Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboraturium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Biologi dan Jaringan Sel Balai Besar Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian dan di Laboraturium Kultur Jaringan Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakutas Pertanian IPB, berlangsung mulai dari Juni 2010 sampai Mei 2011
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan adalah jaringan nuselus jeruk keprok Batu 55 dari buah muda berumur 60 - 70 hari setelah antesis. Media tanam yang digunakan media Murashige & Skoog (1962), Murashige & Tucker (1969) dan MW (MS modifikasi, Husni et al. 2010) kombinasi zat pengatur tumbuh (2,4-D, BAP, Picloram, Kinetin, ABA, GA3, NAA, IAA, dan IBA). Vitamin yang digunakan meliputi vitamin MS Vitamin MT dan vitamin Morel & Wetmore. Sedangkan alat yang digunakan air flow cabinet, dan perlengkapan kultur jaringan lainnya
Metode Percobaan
Penelitian ini dilakukan dalam 7 tahap kegiatan: 1) induksi kalus
embriogenik. 2) proliferasi kalus embriogenik. 3) pendewasaan ES. 4) perkecambahan ES. 5). multiplikasi 6) induksi akar ES. 7) penghitungan
kromosom. 8) aklimatisasi ES. 9) grafting tunas ES
1. Induksi Kalus Embriogenik
Induksi kalus bertujuan untuk mendapatkan kalus yang bersifat embriogenik. Rancangan lingkungan yang digunakan untuk induksi kalus adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor dengan empat perlakuan media terdiri dari: M1 = Murashige dan Tucker (MT) + 3 mg/l BAP + 1mg/l 2,4-D. M2 = Murashige dan Skoog (MS) + 3 mg/l BAP. M3 = MS + vitamin Morell dan Wetmore (MW). M4 = MT + 0,5 mg/l NAA + 1,5 mg/l BAP. Semua media perlakuan ditambahkan 500 mg/l ekstrak malt. Ulangan 20 kali dimana satu
ulangan adalah satu botol sebagai unit percobaan dengan enam eksplan. Bahan yang digunakan adalah buah jeruk keprok Batu 55 muda yang berumur 60 - 70 hari setelah antesis. Buah disterilisasi dengan alkohol 96% selama 15 menit kemudian dilewatkan pada bunsen hingga api padam lalu dibilas dengan aquades steril sebanyak tiga kali. Kulit jeruk dibuka di bawah kondisi steril. Biji muda diambil dari buah dan dipindah pada petridish steril dengan bantuan stereo microscope, bagian nuselus (Gambar 4) ditanam pada berbagai kombinasi media perlakuan.
Pengamatan pada percobaan ini meliputi perkembangan eksplan. Peubah yang diamati adalah: waktu terbentuknya kalus (hari), jumlah PEM (pre embrio) dan persentase pembentukan kalus. Peresntase pembentukan kalus didapat dengan cara :
2. Proliferasi Kalus.
Prolifersai kalus embriogenik bertujunan untuk mendapatkan populasi PEM yang banyak. Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah kalus embriogenik yang diperoleh dari hasil induksi kalus pada percobaan satu. Data diolah berdasarkan standar deviasi setiap perlakuan pada setiap minggu. Kalus disubkultur pada media perlakuan yang terdiri dari: MK1 = MS + 500 mg/l Ekstrak malt. MK2 = MS + 300 mg/l Casein hidrolisat. MK3 = MW + 500 mg/l Ekstrak malt. MK4 = MW + 300 mg/l Casein hidrolisat. Semua media kultur ditambah 3 mg/l BAP. Peubah yang diamati adalah: penambahan diameter kalus per minggu.
Gambar 4. Pengamatan mikroskopik dengan binokular (jaringan nuselus dan embrio zigotik keprok Batu 55 ).
Nuselus
Nuselus Zigotik
Jumlah kalus yang terbentuk Jumlah eksplan X 100 %
3. Pendewasaan Embrio Somatik
Pendewasaan embrio somatik bertujuan agar didapat embrio dewasa pada fase kotiledon. Rancangan lingkungan yang digunakan adalah RAL satu faktor dengan empat perlakuan taraf konsentrasi ABA yaitu: 1.5 mg/l, 2 mg/l, 2.5 mg/l dan 3 mg/l dengan media dasar MW diulang 10 kali. Satu ulangan adalah satu botol sebagai unit percobaan dengan 15 struktur globular. Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah struktur globular yang diperoleh dari percobaan dua. Peubah yang diamati adalah: perubahan globular menjadi fase jantung, fase terpedo, kotiledon, dan efisiensi pendewasaan. Efisiensi pendewasaan didapatkan dengan cara :
