
Bahan-Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya sampel ikan Nila BEST (Oreochromis niloticus) yang diambil bagian insang dan ususnya, NaCl fisiologis, alkohol bertingkat 70%, 85%, 95%, dan 100%, agar Mac Conkey, agar darah, agar nutrien, agar MSA, kaldu MR-VP (Methyl Red- Voges
Proskauer), larutan H2O2 3%, biakan indol, larutan Ehrlich-Bohme, media TSIA,
agar sitrat, agar urea, media gula-gula (maltosa, manitol, laktosa, sukrosa, dan glukosa), kalium hidroksida 10%, pewarna Semichon’s Acetocarmine, entelan,
xylol, pewarna giemsa10%, alkohol, aquades, kristal violet, lugol, safranin, KOH
10%, minyak cengkeh, dan laktofenol.
Metode Penelitian
Pengambilan Sampel Ikan Nila BEST (Oreochromis niloticus)
Pengambilan sampel ikan nila BEST dilakukan dari peternak daerah Parung. Sebanyak 10 ekor sampel ikan diambil secara acak yang memiliki bobot badan
sekitar 200-250 gram. Sampel ikan dimasukkan ke dalam kantong plastik yang telah ditambah air dan oksigen secukupnya. Sampel selanjutnya dimasukan ke dalam aquarium di laboratorium.
Pemeriksaan Cacing Parasitik
Pengambilan Cacing Parasitik dari Insang dan Saluran Pencernaan
Sampel ikan dimatikan terlebih dahulu dengan cara memotong medulla oblongatanya. Ikan kemudian ditimbang dengan timbangan digital. Ikan dibedah dengan cara dibuat sayatan pada bagian ventral ikan. Sayatan dimulai dari operkulum untuk mengeluarkan insang terlebih dahulu kemudian dilanjutkan ke arah posterior sampai arah kloaka untuk mengeluarkan saluran pencernaan (usus). Insang dan saluran pencernaan ikan dipisahkan dari organ tubuh ikan lainnya. Bagian insang dan saluran pencernaan yang digunakan untuk pemeriksaan cacing diletakkan dalam cawan petri yang berisi NaCl fisiologis 0.9%. Saluran pencernaan ikan disayat terlebih dahulu sebelum dimasukkan ke dalam cawan petri berisi NaCl fisiologis 0.9%. Cawan tersebut disimpan dalam kulkas 4 °C minimal 10 jam agar cacing dapat berelaksasi sehingga cacing tersebut lepas dari organ insang dan saluran pencernaan ikan (Soulsby 1982).
Cacing dari insang dan saluran pencernaan di cawan petri dikoleksi dengan menggunakan mikroskop stereo. Cacing yang ditemukan pada kedua organ tersebut dipindahkan ke dalam NaCl fisiologis pada cawan petri yang berbeda. Spesimen yang didapatkan diawetkan dengan alkohol 70% untuk dianalisis lebih lanjut dengan pewarnaan permanen untuk trematoda dan pewarnaan semi permanen untuk nematoda (Yamaguti 1958).
Metode Pewarnaan Cacing Parasitik Pewarnaan Permanen
Spesimen cacing terlebih dahulu direndam dengan pewarnaan Acetocarmine selama 30 menit hingga 3 jam sampai spesimen menyerap warna merah cerah. Larutan Acetocarmine terdiri dari 100 ml aquades dicampur dengan 100 ml asam asetat glasial dan ditambahkan bubuk lithium carmine hingga menjadi jenuh.
19
Larutan tersebut dipanaskan pada suhu 90 °C selama 15 menit dan ditambahkan etanol 70% sebanyak 200 ml.
Spesimen cacing selanjutnya dibilas dengan etanol 70% dan direndam dengan larutan asam alkohol yang merupakan 99 bagian etanol 70% dan 1 bagian HCl selama 5-7 menit hingga menjadi warna merah. Spesimen cacing direndam dengan alkohol bertingkat yaitu etanol 70%, 85%, 95% dan alkohol absolut selama masing-masing 5 menit. Perendaman dengan alkohol bertingkat dilakukan bertujuan untuk dehidrasi. Spesimen cacing dibersihkan dari sisa larutan etanol dengan laktofenol. Selanjutnya, cacing direndam dengan xylol untuk membuat spesimen cacing transparan sehingga memperjelas organ cacing dan direkatkan dengan entelan sebagai media fiksasinya (Yamaguti 1958).
