Waktu dan tempat
Penelitian ini dilaksanakan di rumah kaca Laboratorium Ekologi Hutan dan Laboratorium Silvikultur Fakultas Kehutanan IPB. Percobaan dilaksanakan pada bulan Juni 2005 sampai Juni 2006.
Bahan yang digunakan adalah benih Pueraria javanica, benih jati Muna (Tectona grandis L.f.), inokulum CMA jenis Glomus etunicatum terse leksi (eksotik) dengan kode NPI 126 (diperbanyak dari inokulum mycofer) di Laboratorium Silvikultur, inokulum CMA jenis Glomus sp. (endogenous) yang diisolasi dari bawah tegakan jati Muna (koleksi laboratorium Agronomi Fakultas Pertanian UNHALU Kendari) , vermikompos, zeolit, tanah Latosol, KOH 25%, HCl 2% (0,1 N), trypan blue, asam laktat, glyserol, larutan PVLG dan melzer, hyponex merah, gelas plastik berwarna, dan polibag.
Alat-alat yang digunakan adalah saringan spora (63µm, 125µm, 250µm , dan 500 µ m), pinset spora, sentrifuse, timbangan analitik, oven, mikroskop binokuler Nikon YS100, mikroskop stereo binokuler Carton NSWT , Mikroskop Monookuler FCL 15 EX-N, kaca obyek dan gelas penutup.
Metode Penelitian
Penelitian terdiri dari dua tahap yang dilakukan secara berurutan yaitu :
Perbanyakan inokulum CMA
Media zeolit yang digunakan untuk mengecambahkan benih tanaman inang dicuci terlebih dahulu, disterilkan kemudian dimasukkan pada bak kecambah. Benih inang P. javanica direndam dengan klorox 5% selama ± 5 menit kemudian dicuci sampai bersih dengan air mengalir. Perendaman benih dengan air panas selama ± tiga menit kemudian dengan air dingin selama 24 jam. Selanjutnya benih dikecambahkan selama ± satu minggu atau sampai muncul 2 helai daun. Menyiapkan media tanam zeolit dan mencampur dengan vermikompos sesuai formulasi yang telah ditentukan. Media dimasukkan ke dalam gelas plastik berwarna yang sebelumnya telah dilubangi dibawahnya dan dilapisi lagi dengan gelas berisi zeolit yang tidak dilu bangi, berfungsi sebagai tempat air bagi kultur. Membuat lubang pada tengah media dan mengisi dengan inokulum sebanyak 10 g, kemudian tanaman P. javanica yang telah memiliki 2 - 3 helai daun dipindahkan dengan hati-hati, setelah itu lubang tadi ditutup kembali dengan zeolit. Penyiraman dilakukan setiap hari dan disesuaikan dengan kebutuhan tanaman. Khusus perlakuan tanaman inang dengan inokulasi CMA tanpa vermikompos pemberian larutan hara hyponex merah (25-5-20)
dilakukan seminggu sekali dengan konsentrasi 1 g/l air dan dibe rikan sebanyak 5 ml. Kultur disusun sesuai layout penelitian kemudian dipelihara selama tiga bulan di rumah kaca. Pemeliharaan kultur seperti penyiraman, penyiangan gulma dan pengendalian hama dilakukan secara manual. Setelah kultur berumur tiga bulan sejak inokulasi maka dilakukan pengecekan untuk mengetahui pertumbuhan dan perkembangan spora dan dilakukan pengeringan untuk merangsang pembentukan spora lebih banyak.
