3.1. Desain Penelitian
Penelitian ini bersifat eksperimental dengan lebih dari 2 kelompok perlakuan, dan dilakukan secara berpasangan. Pengambilan sampel nyamuk dilakukan secara purposive sampling yang memenuhi kriteria sampel terpilih. Analisa statistik dilakukan untuk mengetahui tentang efikasi Bti pada beberapa konsentrasi berbeda terhadap kematian larva instar III/IV nyamuk Cx. quinquefasciatus serta nilai LC50 dan LC90 dari
larvisida tersebut.
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian
Pengambilan sampel yang berupa telur dan larva nyamuk Cx. quinquefasciatus dilakukan pada bulan April 2015 di wilayah Bekasi dari tempat perindukan nyamuk tersebut yaitu air got/selokan. Pemeliharaan nyamuk, identifikasi, serta pengujian sampel dilakukan bulan April-Juni 2015 di Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.3. Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1. Populasi Penelitian
Populasi dalam penelitian ini berupa koloni larva Cx.
quinquefasciatus instar I sampai IV yang dipelihara dalam wadah berisi media air got.
3.3.2. Besar Sampel Penelitian
Dalam menentukan banyaknya sampel dalam setiap konsentrasi, maka digunakan rumus Federer, yaitu: 33
Keterangan: n = besar sampel
t = jumlah kelompok perlakuan
Pada penelitian ini, digunakan 1 kelompok kontrol dan 5 kelompok yang diberi larvasida Bti dengan konsentrasi berbeda. Berdasarkan rumus tersebut, maka didapatkan banyaknya sampel yang digunakan adalah: (n-1) (t-1) ≥ 15 (n-1) (5-1) ≥ 15 (n-1) 4 ≥ 15 4n –4 ≥ 15 4n ≥ 19 n ≥ 4.75
Minimal sampel yang digunakan adalah 5 ekor larva, sedangkan jumlah sampel yang diuji pada penelitian ini untuk setiap konsentrasi adalah 25 ekor larva.34 Larva yang memenuhi kriteria inklusi yaitu telah
mencapai instar III/IV serta masih hidup yang ditandai dengan larva yang bergerak aktif ketika diberi rangsangan, selanjutnya di ambil secara acak dengan menggunakan pipet dari wadah perindukannya di laboratorium. Kemudian larva tersebut ditempatkan pada wadah yang telah berisi larutan Bti dengan berbagai konsentrasi sebagai perlakuan, dan wadah yang hanya berisi air keran (tap water) sebagai kontrol.
Perlakuan dilakukan selama 24 jam. Pencatatan jumlah larva yang mati dilakukan saat 24 jam setelah perlakuan. Jumlah pengulangan dalam setiap perlakuan adalah 4 kali.
3.3.3. Kriteria Sampel
1. Kriteria inklusi
18
Larva yang masih hidup ditandai dengan larva yang bergerak aktif ketika diberi rangsangan.
Berasal dari filial atau keturunan yang umurnya sama.
Larva diberi perlakuan pakan dan media rearing yang sama.
2. Kriteria eksklusi
Larva yang sudah berubah menjadi pupa.
Larva yang tidak sehat dan cacat.
3.4. Variabel Penelitian
a. Variabel independen (bebas) : konsentrasi larutan larvasida Bti. Pada penelitian ini dibuat rentang konsentrasi sebesar 0, 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, dan 0.08 mg/L.
b. Variabel dependen (terikat) : kematian larva instar III/IV setelah 24 jam.
Pada penelitian ini, dihitung berapa jumlah larva yang mati setelah mendapat perlakuan berupa pemberian larvasida Bti dengan berbagai konsentrasi pada media hidupnya di dalam wadah.
c. Variabel luar terkendali:
Umur larva yaitu larva instar III/IV.
Pakan larva.
Ph dan salinitas air.
Suhu ruangan tempat rearing nyamuk.
d. Variabel luar tidak terkendali:
Kondisi biologis larva.
Kontaminan lingkungan dalam media tumbuh larva.
Kualitas larvasida dan pelarutnya.
3.5. Alat dan Bahan 3.5.1. Alat
Kandang nyamuk, pipet tetes, mikropipet, gelas plastik, neraca digital, pH meter, nampan plastik, pengaduk, beaker glass, gelas ukur,
penyaring, label, termometer, dan mikroplat ELISA Foto alat dan bahan dilampirkan pada lampiran 2.
3.5.2. Bahan
Larva Cx. quinquefasciatus instar III/IV, Vectobac WG (Bahan aktif: Bacillus thuringiensisisraelensis), air aquadest sebagai pelarut, pelet ikan sebagai pakan larva, air gula sebagai pakan nyamuk dewasa dan bahan uji esterase: larutan phosphat buffer saline (PBS) 0,02 M, coupling reagen, α-naftil asetat dan asam asetat 10%.
3.6. Cara Kerja Penelitian
3.6.1. Persiapan dan Pengumpulan Larva Cx. quinquefasciatus
Telur dan larva diambil dari got di daerah Bekasi untuk dipelihara (rearing) di lab Parasitologi FKIK UIN Jakarta. Telur dan larva diletakan dalam wadah yang berbeda. Larva dipisahkan dari kotoran air got menggunakan saringan dan diletakkan didalam wadah yang berisi air keran setinggi 2/3 dari tinggi wadah. Larva diberi makan berupa pelet ikan setiap 2-3 hari sekali, diberikan secukupnya untuk mencegah pertumbuhan bakteri yang dapat membuat larva mati. Setelah itu, dalam waktu 3-5 hari, larva instar I tumbuh menjadi larva instar III/IV dengan panjang 4-6 cm. Larva instar III/IV inilah yang menjadi sampel penelitian ini, Sebelum dilakukannya uji pendahuluan, sampel larva instar III/IV diidentifikasi terlebih dahulu dibawah mikroskop. (Lihat lampiran 2).
3.6.2. Uji Pendahuluan
a. Uji resistensi enzim esterase dengan metode Lee.
Jentik nyamuk instar IV awal digerus untuk dibuat homogenat.
Dilarutkan dengan 0,5 ml larutan PBS 0,02 M.
50 µL homogenat dipindahkan ke sumur mikroplat dengan menggunakan mikropipet.
Setiap sumuran ditambahkan 50 µL bahan substrat α-naftil asetat dan biarkan selama 60 detik.
20
Setiap mikroplat ditambahkan 50 µL bahan coupling reagen.
Setelah reaksi berlangsung 10 menit, warna merah berubah menjadi biru.
Ditambahkan 50 µL asam asetat 10% pada setiap sumuran.
Kemudian dibaca dengan ELISA reader dengan panjang
gelombang 450 nm.
b. Uji efikasi Bti
Vectobac WG (Bti) ditimbang dengan neraca digital sebanyak 200 mg dan dicampur aquadest sebanyak 20 ml sehingga menghasilkan larutan induk sebesar 1% atau 10.000 ppm. Larutan induk diencerkan hingga menghasilkan 10 ppm. Ambil larutan tersebut dengan menggunakan mikropipet 100 µ L, 200 µ L, 400 µ L, 600 µ L, dan 800 µ L. Masing-masing ditambahkan ke dalam gelas plastik berisi aquadest sebanyak 100 ml sehingga diperoleh larutan sebesar 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, dan 0.08 mg/L. (Lihat lampiran 2).
Pada masing-masing gelas plastik diberikan 25 ekor larva instar III/IV tanpa diberikan makan/pelet ikan. Kemudian setelah 24 jam perlakuan, dihitung jumlah larva yang mati. Larva yang sudah mati kemudian disaring dan digerus sebelum dibuang.
Sisa larva hidup yang tidak digunakan untuk pengujian, kemudian dibiarkan menjadi nyamuk dewasa untuk digunakan dalam uji bioassay rekan peneliti lainnya.
3.7. Pengumpulan dan Manajemen Data
Larva instar III/IV yang telah diberikan perlakuan, kemudian dihitung larva yang hidup dan yang mati setelah 24 jam perlakuan. Larva yang hidup ditandai dengan ciri-ciri yaitu larva bergerak ketika diberi rangsangan dengan menggunakan lidi serta aktif berenang didalam air, sedangkan larva yang telah mati adalah larva yang tidak bergerak ketika diberi rangsangan dan tenggelam di dasar gelas plastik.
Jumlah larva yang mati dihitung dan dicatat untuk setiap perlakuan. Pengulangan dilakukan sebanyak 4 kali untuk setiap perlakuan serta kontrol. Data yang diperoleh kemudian dimasukkan dalam program excel dan diolah serta dianalisis dalam program SPSS 21.0 (Lihat lampiran 2)
3.8. Analisis Data
Data yang diperoleh akan diolah dan dianalisis menggunakan analisis Probit untuk menentukan efikasi larvasida terhadap kematian larva nyamuk yang dinyatakan dengan nilai konsentrasi yang menyebabkan kematian 50% dan 90% (LC50 dan LC90).
Selain itu juga dilakukan uji parametrik One Way ANOVA untuk melihat pengaruh perlakuan antar kelompok terhadap kematian larva, dan regresi linier untuk mengukur derajat hubungan antara konsentrasi larvasida (X) dan kematian larva (Y), yang dinyatakan dengan nilai persentase dari r2 (sebagai koefisien korelasi).35
3.9. Alur Penelitian
Penelitian menggunakan 5 kelompok perlakuan yang diberikan larvasida Bti dan 1 kelompok kontrol tanpa diberikan larvasida tersebut. Pengulangan dilakukan sebanyak 4 kali. Berikut ini adalah alur penelitiannya:
22
Alur Penelitian Telur dan larva yang.
diambil dari got
Larva Culex quinquefasciatus instar
III/IV (panjang 5-6 mm) dipindahkan dalam gelas plastik
Masing-masing kelompok berisi 25 larva Culex
quinquefasciatus
Kelompok 1: Larvasida Bti 0% Kelompok 2: Larvasida Bti 0.01 mg/L Kelompok 3: Larvasida Bti 0.02 mg/L Kelompok 4: Larvasida Bti 0.04 mg/L Kelompok 5: Larvasida Bti 0.06 mg/L Kelompok 6: Larvasida Bti 0.08 mg/L
Rearing larva di laboratorium
Pengulangan percobaan sebanyak 4 kali di setiap
konsentrasinya
Analisis Probit Analisis Data Dihitung jumlah larva yang
mati setiap 24 jamnya Perlakuan selama 24 jam dalam air yang telah diberi
larvasida dalam berbagai konsentrasi
Regresi Linier Uji One Way
ANOVA Menentukan lethal concentration (LC 50% dan LC 90%) Laporan Penelitian
23
BAB IV