Waktu dan Tempat
Penelitian berlangsung dari bulan Januari sampai dengan bulan Nopember 2009. Isolasi bakteri dan uji in vitro dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, uji in vivo di Teaching Farm, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Sekuensing untuk identifikasi bakteri dilakukan di Laboratorium PT. Charoen Pokphand Indonesia, Jakarta.
Isolasi dan Pemurnian Bakteri
Bakteri probiotik diisolasi dari usus (saluran pencernaan) ikan air tawar seperti ikan jelawat Leptobarbus hoeveni Blkr, ikan mas Cyprinus carpio, ikan
nila Oreochromis niloticus, ikan lele Clarias, sp., ikan patin Pangasius
hyphothalmus, dan air pemeliharaan ikan air tawar.
Sampel saluran pencernaan (usus) ditimbang sebanyak 1 gram digerus menggunakan mortar, lalu ditambahkan 9 ml larutan fisiologis (Lampiran 1). Setelah sampel usus dan larutan fisiologis tercampur rata, sebanyak 0,1 ml dari campuran tersebut ditambahkan ke dalam 0,9 ml larutan fisiologis dalam
eppendof sehingga diperoleh konsentrasi 10-1 atau pengenceran 10 kali.
Pengenceran serupa dilakukan terus sehingga diperoleh konsentrasi 10-7 dan 10-8. Sebanyak 0,1 ml dari masing-masing konsentrasi disebar pada media Trypticase Soy agar (TSA-agar) (Lampiran 1) secara merata lalu diinkubasi pada suhu ruang (28-31oC) selama 24-48 jam.
Bakteri dari air media pemeliharaan diisolasi dengan cara sampel air sebanyak 1 ml ditempatkan dalam tabung eppendof menggunakan mikropipet steril, sebanyak 0,1 ml dari air tersebut ditambahkan ke dalam 0,9 ml larutan fisiologis dalam eppendof. Setelah sampel air dan larutan fisiologis tersebut
tercampur rata, sebanyak 0,1 ml dari campuran tersebut ditambahkan ke dalam 0,9
ml larutan fisiologis dalam eppendof sehingga diperoleh konsentrasi 10-1 atau
pengenceran 10 kali. Pengenceran serupa dilakukan terus sehingga diperoleh
konsentrasi 10-3 dan 10-4. Sebanyak 0,1 ml dari masing-masing konsentrasi
disebar pada media TSA-agar secara merata lalu diinkubasi pada suhu ruang (28-
31oC) selama 24-48 jam. Koloni yang tumbuh kemudian digunakan dalam uji in
vitro. Berdasarkan penampilan koloni yang tumbuh, setiap koloni yang berbeda dikultur-murnikan sampai didapatkan koloni tunggal yang merupakan biakan murni.
Uji Penghambatan Bakteri terhadap S. iniae secara In Vitro
Isolat S. iniae dan bakteri kandidat probiotik berumur 24 jam diencerkan
hingga memiliki tingkat kepadatan masing-masing 106 sel/ml. S. iniae disebar pada media BHI-agar (Lampiran 1) sebanyak 0,1 ml dan kertas cakram (Whatman antibiotic assay paper 42) ditetesi suspensi bakteri probiotik sebanyak 0,05 ml, kemudian ditaruh diatas media BHI-agar yang telah diberi S. iniae. Setelah diinkubasikan selama 24 jam pada suhu ruang, diameter zona hambat diukur. Isolat yang menghasilkan zona bening menunjukkan kemampuan menghambat S. iniae. Lima isolat yang memiliki zona hambat terluas dipilih untuk digunakan pada uji selanjutnya.
Uji Patogenisitas Bakteri Probiotik
Sebelum dilakukan uji in vivo pada ikan nila dengan S. iniae, perlu diketahui patogenisitas bakteri hasil seleksi dengan mengujinya pada ikan nila. Satu lup dari masing-masing isolat ditumbuhkan dalam media TSB (Lampiran 1) secara terpisah. Kultur ditempatkan pada shaker water bath pada suhu 28-29oC. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 24 jam. Pellet sel yang terbentuk kemudian diresuspensikan dalam larutan fisiologis dan diinjeksikan pada ikan nila yang berukuran rata-rata 11 gram dengan konsentrasi
106 CFU/ml sebanyak 0,1 ml/ekor, serta PBS 0,85% streil (Lampiran 1) sebagai
secara intramuskular. Pada setiap perlakuan dan kontrol, ikan nila dipelihara dalam akuarium dengan kepadatan 10 ekor/akuarium dengan 3 ulangan. Pengamatan tingkat kelangsungan hidup (SR) ikan nila dilakukan selama 10 hari, ikan yang mati dihitung setiap hari dan dibandingkan dengan kontrol.
Uji Penghambatan Bakteri terhadap S. iniae secara In Vivo
Isolat bakteri probiotik yang paling potensial dan tidak bersifat patogen diuji efektifitasnya dalam menghambat serangan S. iniae pada ikan nila. Isolat
bakteri probiotik dengan konsentrasi 106 CFU/ml diinjeksikan pada ikan nila
sebanyak 0,1 ml/ekor. Penyuntikan dilakukan pada hari pertama dan pada hari 3 (tiga) dilakukan uji tantang (challenge) dengan injeksi bakteri S. iniae konsentrasi
105 CFU/ml sebanyak 0,1 ml/ekor secara intramuskular. Pada uji ini, ikan nila
dipelihara dalam akuarium dengan kepadatan 10 ekor/akuarium.
