Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Agustus 2007- Juli 2008. Seleksi, karakterisasi bakteri pendegradasi alkana, analisis sebagian gen 16S rDNA, serta kloning gen alkB dilakukan di Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong. Adapun sekuensing gen 16S rDNA dan gen alkB dilakukan di Puslit Bioteknologi LIPI dan di Biotechnology Development Centre, National Institute of Technology
and Evaluation (NITE), Jepang.
Metode Penelitian
Alur Penelitian. Keseluruhan penelitian ini mengikuti alur pada Gambar 6. Koleksi bakteri dari Pulau Pari, Kepulauan Seribu, Jakarta dianalisis sebagian gen 16S rDNAnya untuk memperoleh gambaran keragaman bakteri pendegradasi minyak. Selain itu dilakukan seleksi dan karakterisasi bakteri pendegradasi alkana dan poliaromatik hidrokarbon (PAH). Selanjutnya bakteri yang mampu tumbuh di alkana, dilakukan analisis gen alkB yang berperan dalam degradasi alkana. Analisis dilakukan dengan melakukan kloning gen ini ke dalam sel Escherichia
coli JM109. Analisis sekuen gen alkB dari bakteri Pulau Pari dilakukan dengan
membandingkannya dengan data yang ada di bank data.
Gambar 6 Diagram Alur Penelitian.
Bakteri dan karakternya dalam mendegradasi alkana & poliaromatik hidrokarbon (PAH) Keragaman bakteri
pendegradasi minyak
Keragaman genetik gen alkB
Sekuen gen alkB
Seleksi & karakterisasi mikroba Analisis sebagian
gen 16S rDNA
Koleksi bakteri dari Pulau Pari, Kepulauan Seribu,
Jakarta
Deteksi gen alkB dengan PCR
Kloning gen alkB
Bakteri. Penelitian ini menggunakan 65 isolat bakteri yang diisolasi dari Pulau Pari, Kepulauan Seribu, Jakarta. Bakteri-bakteri ini merupakan koleksi bersama Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI dan NITE Jepang.
Uji Pertumbuhan Bakteri dalam Senyawa Alkana. Isolat bakteri pendegradasi minyak dari Pulau Pari, Kepulauan Seribu, Jakarta, yang telah murni ditumbuhkan dalam media ONR7 (Dyksterhouse et al. 1995) yang mengandung alkana. Dalam 1 L ONR7 terkandung 22.79 g NaCl, 11.18 g MgCl2·6H2O, 3.98 g Na2SO4, 1.46 g
CaCl2·2H2O, 1.3 g
3-[N-tris(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropanesulfonic acid (TAPSO), 0.72 g KCl, 0.27 g NH4Cl, 89 mg
Na2HPO4·7H2O, 83 mg NaBr, 31 mg NaHCO3, 27 mg H3BO3, 24 mg SrCl2·6H2O, 2.6 mg NaF, dan 2.0 mg FeCl2·4H2O, serta ditambahkan 15 gram agar-agar. Inkubasi dilakukan pada suhu 30 C, selama 9 hari. Senyawa alkana yang digunakan ialah parafin (CnH2n+2) - merupakan senyawa alkana rantai lurus, dan pristan (2,6,10,14-Tetrametilpentadekan)- merupakan senyawa alkana berantai cabang, masing-masing dengan konsentrasi 2000 ppm. Sebagai kontrol ialah media ONR7 ditambahkan senyawa alkana yang tidak ditambahkan bakteri, serta media ONR7 tanpa senyawa alkana dan ditambahkan bakteri. Pertumbuhan diamati berdasarkan kekeruhannya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm.
Karakterisasi Bakteri Pendegradasi Minyak. Isolat bakteri diinkubasi selama 2-4 minggu dengan menggunakan metode sublimasi (Alley dan Brown 2000) pada media ONR7 padat ditambah senyawa poliaromatik hidrokarbon (PAH), yaitu fenantren, dibenzotiofen, fluoren, fluoranten, dan fenotiazen. Suhu serta waktu sublimasi ditampilkan pada Tabel 2. Sebagai kontrol ialah media ONR7 yang telah diinokulasi bakteri, tetapi tidak dilakukan sublimasi. Bakteri yang tumbuh dan memberikan zona bening di sekitarnya diduga merupakan bakteri pendegradasi PAH.
Tabel 2 Kondisi sublimasi senyawa PAH
Senyawa PAH Titik leleh (°C) Waktu (menit)
Fenantren 100 5 Dibenzotiofen 100 3 Fluoren 115 3 Fenotiazin 130 30 Fluoranten 130 30 Piren 130 30
Uji Aktivitas Degradasi Alkana oleh Bakteri. Isolat bakteri yang positif tumbuh dalam alkana, selanjutnya diuji aktivitasnya dalam mendegradasi alkana. Bakteri ditumbuhkan dalam media ONR7 cair yang mengandung alkana (parafin dan pristan) 2000 ppm selama 9 hari. Pengambilan contoh kultur dilakukan setiap hari untuk dianalisis pertumbuhan sel serta kandungan senyawa alkana.
Analisis degradasi alkana diukur dengan menggunakan gas kromatografi. Sebanyak 5 ml kultur contoh diekstrak dengan menggunakan diklorometan. Fase organik yang terbentuk diambil, serta ditambahkan Na2SO4 untuk menghilangkan kandungan air. Selanjutnya fase organik dipekatkan hingga volume akhir 1 ml. Contoh siap dianalisis kandungan senyawa alkana dengan menggunakan gas kromatografi (GC).
Analisis dilakukan dengan menggunakan mesin GC Shimidzu 17A. Detektor yang digunakan ialah flame ionization detector (FID), dengan kolom kapiler (HP1) silika panjang 30 cm, diameter 0.35 mm, tebal film 0.33 m. Suhu oven 60 C kemudian dinaikkan hingga 280 C. Kecepatan alir 6 ml/menit, serta didiamkan selama 15 menit. Suhu detektor 300 C dan suhu injektor 240 C. Gas pembawa yang digunakan ialah gas nitrogen.
Aktivitas degradasi diukur berdasarkan sisa alkana (%) di dalam kultur bakteri. Adapun pertumbuhan diamati berdasarkan kekeruhannya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm.
Ekstraksi DNA Genom Bakteri. DNA bakteri diekstrak dengan menggunakan metode dan bahan kimia yang disarankan oleh InstaGen (BioRad). Koloni bakteri diambil dengan jarum ose dan disuspensikan ke dalam tabung mikrofus yang berisi 1 ml ddH2O steril. Selanjutnya disentrifugasi pada 10000-12000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang. Kemudian pelet sel ditambah
50 l larutan InstaGene dan diinkubasi pada suhu 56 C selama 15-30 menit. Campuran ini divortek dengan kecepatan tinggi selama 10 detik serta diinkubasi pada suhu 100 C selama 8 menit. Selanjutnya larutan divortek pada kecepatan tinggi selama 10 detik dan disentrifugasi pada 10000-12000 rpm selama 2-3 menit. Supernatan yang mengandung DNA genom bakteri di pindahkan ke dalam tabung mikrofus baru steril, serta disimpan pada suhu -20 C.
Analisis Sebagian Gen 16S rDNA Bakteri. Identifikasi bakteri hanya dilakukan secara molekuler, dengan menganalisis sebagian gen 16S rDNAnya. Gen 16S rDNA diamplifikasi dengan menggunakan primer 9F dan 1492R (Tabel 1). Amplifikasi dilakukan dengan campuran reaksi yang mengandung DNA bakteri 2 l, primer 9F dan 1492R masing-masing 50 pmol 0.3 l, larutan Go Taq 25 l, serta ddH20 12.4 l. Adapun kondisi reaksi PCR ialah 95 C, 2 menit (1 siklus); 95 C, 30 detik, 65 C, 1 menit, 72 C, 2 menit (10 siklus); 95 C, 30 detik, 55 C, 1 menit, 72 C, 2 menit (30 siklus); serta 72 C, 2 menit (1 siklus).
Tabel 3 Primer yang digunakan dalam penelitian
Primer Urutan Basa Pustaka
Gen 16S rDNA 9F: 5’-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 1492R: 5’-TACGGYTACCTTGTTAYGACTT-3’
Burggraf et al. 1992 Gen alkB AlkB-1f: 5’-AAYAACNGCNCAYGARCTNGGNCAYAA-3’,
AlkB-1r: 5’-GCRTGRTGRTCNGARTGNCGYTG-3’
Kloos et al. 2006 PCR koloni pGMT-M13F:5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’;
pGMTM13R:5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’.
Knoche dan Kephart (1999)
Deteksi Gen alkB dengan Menggunakan PCR. Deteksi gen pendegradasi alkana dilakukan dengan menggunakan PCR. Primer spesifik yang digunakan ialah AlkB-1f dan AlkB-1r (Tabel 1). Amplifikasi dilakukan dengan mencampurkan reaksi yang mengandung DNA bakteri 2 l, primer AlkB-1f dan AlkB-1r masing-masing 50 pmol 0.3 l, larutan Go Taq 25 l, serta ddH20 12.4 l. Kondisi reaksi yang digunakan dalam reaksi PCR ialah 94 ˚C selama 3 menit, 94 ˚C selama 30 detik, 55 ˚C selama 30 detik, 72 ˚C selama 1 menit, serta 72 ˚C selama 10 menit. Siklus yang digunakan sebanyak 34 siklus.
Isolasi dan Pemurnian Pita Gen alkB dari Gel Agarosa. Hasil elektroforesis berupa pita gen alkB berukuran sekitar 550 pb diisolasi dan dimurnikan dari gel agarosa dengan menggunakan kit pengekstraksi gel agarosa (Wizard®SV Gel-Promega). Pita gen alkB dipotong dari gel agarosa dengan menggunakan pisau dan dimasukkan ke dalam tube mikrosentrifus. Kemudian ditambahkan 10 l/10 mg gel membrane binding solution. Larutan divortek dan diinkubasi pada suhu 50-65 C hingga gel larut. Larutan dimasukkan ke dalam minikolom SV yang telah dipasang pada tube mikrosentrifus serta diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit. Sentrifugasi dilakukan pada 12000 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang dan minikolom dipasang kembali pada tube mikrosentrifus. Selanjutnya ditambahkan 700 l membrane wash solution, dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang dan minikolom dipasang kembali pada tube mikrosentrifus. Kemudian ditambahkan 400 l membrane wash solution, dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan minikolom dipasang kembali pada tube mikrosentrifus baru. Pada minikolom ditambahkan 50 l nuclease-free water, serta diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruang. Sentrifugasi dilakukan pada 12000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh disimpan pada suhu 4 C atau -20 C.
Ligasi Gen alkB dengan Plasmid pGEMT-Easy. Pita gen alkB hasil pemurnian dari gel agarosa diligasikan dengan plasmid pGEMT-Easy. Sebanyak 3 l DNA gen alkB ditambahkan 1 l plasmid pGEMT-Easy, serta 1 l enzim T4DNA ligase. Campuran diinkubasi pada suhu 4 C selama semalam.
Pembuatan Sel E. coli JM109 Kompeten. Sel E. coli JM109 kompeten disiapkan berdasarkan metode yang dikembangkan oleh Inoue et al. (1990). Sel E.
coli JM109 diinokulasi ke dalam 1 ml media SOB (Baktotripton 4 g, ekstrak
khamir 1 g, 0.4 l NaCl 5M, 0.167 ml KCl 3M, dan 200 ml ddH2O; MgSO4 2.465 g, MgCl2 2.033 g) dan diinkubasi semalam pada 37 C. Selanjutnya kultur diinokulasikan ke dalam 200 ml media SOB dalam botol ukuran 2L, serta diinkubasi dengan penggoyang pada kecepatan 200 rpm, 18 C, selama 19-50 jam. Kultur dimasukkan ke dalam es selama 10 menit, jika pertumbuhan sel telah
mencapai OD600 nm= 0.4-0.8. Sel dipanen dengan sentrifugasi pada 3000 rpm, 4 C selama 15 menit. Kemudian pelet sel dilarutkan dengan penambahan 60 ml bufer transformasi (PIPES 1.5 g, CaCl2 1.1 g, KCl 9.3 g, dan ddH2O hingga 500 ml) dingin. Setelah didinginkan selama 10 menit dalam es, larutan disentrifugasi pada 3000 rpm, 4 C selama 15 menit. Pelet sel dilarutkan kembali dengan penambahan 30 ml bufer transformasi dingin. Kemudian ditambahkan 1.2 ml DMSO steril (sterilisasi dengan filter), dengan konsentrasi akhir 7%. Larutan sel didinginkan selama 10 menit dalam es. Larutan sel ini dibagikan masing-masing 0.5 ml ke dalam 1.5 ml tube, kemudian segera dimasukkan ke dalam nitrogen cair. Sel kompeten disimpan dalam suhu -80 C.
