Langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Isolasi Mikroba dari Tongkol Jagung Busuk
Isolasi mikroba dilakukan dari tongkol jagung hibrida CP 2 busuk. Tongkol jagung busuk tersebut dihancurkan dan dimasukkan ke dalam air aquades steril. Sebanyak 1.0 ml suspensi mikroba diinokulasi ke dalam 25 ml media cair oat spelt xylan 0.7 % dan diinkubasi menggunakan sheaker selama satu hari. Hasil kultivasi disebarkan ke media padat sebanyak 0.1 ml dengan menggunakan spreader dan diinkubasi selama dua hari. Seleksi koloni dilakukan secara bertahap sampai diperoleh isolat murni berdasarkan zona bening yang dihasilkan di sekeliling koloni. Galur-galur yang mempunyai kemampuan menghasilkan xilanase ditumbuhkan pada media agar miring, kemudian diawetkan dalam gliserol 50 % dan disimpan pada suhu -20oC. Komposisi media yang digunakan untuk mengisolasi mikroba penghasil xilanase dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Komposisi media pertumbuhan xilanase
Substrat Komposisi Media
(% b/V) Ekstrak khamir 0.2
K2HPO4 1.5 MgSO4.7H2O 0.025 Oat spelt xylan 0.7
pH 7.0 NaCl 0.25 NH4Cl 0.5 Na2HPO4 0.5 Sumber : Dung et al. (1993)
Gambar 4. Diagram alir pembuatan media 2. Seleksi Isolat
Seleksi isolat penghasil xilanase terbaik dilakukan dengan mengukur indeks xilanolitik dan aktivitas enzim ekstrak kasar (supernatan). Pengujian indeks xilanolitik isolat dilakukan dengan mengukur area bening yang dihasilkan oleh masing-masing isolat pada media padat oat spelt xylan 0.7 %. Ekstrak kasar enzim untuk pengujian aktivitas xilanase diperoleh dari hasil sentrifuse inokulum masing-masing isolat. Metode inokulasi dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan cara memasukkan sebanyak satu ose masing-masing isolat ke dalam 25 ml media cair oat spelt xylan 0.7 % dalam erlenmeyer 100 ml dan dengan cara memasukkan 10 % inokulum starter masing-masing isolat yang memiliki OD 0.600 ke dalam 10 ml media cair oat spelt xylan 0.7 % dalam tabung reaksi. Media inokulum starter yang digunakan adalah Luria Broth yang terdiri dari tryptone 1 %, ekstrak khamir 1 %, dan NaCl 1 %. Inkubasi dilakukan di dalam penangas air bergoyang selama 18 jam pada suhu 37oC. Isolat yang memiliki indeks xilanolitik dan aktivitas enzim yang cukup tinggi dipilih untuk dikarakterisasi lebih lanjut.
Disterilisasi dengan otoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC
Komposisi Media % b/V Aquades Na2CO3 1 % Diatur pH sampai pH = 7.0
3. Analisis Aktivitas Enzim Xilanase
Analisis aktivitas xilanase dilakukan terhadap pengujian seleksi isolat, optimasi produksi enzim (pengaruh konsentrasi substrat, penentuan pH dan suhu optimum produksi), hasil endapan amonium sulfat, karakteristik xilanase (pH optimum, suhu optimum dan stabilitas suhu). Pengujian aktivitas enzim xilanase dilakukan dengan metode Miller (1959)* yang telah dimodifikasi. Aktivitas xilanase ditentukan dengan mengukur gula pereduksi yang dihasilkan dari hidrolisis 0.5 ml oat spelt xylan (0.5 % dalam 50 mM bufer Tris.HCl pH 7.5) oleh 0.05 ml enzim pada suhu 37oC selama 15 menit. Banyaknya gula pereduksi diukur dengan menggunakan metode DNS (3,5-dinitrosalysilic acid) secara spektrofotometri ( =550 nm). Satu unit aktivitas xilanase menunjukkan
mol xilosa yang dihasilkan per menit untuk setiap ml enzim atau mg protein.