Percobaan dilakukan dengan tiga ulangan termasuk kontrol (kontrol positif : hanya diinokulasi S. iniae, dan kontrol negatif tanpa diinjeksi S. iniae maupun bakteri probiotik). Pengamatan dilakukan selama 15 hari meliputi kelangsungan hidup, pertumbuhan, dan jumlah bakteri S. iniae pada otak dan darah setiap 6 jam selama 48 jam.
Identifikasi Bakteri secara Molekuler
Identifikasi isolat bakteri yang memberikan tingkat kelangsungan hidup tertinggi dilakukan berdasarkan hasil sekuensing gen 16S-rRNA (Marchesi et al. 1998). Sekuensing gen 16S-rRNA terdiri dari tahapan ekstraksi DNA, amplifikasi gen 16S-rRNA dengan PCR (Suwanto, 2002), dan sekuensing dengan mesin Sequenser.
a. Ekstraksi DNA
Bakteri probiotik ditumbuhkan dengan media TSB-cair. Kultur diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 28-29oC, 130 rpm selama 24 jam. Sel bakteri dipanen dengan mengambil 1,5 ml suspensi biakan bakteri lalu dimasukkan ke dalam eppendof dan disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 2 menit,
selanjutnya supernatan dibuang. Tahap ini diulang sebanyak tiga kali. Pellet bakteri yang terbentuk diresuspensi dengan 1 ml buffer TE 1X dan disentrifugasi 6.000 rpm 2 menit. Setelah disentrifugasi, supernatan yang ada dibuang.
Pellet yang tertinggal diresuspensi dengan 500 µl buffer TE 1X, selanjutnya ditambahkan 100 µl lysozyme 50 mg/ml lalu diinkubasi selama 1 jam
pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi ditambahkan 100 µl SDS 10% dan 10 µl
proteinase-K lalu dibolak-balik perlahan-lahan hingga tercampur. Selanjutnya
diinkubasi kembali pada suhu 37oC selama 1 jam. Selanjutnya ditambahkan 100
µl 5 M NaCl dan 100 µl 10% CTAB/NaCl yang telah dihangatkan terlebih dahulu
(65oC) selanjutya diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65oC. Kemudian
ditambahkan 500 µl campuran phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) lalu divortex hingga tercampur. Selanjutnya disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm.
Cairan yang terbentuk yang berada pada lapisan teratas dipindahkan ke dalam eppendof baru lalu ditambahkan 0,6 volum isopropanol dingin. Tabung eppendof dibolak-balik secara perlahan supaya tercampur selanjutnya selama 20
menit disimpan di suhu -20oC. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan
maksimal selama 5 menit pada suhu -4oC. Supernatan yang ada dibuang,
selanjutnya ditambahkan 1 ml etanol 70% dingin lalu disentrifugasi lagi pada kecepatan maksimum selama 2 menit. Supernatan dibuang kembali, lalu disimpan di suhu ruang hingga etanol menguap habis. Sebelum disimpan DNA ditambah dengan elution buffer atau aquabidest steril serta dilakukan pengecekan dengan elektroferesis.
b. Amplifikasi gen 16S-rRNA dengan PCR
Primer yang digunakan adalah primer universal untuk domain bakteri berupa forward primer 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan reserve primer 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA GGC-3’) (Marchesi et al., 1998). Semua komponen reaksi dicampur dalam microtube dan dimasukkan dalam mesin PCR. Tahapan PCR terdiri dari pre start 94oC, 2 menit; tahap denaturasi 92oC, 30 detik; tahap annealing 55oC, 30 detik, tahap elongasi 72oC selama 1 menit. Proses
tahap stop PCR pada suhu 4oC. Kemudian hasil PCR disimpan pada suhu -20oC, serta dilakukan pengecekan dengan elektroforesis.
Parameter yang diamati
a. Tingkat Kelangsungan Hidup Ikan Nila
Tingkat kelangsungan hidup ikan nila dihitung menggunakan rumus (Effendi 2002).
%
100
×
=
No
Nt
SR
Keterangan :SR = Kelangsungan hidup ikan (%)
Nt = Jumlah ikan yang hidup pada akhir penelitian (ekor) No = Jumlah ikan yang hidup pada awal penelitian (ekor)
b. Laju Pertumbuhan Bobot Harian Ikan Nila
Bobot rata-rata ikan nila diamati pada awal dan akhir penelitian dan pertumbuhan dihitung dengan menggunakan rumus (Effendi 2002)
%
100
1
×
−
=
tWo
Wt
α
Keterangan: α = laju pertumbuhan harian (%)
Wt = bobot akhir (g)
W0 = bobot awal (g)
c. Populasi Bakteri
Populasi bakteri yang dihitung yaitu jumlah S. iniae di otak dan darah. Jumlah bakteri dihitung berdasarkan rata-rata jumlah koloni yang tumbuh dikalikan dengan faktor pengenceran.
Analisis Statistik
Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari tujuh perlakuan dan tiga ulangan. Variabel-variabel yang diuji secara statistik terdiri atas : tingkat kelangsungan hidup, pertumbuhan ikan nila, dan jumlah S. iniae dalam otak dan darah. Sedangkan nilai zona hambat dianalisa secara deskriptif. Untuk mengetahui pengaruh bakteri probiotik terhadap setiap variabel, maka dianalisa keragamannya dengan ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Duncan pada selang kepecayaan 95%.