Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penyakit Tumbuhan, Program Studi Agroekoteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, pada ketinggian tempat ± 25 meter di atas permukaan laut pada bulan Agustus sampai Nopember 2012.
Bahan dan alat Bahan
Adapun bahan yang digunakan selama melaksanakan penelitian adalah media Potato Dextrose Agar (PDA), media Water Agar (WA), NaOCl 2%, bibit markisa sehat, patogen F. oxysporum f.sp. passiflora, cling wrap, kapas, alumunium foil, kertas stensil, air steril, aquades, alkohol 70 dan 96%, beras.
Alat
Adapun alat yang digunakan pada penelitian ini adalah lampu UV short wave ultra violet 254 nm (230 Volts, 50 Hz 17 Amps), cawan petri diameter 9 cm, erlemeyer, gelas ukur, tabung reaksi, batang L, hot plate, jarum inokulum, pipet volumetrik, mikroskop binokuler, autoclave, timbangan analitik, Laminar Air Flow (LAF), haemocytometer, inkubator, oven, kulkas, jangka sorong, kamera digital, Leaf Area Meter.
Metode penelitian
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) Non Faktorial dengan 10 perlakuan, yaitu :
1. M0 2. M
: tanpa pemaparan UV
1
3. M
: pemaparan UV selama 1 menit
2
4. M
: pemaparan UV selama 3 menit
3
5. M
: pemaparan UV selama 6 menit
4
6. M
: pemaparan UV selama 9 menit
5
7. M
: pemaparan UV selama 12 menit
6
8. M
: pemaparan UV selama 15 menit
7
9. M
: pemaparan UV selama 30 menit
8
10.M
: pemaparan UV selama 45 menit
9
Ulangan yang digunakan adalah sebanyak 3 ulangan, yaitu ulangan A, B dan C. Sehingga total unit percobaan adalah 10 x 3 = 30 unit
: pemaparan UV selama 60 menit
Kombinasi perlakuan yang diperoleh adalah adalah sebagai berikut: M0A M0B M0 M C 1A M1B M1 M C 2A M2B M2 M C 3A M3B M3 M C 4A M4B M4 M C 5A M5B M5 M C 6A M6B M6 M C 7A M7B M7 M C 8A M8B M8 M C 9A M9B M9C
Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan sidik ragam berdasarkan model linier sebagai berikut :
Yij Dimana :
= µ + αi + ∑ij
Yij
µ = efek nilai tengah
= respon atau nilai pengamatan pada perlakuan ke-i αi = efek dari perlakuan taraf ke-i
∑ij = efek error (Sastrosupadi, 2000). Pelaksanaan penelitian
Pembuatan media PDA
Kentang 250 g dipotong dadu kecil kemudian direbus dalam 1 l air, Setelah air mendidih dan kentang matang, disaring dan diambil air saringannya. Dekstrosa 20 g dan agar 20 g dimasukkan dalam air hasil saringan. Dipanaskan lagi sampai agar larut dan homogen. Setelah mendidih disaring dan ditambah air sampai volume akhir 1 l, dimasukkan dalam erlemeyer kemudian disumbat kapas dan ditutup dengan
alumunium foil, disterilkan dengan autoclave pada suhu 121°C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit (Nasikhah, 2008).
Penyediaan sumber inokulum 1. Fusarium oxysporum tipe liar
Isolasi F. oxysporum tipe liar dilakukan dengan memotong jaringan akar atau pangkal batang yang menunjukkan gejala layu Fusarium. Jaringan tersebut disterilisasi permukaan dengan larutan NaOCl 2%, dicuci dengan air steril sebanyak tiga kali dan diinokulasi pada media PDA sampai mendapat kultur murni (Riswanto, 2010)
b
a
Gambar 4. Fotomikrograf spora tunggal pada media WA setelah 20 jam perbesaran 1000x (a) spora, (b) buluh kecambah.
Spora tunggal (Gambar 4) diperoleh dengan mengencerkan suspensi spora yang berasal dari kultur murni F. oxysporum f.sp. passiflora berumur 7 hari pada media PDA. Pada pengenceran 10-3 dan 10-4,masing-masing disebar 0,5 ml pada permukaan media WA dan diinkubasi selama 16-20 jam pada suhu kamar. Spora yang berkecambah diamati dibawah mikroskop binokuler, ditandai dan spora langsung dipindahkan pada media PDA. Diinkubasi selama 7 hari pada suhu kamar. Biakan murni hasil spora tunggal akan menjadi sumber inokulum yang digunakan pada penelitian ini.
2. Fusarium oxsysporum f.sp. passiflora tipe mutasian
Biakan F. oxysporum tipe liar dari isolasi spora tunggal digunakan dalam pembuatan isolat tipe mutasitan. Suspensi spora dibuat dengan menambahkan 20 ml air steril ke atas permukaan biakan murni F. oxysporum tipe liar berumur 7 hari dan diencerkan sampai 107 spora/ ml. Sebanyak 1 ml suspensi spora dengan kerapatan 107 spora/ml, disebar pada permukaan cawan petri berdiameter 9 cm berisi media PDA. Sebaran spora pada cawan petri di bawah lampu UV panjang gelombang 254 nm diletakkan dengan jarak 5 cm (Gambar 3-b). Diinkubasi selama 7 hari pada suhu kamar (Susanti et al. 2009).