Pewarnaan semi permanen
Pewarnaan struktur morfologi cacing nematoda menggunakan KOH 10% dan minyak cengkeh. Spesimen cacing direndam dalam KOH 10% selama 1-3 menit terlebih dahulu. Perendaman dengan KOH 10% bertujuan untuk menipiskan lapisan kutikula dan epikutikula (tegumen) agar cacing nematoda dapat terlihat transparan. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam wadah yang berisi minyak cengkeh selama 30 detik sampai 1 menit. Selanjutnya, sampel cacing yang sudah diwarnai dimasukkan ke dalam alkohol bertingkat, yakni ke dalam alkohol 70%, 85%, 95%, dan alkohol absolut masing-masing selama 15-30 detik. Cacing kemudian difiksasi dengan entelan (Soulsby 1982).
Identifikasi Cacing Parasitik
Identifikasi cacing parasitik dilakukan setelah pewarnaan selesai. Spesimen cacing diamati dengan menggunakan mikroskop stereo dan video mikrometer serta dilakukan identifikasi cacing parasitik terhadap famili hingga genus.
Pemeriksaan Bakteri Persiapan Bahan
Contoh berupa insang dan digesti dari saluran pencernaan yang berasal dari ikan diambil dan diberi perlakuan. Insang yang berasal dari ikan tersebut diletakan
dalam cawan petri steril, dipotong kecil-kecil dan digerus dalam mortar untuk membebaskan bakteri dari tenunan insang ikan. Saluran pencernaan ikan dibagi menjadi 2 bagian, isi dari saluran pencernaan dimasukkan ke dalam mortar dan digerus. Aquades steril dapat ditambahkan pada gerusan. Suspensi hasil gerusan ditanam di atas media agar darah dan agar Mac-conkey untuk menumbuhkan koloni dengan teknik goresan T. Media yang telah digores kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37 ºC. Pengerjaannya dilakukan secara aseptis.
Isolasi Bakteri
Koloni terpisah yang tumbuh pada agar darah dan agar Mac-Conkey dikarakterisasi berdasarkan morfologis, yaitu ukuran, warna, bentuk, tepi permukaan, dan transparansi. Koloni bakteri yang berbeda diambil dan dibiakkan pada agar nutrient sebagai isolat murni pada suhu 37 °C selama 24-48 jam dan dilakukan pewarnaan Gram untuk mengetahui sifat Gram dan morfologi bakteri. Menurut Lay (1994), teknik pewarnaan Gram yaitu spesimen ditetesi kristal violet selama 1 menit dibilas dengan aquades. Setelah itu, spesimen diberi larutan lugol selama 1 menit dan ditetesi dengan larutan pemucat (alkohol) selama 10-20 detik. Tahap terakhir ialah spesimen ditetesi safranin selama 1 menit dibilas dengan aquades serta dikeringkan.
Identifikasi Bakteri
Pengamatan mikroskopik dengan pewarnaan Gram dilakukan kembali untuk memperjelas bentuk dan sifat Gram dari suatu bakteri. Bakteri yang bersifat Gram positif dengan bentuk batang terbagi menjadi dua, yaitu batang besar memiliki spora dan tidak berspora. Batang berspora secara umum terdiri dari genus
Bacillus sp. (aerob) dan Clostridium (anaerob). Bakteri yang berbentuk batang
yang tidak memiliki spora secara umum dibedakan dengan bakteri yang tahan asam yaitu Mycobacterium dan tidak tahan asam yaitu Corynobacterium dan
Listeria.