Gambar 2. Perbanyakan inokulum CMA menggunakan tanaman inang P. javanica selama tiga bulan di rumah kaca
Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan percobaan faktorial dengan RAL menggunakan 2 faktor perlakuan. Faktor pertama yaitu jenis inokulum CMA yang terdiri dari tiga taraf : 1) tanpa inokulasi CMA (Mo), 2) inokulasi CMA jenis G. etunicatum (Mb) dan 3) inokulasi CMA jenis Glomus sp. (Mk). Faktor kedua adalah formulasi media dengan vermikompos terdiri dari K0 (100% zeolit), K1 (90% zeolit dicampur 10% vermikompos), K 2 (80% zeolit dicampur 20% vermikompos), K3 (70% zeolit dicampur 30% vermikompos), dan K4 (60% zeolit dicampur 40% vermikompos). Setiap kombinasi perlakuan diulang 3 kali dan setiap unit percobaan terdapat 5 pot kultur sehingga didapat 225 pot kultur. Adapun model statistik yang digunakan adalah
Yijk = µ + Mi + Kj + (MK )ij + eijk Keterangan :
Yijk = Nilai pengamatan pada faktor M (jenis inokulum) taraf ke i, faktor K
µ = Komponen aditif dari rataan
Mi = Pengaruh utama faktor M (jenis inokulum) pada taraf ke i
Kj = Pengaruh utama faktor K (formulasi media ) pada taraf ke j
(MK)i j = Komponen interaksi dari faktor M (jenis inokulum) pada taraf ke i
dan faktor K (formulasi media ) pada taraf ke j eijk = Pengaruh acak yang menyebar normal (0,s2)
(Mattjik dan Sumertajaya 2002)
Peubah yang diamati meliputi kolonisasi akar dan jumlah spora. Kolonisasi akar diukur berdasarkan keberadaan struktur CMA dalam akar, struktur CMA dapat dilihat dibawah mikroskop setelah dilakukan pewarnaan dengan trypan blue menggunakan metode Phillips dan Hayman (1970) yang dimodifikasi. Proses pewarnaan akar yaitu sampel akar dicuci bersih dari sisa- sisa tanah, merendam sampel akar dengan larutan KOH 2,5% selama 24 jam atau sampai akar kelihatan putih dan jernih, kemudian sampel akar dicuci bersih untuk menghilangkan larutan KOH, merendam dalam larutan HCl 2% (0,1 N) selama 24 jam dan membuang kelebihan HCl, selanjutnya merendam dengan larutan trypan blue 0,05% (campuran larutan asam gliserol, asam laktat, dan aquades) selama 24 jam.
Perhitungan kolonisasi akar dilakukan dengan cara mengambil secara acak potongan-potongan akar yang telah diwarnai sepanjang 1 cm, dan menyusun pada kaca obyek sebanyak 10 potongan akar, kemudian mengulangi sampai mendapatkan tiga preparat kaca obyek. Mengamati kolonisasi CMA dengan tiga bidang pandang dan mencatat total bidang pandang potongan akar yang terkolonisasi CMA dari 10 potongan akar tersebut. Selanjutnya persentase akar yang dikolonisasi CMA dihitung berdasarkan rumus :
% Kolonisasi CMA =
_ _ _ _ _
_ _ _
Jumlah bidang pandang yang terkolonisasi CMA
Jumlah total bidang pandang X 100%
(Rajapakse dan Miller 1992).
Menghitung jumlah spora pada akhir pengamatan setelah proses pengeringan tanaman inang selama seminggu. Pemisahan spora dilakukan dengan metode tuang saring basah (Brundrett 1994), yaitu mengambil sebanyak
20 g sampel inokulum pada pot kemudian disaring dengan memakai saringan 63µ m, 125µ m, dan 250µ m. Saringan disusun dari ukuran terbesar hingga terkecil. Kemudian spora hasil saringan 63µm dipisahkan pada cawan plastik dan dilakukan perhitungan spora dibawah mikroskop stereo binokuler carton NSWT.
Peubah pertumbuhan yang diamati sebagai data pendukung meliputi bobot kering akar, bobot kering akar terinfeksi dan bobot kering total tanaman. Penimbangan bobot kering akar dan pucuk dilakukan pada akhir pengamatan, dengan cara menimbang bahan tanaman setelah dikeringkan dalam oven dengan suhu 70o C selama 2x24 jam atau sampai terjadi bobot kering yang konstan (Sitompul dan Guritno 1995). Bobot kering akar terinfeksi ditentukan dengan cara mengalikan bobot kering akar (g) dengan kolonisasi akar (%). Selanjutnya bobot kering total tanaman (g) ditentukan dengan cara menjumlahkan bobot kering akar dan pucuk.
Jumlah propagul CMA ditentukan berdasarkan metode MPN (The most probable number) (Porter 1979). Prosedur yang dilakuka n yaitu menyiapkan media berupa pasir zeolit. Benih uji P. javanica disterilisasi dengan cara merendam dalam larutan klorox 5% selama ± 5 menit kemudian dibilas sampai bau klorox hilang dan mengecambahkan biji dalam bak kecambah.
Persiapan seri pengenceran medium dilakukan dengan cara menyiapkan seri pengenceran (dengan kelipatan 10) yaitu dengan mencampurkan contoh sampel uji dengan media zeolit. Untuk membuat seri pengenceran 10o yaitu sampel uji murni, 10-1 yaitu 1 bagian sampel uji murni dan 9 bagian zeolit, 10-2 yaitu 1 bagian sampel 10-1 dan 9 bagian zeolit dan seterusnya sampai pengenceran 10-7, setiap seri pengenceran dibuat 5 kali ulangan.
Penanaman kecambah pada pot yang telah berisi medium pertumbuhan sesuai dengan seri pengenceran, dan memupuk dengan larutan nutrisi hyponex merah sebanyak 1 g/l air seminggu sekali, selanjutnya memelihara pot kultur sampai ± 5 minggu
Gambar 3. Kegiatan pengujian potensi inokulum dengan menggunakan tanaman inang sorgum selama lima minggu di rumah kaca
Pemanenan dan pemrosesan akar yaitu dengan cara memotong bagian akar tanaman dan dicuci bersih kemudian dimasukkan kedalam botol vial yang berisi KOH 2,5 % dan direndam sampai akar kelihatan bersih dan jernih. Selanjutnya pemrosesan sampel akar sama dengan prosedur dalam pewarnaan akar. Memeriksa akar dibawah mikroskop dan mencatat pada tabel pengamatan bila ada infeksi d iberi tanda (+) dan bila tidak ada (-).
Cara perhitungan jumlah propagul yaitu dengan memilih tiga seri pengenceran yang menghasilkan kolonisasi akar, dimana P1 infeksi tertinggi, P2 dan P3 adalah
yang jumlah infeksinya berturut -turut di bawah P1. Kemudian menentukan angka pada tabel MPN berdasarkan nilai P1, P2 dan P3 dan kombinasi dari angka dikali
dengan faktor pengenceran P2. Selang kepercayaan 95 % dapat dihitung berdasarkan
rumus :
Log Oa,b = log MPN ± 0.326
Uji efektivitas formulasi inokulum pada semai jati Muna
Persiapan benih
Benih jati yang digunakan adalah benih jati Muna . Benih diseleksi yaitu dengan cara memisahkan benih dari kotoran dan benih yang rusak, cukup kering, diamete r ± 1 cm, tidak terserang hama penyakit. Perlakuan benih berdasarkan metode Rizain (1999) dimodifikasi. Sebelum penyemaian, benih jati Muna dijemur kemudian direndam dalam air semalam, berturut-turut selama 4 hari kemudian direndam dalam abu sekam dengan perbandingan 1:0,7:1 (benih : abu sekam : air) selama 24 jam dan benih siap disemai.
Persiapan media perkecambahan dan media semai
Media perkecambahan benih menggunakan pasir yang telah dikeringkan dan diayak. Media pasir ditempatkan pada bak-bak kecambah dengan ketebalan 10 cm. Selanjutnya benih jati Muna ditanam satu persatu dengan pusar menghadap kebawah. Setelah itu benih ditutup dengan pasir tipis. Media tanam semai menggunakan tanah dan pasir yang dicampur dengan perbandingan (3:1), selanjutnya dimas ukkan dalam polibag dan ditimbang dengan berat 2 kg dengan ukuran polibag 20 x 20 cm.
Penyapihan dan Inokulasi CMA
Penyapihan dilakukan pada saat kecambah telah siap untuk disapih yaitu kecambah yang telah terbentuk dua daun pertama kira-kira umur 21 hari dan siap dipindahkan ke media polibag. Inokulasi dilakukan pada saat penyapihan, dengan cara memberikan formulasi inokulum CMA hasil perbanyakan sesuai perlakuan disekitar akar semai jati Muna. Kemudian semai diletakan dengan posisi akar persis mengenai inokulum yang diberikan dengan harapan pada saat spora berkecambah akan langsung menginfeksi akar. Inokulum yang akan digunakan adalah inokulum hasil perbanyakan dengan pemberian dosis yang berbeda yaitu 10 g, 15 g, dan 20 g per semai.
Pemeliharaan
Mela kukan penyiraman sesuai kebutuhan yaitu diperkirakan sampai mencapai kapasitas lapang. Pemberantasan hama penyakit juga dilakukan bila perlu.