Uji antagonisme F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian terhadap F. oxsysporumf.sp. passifloratipe liar di laboratorium
Isolat F. oxysporum f.sp. passiflora tipe liar dan tipe mutasian yang telah dibiakkan selama 5x24 jam pada suhu kamar diuji dengan metode dual culture. Pada media PDA dibuat cakram dengan bor gabus berdiameter 0,8 cm. Satu cakram koloni F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian diletakkan 1 cm dari tepi cawan petri, sedangkan cakram koloni F. oxysporum tipe liar diletakkan tepat di tengah petri (Gambar 5) (Purwantisari et al. 2008).
Gambar 5. Bagan pengujian antagonis metode dual culture (a) F. oxysporum f.sp.
passiflora tipe mutasian (b) F. oxysporum f.sp. fassiflora tipe liar
Uji patogenesitas F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian terhadap bibit markisa (bio assay)
1. Persiapan media pembibitan
Media pembibitan yang digunakan adalah tanah top soil steril, dimasukkan ke dalam polibeg ukuran ¼ kg.
2. Penanaman benih markisa
Ditanam dua benih Markisa setiap satu polibeg, setelah tumbuh hanya digunakan satu bibit yang paling sehat untuk pengujian.
3. Pemeliharaan tanaman
Bibit Markisa yang telah tumbuh disiram setiap pagi dan sore hari, serta dilakukan satu kali pemupukan dengan menggunakan pupuk urea setiap polibeg dengan dosis yang dianjurkan, yaitu 0,25-1 g/bibit (Rukmana, 2012).
4. Perbanyakan isolat F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian
Fusarium oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian diperbanyak pada media beras steril masing-masing 10 g dan diinkubasikan selama 7 hari suhu kamar (Nasikhah, 2008).
5. Aplikasi isolat F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian
Aplikasi isolat F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian dilakukan saat tanaman Markisa berumur 1,5 bulan dengan menabur substrat pada daerah perakaran yang telah dilakukan pelukaan (Astiko et al. 2009).
Peubah amatan
Daerah hambatan (inhibiting zone)
Pengamatan dilakukan dengan mengukur daerah hambatan yang
dihasilkan F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian terhadap F. oxsysporumtipe liar. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan rumus yang
dikemukakan oleh Fokkema (1973) dalam Dharmaputra et al. (1990), yaitu: r1 – r I = x 100% 2 r dimana : 1 I = persentasi hambatan
r1 = jari-jari F. oxsysporumtipe liar yang menjauhi F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian
r2 = jari-jari F. oxsysporum tipe liar yang mendekati F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian
Pengamatan makroskopis dan mikroskopis F. oxysporum Tipe Mutasian dan Tipe Liar
Pengamatan makroskopis dilakukan dengan mengamati morfologi, bentuk dan warna F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian secara langsung. Sedangkan untuk pengamatan mikroskopis diamati dengan menggunakan bantuan mikroskop binokuler.
Luas pertumbuhan koloni F. oxysporum tipe liar
Pengukuran luas pertumbuhan koloni isolat tipe liar dilakukan dengan cara menggambar pola luas pertumbuhan jamur tipe liar pada plastik transparan, digunting sesuai pertumbuhan dan dihitamkan, dan diukur dengan menggunakan leaf area meter.
Diameter koloni F. oxysporum tipe liar
Pengukuran diameter koloni dilakukan dengan mengukur panjang diameter koloni F. oxysporum tipe liar sejajar dengan F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian yang terbentuk akibat hambatan dari koloni isolat tipe mutasian.
Keparahan penyakit
Pengamatan keparahan penyakit dilakukan mulai 1 hsi sampai terdapat
tanaman mati, yaitu dengan mengamati respon layu tanaman akibat inokulasi F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian. Persentase keparahan penyakit dapat
∑ (ni x vi
I = x 100% )
N x Z Dimana :
I : intensitas serangan penyakit (keparahan penyakit) ni
v
: jumlah tanaman yang terserang
i
N : nilai kategori tertinggi
: nilai kategori dari tanaman terserang
Z : jumlah seluruh tanaman yang diamati ( Saragih et al. 2006). Skala intensitas penyakit layu Fusarium markisa adalah:
0 : tidak ada gejala layu 1 : gejala layu ringan 2 : gejala layu sedang 3 : gejala layu berat
4 : tanaman mati ( Saragih et al. 2006).
Kejadian penyakit
Pengamatan kejadian penyakit dilakukan mulai 1 hsi, yaitu dengan mengamati tanaman terserang akibat patogen F. oxysporum f.sp. passiflora tipe mutasian pada tanaman. Persentase kejadian penyakit dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
a
P = x 100% a + b
Dimana :
P : persentase serangan penyakit (kejadian penyakit) a : jumlah tanaman yang terserang penyakit