Metode yang digunakan adalah metode eksperimental meliputi pengumpulan sampel, pemeriksaan golongan saponin, golongan steroid/triterpen, pembuatan ekstrak, isolasi senyawa sapogenin dari ekstrak, analisis senyawa sapogenin secara KLT, pemisahan senyawa sapogenin dengan cara KLT preparatif, uji kemurnian senyawa sapogenin hasil isolasi dengan KLT dua arah serta identifikasi isolat secara spektrofotometri UV, IR dan MS.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: alat-alat gelas laboratorium, elektromantel (EM 2000), hair-dryer, lampu UV 366 nm (Dessaga), neraca analitik (Vibra AJ), neraca kasar (Salter AND), oven listrik (Strok), penangas air (Yenaco), seperangkat alat kromatografi lapis tipis (Dessaga), spektrofotometer ultraviolet (Shimadzu mini 1240), spektrofometer inframerah (Shimadzu) dan spektrometri massa (Shimadzu QP2010S).
3.2 Bahan-bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah hewan teripang segar (mentimun laut) genus Stichopus.
Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain berkualitas pro analisa (E. Merck) yaitu asam klorida pekat, asam asetat anhidrat, asam sulfat pekat, etil asetat, n-heksan, kalium fosfat monobasa, kloroform, metanol, natrium hidroksida, toluen, plat pra lapis silika gel GF254,. Etanol 95 % hasil destilasi dan air suling laboratorium.
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel 3.3.1 Pengumpulan Sampel
Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain, sampel yang digunakan adalah hewan teripang segar yang berasal dari perairan Sabang, Aceh.
3.3.2 Identifikasi Hewan
Identifikasi hewan teripang dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi (Puslit Oseanografi Lipi), Jakarta. Hasil identifikasi hewan dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 38.
3.3.3 Pengolahan Sampel
Sampel yang digunakan adalah hewan teripang segar, dimana banyaknya sampel yang diperiksa adalah satu ekor teripang segar dengan berat 1,2 kg. Cara pengolahan:
1. Pencucian
Hewan teripang dibersihkan dari kotoran dengan cara mencucinya dibawah air mengalir hingga bersih, ditiriskan kemudian ditimbang beratnya. Beratnya adalah 1,2 kg.
2. Pengeluaran isi perut
Isi perut dan air dalam tubuh hewan teripang segar dikeluarkan dengan cara memijat-mijat hingga isi perut dan air dapat keluar melalui anus dan tubuh teripang menjadi gepeng. Ditiriskan lalu ditimbang, diperoleh berat 1,18 kg. Kemudian dipotong-potong dengan ukuran ± 5x5 cm, dan dikeringkan.
3. Pengeringan
Setelah isi perut dikeluarkan, kemudian teripang dikeringkan di dalam lemari pengering selama 2 minggu sampai kadar air yang ada dalam tubuh teripang berkurang.Teripang yang sudah kering disebut simplisia hewan. Simplisia lalu diperkecil potongannya dan ditimbang, diperoleh berat 48 g. Sebelum digunakan disimpan dalam wadah plastik kedap udara dan terlindung dari cahaya.
3.4 Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Medan.
3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik hewan teripang segar, makroskopik simplisia dan penetapan kadar air.
3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap hewan teripang segar dan simplisia dengan cara mengamati warna, bentuk, bau dan ukuran hewan teripang segar dan simplisia. Gambar teripang segar dan simplisia dapat dilihat pada
lampiran 2 dan 3 halaman 39 dan 40.
3.5.2 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi (Destilasi Toluen). Alat-alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung penyambung, tabung penerima 5ml.
a) Penjenuhan toluen
Sebanayak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan kedalam labu alasbulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,01 ml.
b) Penetapan kadar air simplisia
Cara kerja :
Kedalam labu yang berisi toluen jenuh di atas dimasukkan 5 g simplisia yang telah ditimbang seksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit, setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen, destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang di dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen (Depkes, 1979). Hasil dapat dilihat dalam pembahasan halaman 32.
3.6 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.6.1 Larutan Asam Klorida 2 N
Sebanyak 17 ml larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga 100 ml (Depkes, 1979).
3.6.2 Larutan Kalium Fosfat Monobasa0,2 M
Sebanyak 2,72 g kalium fosfat monobasa dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml (Depkes, 1979).
3.6.3 Larutan Natrium Hidroksida 0,2 N
Sebanyak 800 mg natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml (Depkes, 1979).
3.6.4 Larutan Dapar Fosfat pH 7,4
Sebanyak 50 ml kalium fosfat monobasa 0,2 M dicampurkan dengan 39,1 ml natrium hidroksida 0,2 N, lalu diencerkan dengan air suling hingga 200 ml (Depkes, 1979).
3.6.5 Larutan Liebermann-Burchard (LB)
Diambil 20 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat. Larutan penyemprot sebanyak 5 ml asam asetat anhidrat dengan 5 ml asam sulfat pekat, kemudian campuran dimasukkan kedalam 50 ml etanol 95%. Pengerjaan dilakukan dalam kondisis dingin dan pereaksi dibuat baru (Depkes RI, 1995).