Transformasi. Sel E. coli JM109 kompeten dikeluarkan dari freezer -80 C, kemudian disimpan dalam es. Sebanyak 5 l plasmid pGEM-T Easy rekombinan hasil ligasi ditambahkan dan kemudian didinginkan dalam es selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan heat shock pada suhu 42 C selama 1 menit. Kemudian didinginkan dalam es selama 2 menit. Selanjutnya dilakukan penambahan 1 ml media SOC (media SOB ditambah 1/100 glukosa 2M), serta digoyang pada 200 rpm, suhu 37 C selama 1 jam. Sel transforman disebar dalam media LB agar-agar + Ampisilin 100µg/ml + Isopropil β-D-1-tiogalaktopiranosida (IPTG) 0.5 M + 5-bromo-4-kloro-3-indolil--D-galactopiranosida (X-Gal) 80µg/ml dan diinkubasi semalam pada suhu 37 C.
Deteksi Koloni Transforman Positif. Plasmid pGEMT-Easy rekombinan yang berhasil ditransformasikan ke dalam E. coli JM109 dapat diketahui keberadaannya dengan PCR koloni. Koloni putih diambil dengan tusuk gigi steril, dan diinokulasikan ke dalam tube PCR yang telah berisi ddH2O steril. Kemudian ditambahkan primer 50 pmol 0.3 l dan pereaksi PCR Go taq (Promega) 25 l. Primer yang digunakan ialah pGMT-M13F dan pGMT-M13R (Tabel 1). Adapun kondisi reaksi PCR ialah 94 C, 3 menit, (94 C, 30 detik, 55 C, 30 detik, 72 C, 1 menit) sebanyak 25 siklus, dan 72 C, 2 menit. Hasil amplifikasi dicek dengan
menggunakan elektroforesis gel. Koloni positif transforman ditunjukkan dengan dihasilkannya pita berukuran sekitar 750 pb.
Pemurnian DNA Sebelum Sekuensing. Pemurnian DNA sebagai persiapan sekuensing dilakukan dengan menggunakan kit dari AGENCOURT®
CLEANSEQ® Dye-Terminator Removal (Beckman Coulter-USA). Contoh DNA
yang telah ditempatkan di lempeng 96 sumur ditambahkan 5 l Agencourt
CleanSEQ. Selanjutnya ditambahkan etanol 85% dan dipipet atau divortek selama
30 detik untuk mencampur larutan. Larutan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 menit. Kemudian plat contoh DNA disusun di atas plat Agencourt SPRIPlate 96R serta diinkubasi selama 3 menit untuk memisahkan manik-manik (beads) dari campuran. Supernatan yang terbentuk diambil dan dibuang. Selanjutnya ditambahkan 100 l etanol 85% dan diinkubasi pada suhu ruang selama 30 detik. Etanol dipisahkan dan dibuang dan bila masih terbentuk gumpalan, proses pencucian ini diulang sebanyak dua kali. Selanjutnya campuran dikering anginkan di suhu ruang selama 10 menit. Setelah kering lalu ditambahkan 30 l bufer elusi dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Contoh DNA ini siap untuk dianalisis urutan basanya.
Sekuensing dan Analisis Sekuen DNA. Urutan sekuen gen alkB dalam plasmid pGEMT-Easy dianalisis dengan menggunakan mesin otomatis DNA sekuen Pharmasia tipe ABI 310 di Puslit Bioteknologi LIPI dan NITE-Jepang. Primer yang digunakan ialah pGMT-M13F dan pGMT-M13R (Tabel 3).
Informasi urutan basa dari hasil kloning gen alkB dilacak keserupaannya dengan klon alkB lain dari data base GeneBank/DDBJ/EMBL menggunakan program BLAST (Altschul et al. 1997). Proses penyejajaran sekuen dengan menggunakan program ClustalX (Higgins dan Sharp et al. 1988), sedangkan dendogram pohon genetik dikonstruksi dengan menggunakan program NJ Plot serta Mega 3.1 ABI sequencer software (Kumar et al. 2004).