4. Perkecambahan Embrio Somatik.
Perkecambahan kotledon bertujuan agar didapat planlet dengan sturktur bipolar. Rancangan lingkungan yang digunakan adalah RAL satu faktor dengan empat perlakuan konsentrasi GA3 yaitu: 1.5 mg/l, 2 mg/l, 2.5 mg/l dan 3 mg/l dengan media dasar MW diulang 10 kali. Satu ulangan adalah satu botol sebagai unit percobaan dengan 10 struktur kotiledon. Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah struktur kotiledon yang diperoleh dari percobaan tiga dan ditanam pada media dasar MW. Peubah yang diamati adalah jumlah planlet yang terbentuk dan fisiensi perkecambahan. Efisiensi perkecambahan didapatkan dengan cara :
5. Multiplikasi Tunas
Multiplikasi tunas bertujuan agar didapat duplikasi tunas. Rancangan lingkungan yang digunakan adalah RAL satu faktor dengan lima perlakuan konsentrasi biotin yaitu: 0 mg/l, 1 mg/l, 3 mg/l, 5 mg/l, dan 7 mg/l dengan media dasar MW diulang 15 kali. Satu ulangan adalah satu botol sebagai unit percobaan dengan 5 tunas emrbrio somatik. Multiplikasi tunas embrio somatik menggunakan tunas ES yang didapat pada percobaan empat dan ditanam pada media dasar MW. Peubah yang diamati adalah embrio somatik yang bertunas, jumlah tunas, umur muncul tunas dan efisiensi multiplikasi tunas.
Efisiensi multiplikasi tunas :
Jumlah tahap pendewasaan ES
(fase jantung, fase terpedo dan kotiledon) Jumlah globular awal X 100 %
Jumlah planlet yang terbentuk
Jumlah fase kotiledon awal X 100 %
Jumlah tunas yang bermultiplikasi
6. Induksi Perakaran
Induksi akar dilakukan dengan tujuan agar didapat akar sekunder pada tunas. Rancangan lingkungan yang digunakan adalah RAL satu faktor dengan ulangan 15 kali. Satu ulangan adalah satu botol sebagai unit percobaan dengan 1 tunas emrbrio somatik. Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah planlet hasil perkecambahan yang dihasilkan dari percobaan lima dan ditanam pada media MW. Percobaan dilakukan pada berbagai jenis auksin (IBA, NAA, dan IAA) konsentrasi 3 mg/l. Sebagai kontrol tunas tanpa media auksin. Peubah yang diamati adalah: umur muncul akar, jumlah akar, panjang akar dan efisiensi induksi akar.
Efisiensi induksi akar : 7. Penghitungan Kromosom
Penghitungan kromosom dilakukan dengan metode praperlakuan lengkap (Sastrosumarjo 2006). 20 Sampel akar diambil secara acak kemudian diberi perlakuan. Pengamatan dilakukan dibawah microscope. Penghitungan kromosom diulang 10 kali pada setiap sampel.
8. Embrio Somatik Sekunder
Bahan yang digunakan adalah embrio somatik sekunder yang didewasakan pada media dengan konsentrasi ABA terbaik embrio somatik primer. Peubah yang diamati adalah perubahan globular menjadi fase jantung, fase terpedo, kotiledon, dan efisiensi pendewasaan. Perkecambahan embrio somatik sekunder pada media dengan konsentrasi GA3 terbaik embrio somatik primer. Peubah yang diamati adalah jumlah planlet yang terbentuk dan efisiensi perkecambahan.
9. Aklimatisasi
Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah planlet ES yang mempunyai akar primer dan skunder hasil induksi perakaran. Percobaan dilakukan pada planlet 20 ES hasil induksi perakaran dan 20 ES tanpa induksi perakaran. Media aklimatisasi yang digunakan merupakan campuran sekam dan kompos. Peubah yang diamati adalah: jumlah dan persentase tunas embrio somatik yang bertahan hidup.
Jumlah tunas yang berakar
10. Grafting
Grafting dilakukan dengan tujuan agar tunas in vitro dapat menyesuaikan diri dengan batang bawah.Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah tunas ES sebanyak 40 tunas. Batang bawah yang digunakan jeruk JC (Japanese Citroen). Peubah yang diamati adalah jumlah daun baru, tinggi tunas setelah grafting dan persentase tunas yang hidup setelah digrafting. Efisiensi tunas yang hidup dapat dicari dengan cara : Jumlah tunas grafting hidup