3.7 Pemeriksaan Senyawa Saponin 3.7.1 Uji Busa
Sebanyak 0,5 g simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1 cm sampai 10 cm dan dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N, buih tidak hilang (Depkes RI, 1995).
3.7.2 Uji Hemolisis Darah
Sebanyak 0,5 g simplisia dicampur dengan 50 ml larutan dapar fosfat pH 7,4, dipanaskan sebentar, kira-kira pada suhu 100 0C selama 10 menit, didinginkan lalu disaring. Kemudian 1 ml filtrat dicampur dengan 1 ml suspensi darah dan
didiamkan selama 30 menit. Terjadinya hemolisis total menunjukkan adanya saponin yang ditandai dengan terbentuknya lapisan bening di bagian tengah larutan (Ditjen POM, 1995).
3.7.3 Uji Warna dengan Pereaksi Liebermann-Burchard (LB)
Sebanyak 0,5 g simplisia ditambahkan 10 ml etanol, kemudian dimasukkan asam klorida 2 N, selanjutnya larutan direfluks selama 10 menit dan disaring dalam keadaan panas. Filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling, setelah dingin ditambahkan 10 ml n-heksan, dikocok hati-hati dan dibiarkan memisah. Lapisan n-heksan diambil dan diuapkan pada cawan penguap. Pada sisa ditetesi 20 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi LB). Hasil positif adanya saponin bila memberikan warna hijau, biru, merah, merah muda atau ungu (Farnsworth, 1966).
3.8Pembuatan Ekstrak
Cara kerja :
Sebanyak 40 g teripang kering yang telah dipotong - potong kecil, dimasukkan ke dalam wadah gelas, lalu sebanyak 400 ml etanol 95% dituang ke dalam wadah gelas (maserator), sesekali diaduk-aduk selama 6 jam, ditutup dan didiamkan selama 24 jam. Setelah 24 jam, disaring, filtrat ditampung kemudian perlakuan yang sama diulangi kembali sampai tiga kali perlakuan. Filtrat yang sudah ditampung digabung dijadikan satu. Hasil terakhir di evaporasi dengan menggunakan rotari evaporator sampai diperoleh ekstrak kental (Badan POM, 2004). Bagan pembuatan ekstrak dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 41.
3.9 Analisis ekstrak etanol dengan cara KLT
Terhadap ekstrak etanol teripang dilakukan analisis dengan KLT menggunakan fase diam: plat pra lapis silika gel GF254, fase gerak: n-heksan – etil asetat dengan perbandingan (90:10), (80:20), (70:30), (60:40), (50:50) dengan penampak bercak pereaksi LB.
Cara kerja:
Ekstrak etanol teripang ditotolkan pada plat pra lapis silika gel GF254, setelah kering plat dimasukkan ke dalam masing-masing bejana yang telah jenuh dengan uap pengembang, kemudian dikembangkan sampai jarak 1 cm dari tepi atas plat. Plat dikeluarkan, dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi LB. Lalu plat dipanaskan pada suhu 110 0C selama 10 menit (Gritter, 1991).
Perubahan warna yang terjadi diamati dan harga Rf dihitung. Kromatogram hasil KLT dapat dilihat pada lampiran 6 halaman 43.
3.10 Isolasi senyawa sapogenin dari ekstrak etanol
Cara kerja:
Sebanyak 10 g ekstrak etanol teripang ditambahkan asam klorida 2 N. Kemudian ekstrak dihidrolisis dengan cara merefluksnya selama ± 6 jam, selanjutnya filtrat diekstraksi dengan kloroform sebanyak 3 kali. Aglikon sapogenin berada dalam lapisan kloroform. Ekstrak kloroform hasil hidrolisis digabung dan dipekatkan (Harbone, 1987). Bagan isolasi senyawa sapogenin dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 41
3.11 Analisis ekstrak kloroform dengan cara KLT
Terhadap ekstrak kloroform teripang dilakukan analisis dengan KLT menggunakan fase diam: plat pra lapis silika gel GF254, fase gerak: kloroform -
toluen dengan perbadingan (90:10), (80:20), (70:30), (60:40), (50:50) dan fase gerak n-heksan – etil asetat dengan perbandingan (90:10), (80:20), (70:30), (60:40), (50:50) dengan penampak bercak pereaksi LB.
Cara kerja:
Ekstrak kloroform teripang ditotolkan pada plat pra lapis silika gel GF254, setelah kering plat dimasukkan ke dalam masing-masing bejana yang telah jenuh dengan uap pengembang, kemudian dikembangkan sampai jarak 1 cm dari tepi atas plat. Plat dikeluarkan, dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi LB. Lalu plat dipanaskan pada suhu 110 0C selama 10 menit (Gritter, 1991).
Perubahan warna yang terjadi diamati dan harga Rf dihitung. Kromatogram hasil KLT dapat dilihat pada lampiran 7 dan 8 halaman 44 dan 45.