Koloni dengan hasil Gram positif yang berbentuk coccus, selanjutnya diuji dengan uji katalase. Katalase adalah enzim yang mengkatalisiskan H2O2 menjadi air dan oksigen. Penentuan adanya katalase diuji dengan penambahan 3% H2O2
21
pada koloni terpisah. Uji ini dilakukan untuk membedakan antara bakteri kelompok Micrococcaceae dan Streptococcaceae (Lay 1994). Kelompok Streptococcaceae bersifat katalase negatif, sedangkan kelompok Microcaccaceae bersifat katalase positif. Bakteri yang bersifat katalase positif akan terlihat pembentukan gelembung udara di sekitar koloni. Reaksi kimiawi yang dikatalisasikan oleh enzim katalase terlihat berikut:
H2O2 Katalase H2O + ½ O2
Bakteri dengan sifat katalase positif selanjutnya dilakukan uji glukosa mikroaerofilik. Hasil negatif uji glukosa mikroarofilik menunjukkan bakteri
Micrococcus, sedangkan hasil positif menunjukkan bakteri Staphylococcus.
Bakteri dengan hasil positif kemudian dilakukan uji pada agar Manitol Salt Agar (MSA) yang mengandung kadar NaCl tinggi, sehingga akan menghambat pertumbuhan bakteri selain Staphylococcus. Media ini terutama digunakan untuk membedakan kelompok Staphylococcus yang berifat patogen dan non-patogen.
S. aureus pada umumnya bersifat patogen dan menghasilkan warna kuning pada
agar. S. epidermidis bersifat tidak patogen dan membentuk zona merah pada agar. Warna kuning disebabkan oleh fermentasi manitol disertai pembentukan asam, sedangkan warna merah disebabkan manitol yang tidak difermentasikan.
Uji Oksidase berfungsi untuk menentukan adanya oksidase sitokrom pada mikroorganisme. Uji ini berguna dalam identifikasi mikroorganisme patogen seperti Neisseria gonoprhoea dan Pseudomonas aeruginosa yang menunjukkan hasil positif terhadap uji oksidase. Reagen uji oksidase terdiri dari 1:1 (vol/vol) laruran 1% alpha-naphtol dan 1% dimetil-p-fenillendiamin oksalat. Tahapan dalam uji oksidase ialah dengan pencampuran koloni terpisah dengan reagen. Hasil oksidase positif ditunjukkan dengan warna koloni yang berubah menjadi hitam setelah 30 menit. Hal ini disebabkan oksidase sitokrom mengoksidasikan larutan reagen (Lay 1994). Hasil uji oksidasi positif dapat dilanjutkan dengan proses identifikasi menggunakan media Triple Sugar Iron Agar (TSIA), indol, MRVP (Methyl Red–Voges proskauer), sitrat, urea, uji fermentasi karbohidrat.
Uji TSIA dilakukan dengan menggunakan Triple Sugar Iron Agar . Media mengandung tiga macam gula yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa, selain itu media juga mengandung indikator merah fenol dan FeSO4 untuk memperlihatkan
pembentukan H2S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam. Konsentrasi glukosa adalah 1/10 dari konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa dapat terlihat. Media TSIA terdiri dari dua bagian yaitu butt (bawah) dan slant (atas). Tahapan uji TSIA yaitu koloni bakteri diambil dengan menggunakan
needle, kemudian ditusukkan pada bagian tengah butt dan langsung dilanjutkan
dengan penggoresan di bagian slant. Setelah itu media diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam (Lay 1994).
Reaksi yang dapat terlihat pada media TSIA adalah bagian butt bersifat asam dan berwarna kuning sedangkan bagian slant bersifat basa dan berwarna merah akibat dari fermentasi glukosa. Keseluruhan media terjadi pembentukan asam sehingga seluruh media berwarna kuning akibat fermentasi laktosa atau sukrosa atau keduanya. Adanya pembentukan gas pada bagian butt sehingga media terpecah akibat pembentukan gas seperti H2 dan CO2. Seluruh media berwarna merah karena ketiga jenis glukosa tidak difermentasikan (Lay 1994).