Standar xilosa dibuat pada kisaran 200-2000 ppm xilosa/ml dari stok 2000 ppm xilosa. Sebanyak 0.5 ml masing-masing larutan standar dicampur dengan 0.5 ml akuades, kemudian ditambah 1 ml pereaksi DNS. Tabung dimasukkan dalam penangas air mendidih selama 15 menit, kemudian didinginkan dan diabsorbansi pada panjang gelombang 550 nm. *
)Modifikasi dilakukan pada perbandingan antara substrat, bufer dan enzim pada larutan reaksi, serta jumlah pereaksi.
(Cs – Ck) x 1000 Aktivitas enzim (U/ml) =
BM xilosa x T x VE Keterangan :
Cs : Konsentrasi xilosa sampel (mg/ml) Ck : Konsentrasi xilosa kontrol (mg/ml) BM xilosa : 150.3 mg/mmol
T : Waktu inkubasi reaksi enzim (menit) VE : Volume enzim yang ditambahkan (ml)
4. Analisis Aktivitas β-Xilosidase
Analisis aktivitas β-xilosidase dilakukan terhadap karakterisasi enzim β-xilosidase yang meliputi penentuan aktivitas pH optimum, aktivitas suhu optimum dan stabilitas suhu. Pengujian aktivitas β -xilosidase dilakukan dengan substrat ρ-nitrofenol-β-D-xilopyranosida berdasarkan metode Ratanakhanokchai et al. (1998)* yang telah dimodifikasi. Sebanyak 500 l substrat 0.9 mM PNP-β-D-xilopiranosida diinkubasi bersama-sama enzim (50 l) pada suhu 37oC selama 60 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 0.1 ml Na2CO3 0.4 M. Aktivitas enzim ditentukan dengan mengukur jumlah ρ-nitrofenol yang dilepaskan dan diukur nilai absorbansinya pada 405 nm. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai satu mol ρ-nitrofenol yang dihasilkan dalam waktu satu menit per ml enzim pada kondisi percobaan.
Sebagai standar digunakan ρ-nitrofenol pada kisaran 0.1-0.5 mM dalam bufer fosfat 50 mM pH 7. Sebanyak 500 l masing-masing larutan standar diinkubasi dengan 50 l bufer fosfat 50 mM pH 7 pada suhu 37oC selama 60 menit. Setelah inkubasi ditambahkan 1 ml Na2CO3 0.4 M dan diabsorbansi pada 405 nm.
*
)Modifikasi dilakukan pada perbandingan antara substrat, bufer dan enzim pada larutan reaksi, serta jumlah pereaksi.
(Cs – Ck) x 1000 Aktivitas enzim (U/ml) =
T x VE Keterangan :
Cs : Konsentrasi xilosa sampel (mM) Ck : Konsentrasi xilosa kontrol (mM) T : Waktu inkubasi reaksi enzim (menit) VE : Volume enzim yang ditambahkan (ml)
5. Penentuan Kadar Protein
Penentuan kadar protein dilakukan terhadap pengujian seleksi isolat (pengukuran I), optimasi produksi enzim (pengaruh konsentrasi substrat, pengaruh pH dan suhu pertumbuhan) dan hasil endapan amonium sulfat. Kadar protein diukur dengan metode Bradford (1976). Sebanyak 100 l enzim di dalam aquades 1 ml direaksikan dengan 1 ml pereaksi Coomasive Brilliant Blue G-250, kemudian divorteks dan didiamkan selama 5 menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Blanko menggunakan 1.1 ml aquades yang direaksikan dengan 1 ml pereaksi Coomasive Brilliant Blue G-250. Standar protein menggunakan Bovin Serum Albumin (BSA) pada kisaran 0.02-0.2 mg protein/ml dari stok BSA 1 mg/ml.
6. Penentuan Kadar Gula Pereduksi
Penentuan kadar gula pereduksi dilakukan dengan metode Apriyantono, et al. (1989)* yang telah dimodifikasi. Sebanyak 0.5 ml larutan ditambahkan 1.5 ml pereaksi DNS. Larutan tersebut diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit, kemudian didinginkan pada suhu kamar. Setelah itu dilakukan pembacaan pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm. Blanko dibuat seperti di atas hanya menggunakan aquades atau buffer. Sebagai standar digunakan larutan xilosa dengan konsentrasi 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1.0 mg/ml.