3.12 Pemisahan Senyawa Sapogenin teripang dengan KLT preparatif
Terhadap ekstrak kloroform dilakukan pemisahan dengan KLT preparatif menggunakan fase diam: silika gel GF254, fase gerak: kloroform - toluen (70:30) dan penampak bercak pereaksi LB.
Cara Kerja:
Ekstrak kloroform teripang ditotolkan berupa pita pada plat KLT berukuran 20 x 20 cm, setelah kering, plat dimasukkan ke dalam bejana yang telah jenuh dengan uap pengembang. Kemudian dikembangkan sampai jarak 1 cm dari tepi atas plat, plat dikeluarkan dan dikeringkan. Pada sisi kiri dan kanan plat disemprot dengan pereaksi LB dan dipanaskan dengan bantuan hair-dryer hingga diperoleh bercak yang jelas. Bagian plat silika yang sejajar dengan bercak yang memberikan reaksi positif dengan pereaksi LB dikerok kemudian dilarutkan dengan pelarut metanol (Hostettmann, 1995).
Filtrat disaring, diuapkan pelarut metanolnya kemudian disimpan ke dalam lemari pendingin. Kromatogram hasil KLT preparatif dapat dilihat pada lampiran 9 halaman 46.
3.13 Analisis senyawa hasil isolasi dengan KLT
Terhadap senyawa hasil isolasi dilakukan analisis dengan KLT menggunakan fase diam: plat pra lapis silika gel GF254, fase gerak: kloroform-toluen (70:30) dan penampak bercak pereaksi LB.
Cara kerja:
Senyawa hasil isolasi dengan KLT preparatif ditotolkan pada plat pra lapis silika gel GF254, setelah kering plat dimasukkan ke dalam bejana yang telah jenuh dengan uap pengembang, kemudian dikembangkan sampai jarak 1 cm dari tepi atas plat. Plat dikeluarkan, dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi LB. Lalu plat dipanaskan pada suhu 110 0C selama 10 menit (Gritter, 1991). Kromatogram hasil KLT dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 47.
3.14 Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dengan KLT dua arah
Terhadap senyawa hasil isolasi dilakukan uji kemurnian dengan KLT dua arah menggunakan fase diam: plat pra lapis silika gel GF254, fase gerak I: kloroform-toluen (70:30) dan fase gerak II: kloroform-metanol (30:70) sebagai penampak bercak pereaksi LB.
Cara kerja:
Senyawa hasil isolasi dengan KLT preparatif ditotolkan pada plat silika, setelah kering dimasukkan ke dalam bejana yang telah jenuh dengan uap pengembang, dan dikembangkan dengan larutan pengembang I sampai jarak 1 cm dari tepi atas plat, kemudian plat dikeluarkan dan dikeringkan. Plat diputar 90o
dan dikembangkan kembali dengan larutan pengembang II sampai jarak 1 cm dari tepi atas plat. Plat dikeluarkan, dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi LB. Lalu plat dipanaskan pada suhu 110 0C selama 10 menit (Gritter, 1991). Kromatogram hasil KLT dapat dilihat pada lampiran 11 halaman 48.
3.15 Identifikasi Isolat
3.15.1 Identifikasi isolat dengan spektrofotometer ultra violet
Cara kerja:
Isolat hasil isolasi dilarutkan dalam pelarut metanol, kemudian dimasukkan kedalam kuvet yang telah dibilas dengan larutan sampel. Selanjutnya absorbansi larutan sampel diukur pada panjang gelombang 200-400 nm (Noerdin, 1985). Spektrum ultraviolet dari isolat dapat dilihat pada lampiran 12 halaman 49.
3.15.2 Identifikasi Isolat dengan Spektrofotometer Inframerah
Cara kerja:
Isolat hasil isolasi digerus halus kemudian ditambahkan KBr, dihaluskan. Campuran dimasukkan kedalam alat pellet die dihubungkan dengan alat pompa vakum dan penekan hidrolik 10 menit (tekanan 10000 – 15000 pound per inci). Pompa vakum dimatikan, pellet die dilepaskan dari pompa hidrolik, kemudian pellet KBr dikeluarkan. Pellet KBr ditempatkan pada pemegang cuplikan (sell holder) (Noerdin, 1985). Spektrum inframerah dari isolat dapat dilihat pada
3.15.3 Karakterisasi isolat dengan spektrometri massa (MS)
Cara kerja:
Identifikasi isolat secara kromatografi gas-spektrofotometri massa dilakukan dengan cara melarutkan isolat dengan pelarut n-hexan kemudian dimasukkan melalui tempat penyuntikan kedalam suatu aliran gas pembawa pada pangkal kolom dalam bentuk uap dan mengalami proses pembagian antara fase gas dan fase tidak bergerak. Hasil pemisahan kromatografi gas difragmentasi oleh detektor MS sehingga diperoleh fragmen-fragmen pada spektrum. Spektrum massa dapat dilihat pada lampiran 14 dan 15 halaman 51 dan 52.
BAB IV