Uji indol dilakukan dengan menggunakan media indol yang kaya akan triptofan. Koloni bakteri yang telah diambil dengan menggunakan needle ditusukkan ke bagian tengah media kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Reaksi uji indol dilakukan dengan penambahan reagen Erlich-Bohme sebanyak 2-3 tetes dan ditunggu selama 2-3 menit. Hasil uji positif terlihat dengan terbentuknya warna merah pada permukaan media. Media indol berbentuk semi padat sehingga dapat digunakan untuk mengetahui pergerakan bakteri. Bakteri yang bersifat motil terlihat pertumbuhan koloni di sekitar tusukan dan di permukaan media.
Uji Methyl Red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Fermentasi asam campuran ditentukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa dan menambahkan reagens Methyl Red ke dalam kaldu setelah masa inkubasi pada suhu 37 °C selama 24-48 jam. Kaldu biakan akan berubah menjadi merah jika terjadi fermentasi asam campuran, namun kaldu akan tetap berwarna kuning atau jingga jika tidak terjadi fermentasi asam campuran. Uji ini sangat berguna dalam mengidentifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan.
23
Uji Voges Prokauer digunakan untuk mengidentifikasi mikroorgnisme yang memfermentasi 2,3-butanadiol yang mengakibatkan penumpukan bahan dalam pertumbuhan. Penambahan 10 tetes 40% KOH dan 15 tetes 5% larutan alphanapthol dalam etanol dapat menentukan adanya asetoin (asetilmetilkarbinol), yaitu suatu senyawa pemuka dalam sintesis 2,3-butanadiol. Keberadaan asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Hasil reaksi dapat terlihat paling lambat setelah 30 menit. Perubahan warna kaldu biakan akan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi.
Uji sitrat dilakukan dengan menggunakan media Simmon’s citrate yang berbentuk padat dan berwarna hijau. Media sitrat merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, NH4+ sebagai sumber N dan
brom thymol blue sebagai indikator pH. Koloni bakteri yang telah diambil dengan
menggunakan ose kemudian digoreskan pada permukaan media dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24-48 jam. Hasil uji positif diperlihatkan dengan perubahan warna media dari warna hijau menjadi biru. Hal ini menunjukan kemampuan dari bakteri yang diuji dalam menggunakan sitrat dari media sebagai satu-satunya sumber karbon (Lay 1994).
Uji urea dilakukan dengan menggunakan media urea yang berbentuk padat dan berwarna merah-jingga. Koloni bakteri digoreskan pada permukaan media dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Hasil uji positif terlihat dengan perubahan warna media dari merah-jingga menjadi merah-ungu karena terjadinya proses hidrolisis urea (Lay 1994).
Uji fermentasi karbohidrat dilakukan dengan menggunakan media kaldu karbohidrat yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol yang mengandung indikator merah fenol dan di dalam tabung terdapat tabung durham sebagi indikator pembentukan gas. Koloni bakteri yang telah diambil dengan menggunakan ose diinokulasi ke dalam media kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24-48 jam. Hasil positif uji fermentasi karbohidrat diperlihatkan dengan perubahan warna media dari merah menjadi kuning. Pembentukan gas dapat terlihat dengan adanya gelembung gas pada tabung durham.
Diagram Alir Pemeriksaan Bakteri
Sampel digerus
Pewarnaan Gram
Agar darah Agar Mac Conkey Koloni terpisah
Isolat Murni pada agar nutrient
Pewarnaan Gram
Positif (+) Negatif (-)
Coccus Batang Batang Coccus
Uji Oksidase Neisseria
Negatif (-) Positif berspora tidak berspora
Enterobactericeae Non-enterobacteria
Aerob Anaerob
Bacillus sp. Clostridium sp.
Fermentasi Laktosa (Agar Mac-Conkey) TSIA Katalase Indol MRVP Sitrat (+) (-) Urea Fermentasi Karbohidrat Microcaccaceae Streptococcaceae.
Uji glukosa mikroaerofilik Tahan asam Tidak tahan asam
Mycobacterium Corynebacterium Listeria Erysipilothrix (-) (+) Micrococcus Staphylococcus MSA (+) (-) S. aureus S. epidermidis