*
)Modifikasi dilakukan pada perbandingan antara sampel dan jumlah pereaksi yang sama.
7. Analisis Proksimat Bahan Baku Tongkol Jagung
Analisis proksimat bahan baku tongkol jagung meliputi analisis kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, kadar serat kasar dan kadar lignolosa. Prosedur analisis proksimat terdapat pada lampiran 1.
8. Delignifikasi Tongkol Jagung
Sebelum digunakan sebagai substrat, tongkol jagung mengalami perlakuan pendahuluan berupa pengecilan ukuran dan delignifikasi. Delignifikasi dilakukan untuk memisahkan bagian lignin dari selulosa dan hemiselulosa. Tongkol jagung yang telah didelignifikasi memiliki warna yang lebih coklat dibandingkan tongkol jagung yang belum didelignifikasi. Perbandingan tongkol jagung yang belum didelignifikasi dan yang telah didelignifikasi dapat dilihat pada Gambar 5.
(A) (B)
Gambar 5. Cacahan tongkol jagung (A) sebelum delignifikasi, (B) setelah delignifikasi
Proses delginifikasi dilakukan sebagai berikut. Cacahan tongkol jagung 32 mesh sebanyak 100 g dimasukkan ke dalam wadah stoples plastik dan direndam dalam larutan NaOCl 1 % selama 5 jam pada suhu ruang. Setelah 5 jam, sampel dibilas dengan air dan disaring sampai pH netral. Sampel kemudian dikeringkan pada suhu 50oC selama 48 jam (Agustina, 2000).
Gambar 6. Metode delignifikasi menggunkan NaOCl 1 % (Agustina, 2000) 9. Optimasi Produksi Enzim
a. Penentuan Komposisi Tongkol Jagung Optimum
Optimasi produksi enzim dilakukan pada substrat tongkol jagung yang mengandung ekstrak khamir 0.2 %, K2HPO4 1.5 %, MgSO4.7H2O 0.025 %, NaCl 0.25 %, NH4Cl 0.5 %, dan Na2HPO4 0.5 %. Sebanyak 10 % kultur starter yang memiliki OD 0,600 diinokulasi ke dalam media 50 ml dalam erlenmeyer 125 ml, dengan komposisi tongkol jagung 1 %, 3 %, 5 %, dan 7 %. Penentuan komposisi tongkol jagung terbaik dilakukan dengan membuat kurva produksi enzim harian pada masing-masing komposisi tongkol jagung. Optimasi media juga dilakukan pada media oat spelt xylan, sebagai perbandingan penggunaan kualitas tongkol jagung sebagai substrat.
Cacahan tongkol jagung
Perendaman dalam NaOCl 1 % selama 5 jam pada suhu 28oC
Pencucian
Penyaringan
Lignin
Pengeringan
pada suhu 50oC selama 48 jam
b. Penentuan pH dan Suhu Optimum Produksi Enzim
Komposisi media tongkol jagung terbaik digunakan untuk menentukan pH dan suhu optimum produksi enzim. Penentuan pH optimum dilakukan pada kisaran pH 5, 6, 7, 8, dan 9, sedangkan optimasi suhu dilakukan pada kisaran suhu 37oC dan 45oC. Hasil kondisi optimum digunakan untuk produksi enzim pada tahap selanjutnya, yaitu pengendapan enzim xilanase dengan amonium sulfat dan karakterisasi enzim xilanase.
10. Pengendapan Enzim Xilanase dengan Amonium Sulfat ((NH4)2SO4) Pengendapan enzim ini dilakukan untuk memperoleh kondisi optimum fraksinasi dengan berbagai persentase kejenuhan amonium sulfat. Persentase amonium sulfat yang digunakan adalah pada kisaran (NH4)2SO4 20-60 % (b/v). Enzim diendapkan dalam keadaan dingin sambil diaduk perlahan menggunakan pengaduk megnetik. Enzim yang mengendap selanjutnya disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm, suhu 4oC selama 30 menit. Endapan enzim dilarutkan dalam bufer Tris.HCl 100 mM pH 7.5. Aktivitas endapan enzim yang tertinggi menunjukkan persentase kejenuhan amonium sulfat optimum yang selanjutnya akan digunakan dalam pengendapan enzim xilanase skala satu liter.