Gambar 4. Penyapihan semai di polibag dan pemeliharaan selama tiga bulan di persemaian rumah kaca Laboratorium Ekologi Hutan, Fakultas kehutanan IPB
Rancangan Penelitian
Formulasi inokulum terpilih sebanyak enam kombinasi hasil perbanyakan tahap pertama diinokulasikan ke semai jati Muna dengan cara menaburkan formulasi inokulum pada lubang tanam sesuai dosis inokulum yang ditentukan. Kemudian semai dipindahkan ke lubang tanam dengan akar tepat mengenai inokulum tadi, sehingga diharapkan semai yang akan tumbuh akarnya langsung kontak dengan formulasi inokulum yang diberikan. Media tanah yang digunakan adalah jenis Latosol pada polibag dengan berat media 2 kg, kemudian disusun berdasarkan rancangan yang ditetapkan. Penelitian ini merupakan percobaan faktorial dengan RAK menggunakan 2 faktor perlakuan, faktor pertama yaitu formulasi inokulum CMA yang terdiri dari enam taraf yaitu formulasi G. etunicatum (A1), G. etunicatum dengan vermikompos 30% (A2), G. etunicatum dengan vermikompos 40% (A3), Glomus sp. (B1), Glomus sp. dengan vermikompos 30% (B2), Glomus sp. dengan vermikompos 40% (B3) dan kontrol. Faktor kedua adalah dosis formulasi inokulum CMA yang terdiri dari tiga taraf yaitu 10 g per semai (D1), 15 g per semai (D2) dan 20 g per semai (D3). Setiap kombinasi perlakuan diulang 3 kali sehingga didapat 57 unit percobaan. Peubah pertumbuhan yang diamati adalah tinggi semai, diameter batang, bobot kering semai (bagian pucuk dan akar), nisbah pucuk akar, kolonisasi akar dan jumlah spora. Adapun model statistik yang digunakan adalah
Yijk = µ + Mi + Dj + (MD)ij + ?k+eijk Keterangan :
Yijk = Nilai pengamatan pada faktor A adalah formulasi inokulum CMA
taraf ke -i, faktor D (Dosis formulasi inokulum) taraf ke-j dan kelompok ke -k
µ = Komponen aditif dari rataan
Ai = Pengaruh utama faktor A (formulasi inokulum CMA ) pada taraf
ke-i
Dj = Pengaruh utama faktor D (Dosis formulasi inokulum) pada taraf
ke-j
(AD)ij = Komponen interaksi dari faktor A (formulasi inokulum CMA )
pada taraf ke-i dan faktor D (dosis formulasi inokulum) pada taraf ke-j
?k = Pengaruh aditif dari kelompok dan diasumsikan tidak berinteraksi
dengan perlakuan
eijk = Pengaruh acak yang menyebar normal (0,s2)
(Mattjik dan Sumertajaya 2002)
Pengamatan Pertumbuhan
Peubah pertumbuhan yang diamati dan diukur adalah tinggi semai, diameter batang, bobot kering semai, nisbah pucuk akar, kolonisasi akar dan jumlah spora. Peubah tinggi semai diukur dari pangkal batang (pada satu titik yang tetap dekat permukaan tanah) sampai titik tumbuh tertinggi semai pada jalur batang dengan menggunakan mistar , dan diukur 2 minggu sekali. Diameter batang diukur menggunakan jangka sorong pada ketinggian 1 cm dari permukaan tanah diukur pada awal dan akhir pengamatan. Bobot kering semai (bagian pucuk dan akar semai) dibersihkan kemudian dikeringkan dengan pengovenan pada suhu 70oC atau sampai tercapai bobot kering yang konstan kemudian ditimbang (Sitompul dan Guritno 1995). Nisbah pucuk akar ditentukan dengan membandingkan bobot kering pucuk dan bobot kering akar semai. Sebagai data pendukung yaitu menghitung kolonisasi CMA pada akhir penelitian, dimana prosedurnya sama dengan proses pewarnaan akar dengan metode Phillips dan Hayman (1970) dimodifikasi.
Pengamatan jumlah spora dilakukan dengan prosedur yaitu tanah dalam polibag dibongkar dan mengambil contoh tanah seberat 40 g. Sampel tanah dimasukkan ke dalam gelas kemudian direndam dan diaduk agar spora yang melekat pada partikel tanah dapat terlepas. Setelah tanah diaduk kemudian dituang dalam saringan bertingkat (63µm, 125µm, 250µm dan 500µm) yang
disusun dari paling terbesar sampai saringan terkecil. Kemudian saringan tadi disemprot dengan air mengalir dan diusahakan supaya bertekanan tinggi untuk melepaskan spora dari partikel tanah. Hasil saringan 63 µm diambil dan dimasukkan kedalam tabung sentrifus dan diberi larutan gula 50% dan disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 3200 rpm. Kemudian larutan supernatan pada bagian tengah diambil dengan memakai pipet dan dicuci dibawah air mengalir dengan saringan 63µ m. Hasil saringan diambil dan dituang ke cawan petri kemudian di hitung dibawah mikroskop stereo binokuler Carton NSWT.
Pengamatan penunjang meliputi analisis media semai jati, analisis hara inokulum yang digunakan, temperatur udara rumah kaca selama penelitian, analisis jaringan daun semai jati untuk N, P, K, dan Ca diakhir penelitian.
Analisis Data
Data hasil pengamatan dari masing-masing peubah dilakukan analisis sidik ragam. Jika hasil analisis sidik ragam menunjukkan F hitung > dari F tabel maka dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan pa da taraf kepercayaan 95% untuk membandingkan antar perlakuan (Mattjik dan Sumertajaya 2002). Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan program komputer SAS V6.12 (Statistical Analysis Sistem).