11. Karakterisasi Enzim Xilanolitik
Hasil pengendapan amonium sulfat optimum dari satu liter supernatan digunakan untuk karakterisasi enzim xilanase dan enzim β -xilosidase. Karakterisasi meliputi penentuan pH optimum, suhu optimum, stabilitas pH, dan termostabilitas.
1. pH Optimum
Penentuan pH optimum enzim xilanase dan β-xilosidase dilakukan pada pH 4, 5, 6 (bufer fosfat sitrat 100mM), pH 6, 7, 8 (bufer fosfat 100 mM) dan pH 8,9,10 (bufer glisin NaOH 100mM). Penentuan pH optimum ini dilakukan dengan pengujian aktivitas
enzim menggunakan bufer-bufer tersebut dan diinkubasi pada suhu 37oC.
2. Suhu Optimum
Penentuan suhu optimum dilakukan dengan pengujian aktivitas enzim yang diinkubasi pada bufer pH optimum pada suhu 27oC, 37oC, 50oC, 60oC, 70oC dan 80oC.
3. Stabilitas Suhu
Stabilitas suhu diuji dengan menginkubasi enzim dalam bufer pH optimum 100 mM pada suhu 70oC dengan waktu sampling 30 menit. Sampel kemudian direaksikan dengan 0.5 % oat spelt xylan dalam bufer optimum dan diinkubasi pada suhu optimum.
12.Analisis SDS-PAGE
Elektroforesis protein dengan SDS-PAGE dilakukan dengan menggunakan gel pemisah 10 % poliakrilamida dan gel penahan 4 % poliakrilamida (Laemli, 1970). Tahapan analisis SDS-PAGE adalah sebagai berikut.
1. Pembuatan Gel
Cetakan gel berupa dua lempeng kaca dihimpitkan dan diantaranya diletakkan pemisah (spacer) pada bagian tepi, lalu dijepit dengan klip dan diberdirikan di atas lempeng kaca. Larutan gel pemisah (separating gel) dibuat dengan komposisi seperti tercantum dalam Lampiran.14 dimasukkan ke dalam lempeng kaca. Setelah gel tersebut mengeras kemudian dimasukkan gel penahan ke atasnya. Sisir pencetak sumur segera dimasukkan ke bagian gel penahan sebelum gel mengeras.
2. Pelarian sampel
Lempeng kaca yang berisi gel yang sudah mengeras dimasukkan ke dalam alat elektroforesis dan diikuti dengan larutan bufer. Protein (20 μl) disuspensikan dalam bufer sampel (100μl), diinkubasi pada
95oC selama 1 menit, dan diisikan ke dalam gel poliakrilamid sebanyak 12 l. Standar marker LMW (Low Molecular Weight) yang sebelumnya telah dilarutkan dalam bufer sampel juga diisikan ke dalam sumur sebanyak 12 l. Kemudian sampel dan standar marker dilarikan dalam gel elektroforesis selama 1.5 - 2 jam pada tegangan 100 V, 50 A. Setelah elektroforesis gel diwarnai dengan Coomasive Briliant Blue (CBB) untuk melihat protein yang terpisah dan diukur jarak migrasi pewarna dari batas atas gel pemisah.
4. Pewarnaan Coomasive Brilliant Blue (CBB)
Gel hasil elektroforesis direndam dalam larutan pewarna Coomasive Briliant Blue R-250 (campuan 0.1 g CBB R-250, metanol 40 ml, asam asetat 10 ml, dan 100 ml aquades). Pewarnaan dalam larutan CBB dilakukan selama 30 menit sambil digoyang konstan pada mesin penggoyang. Kelebihan warna kemudian dihilangkan dengan campuran larutan 40 ml metanol dan 10 ml asam asetat.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN