Penelitian dilakukan di asrama Tingkat Persiapan Bersama (TPB), Institut Pertanian Bogor (IPB) pada bulan Maret-September 2012. Analisis kadar malondialdehid (MDA) plasma dilakukan di laboratorium Biokimia, Departemen Gizi Masyarakat Institut Pertanian Bogor (IPB). Analisis kadar hemoglobin dilakukan di Laboratorium klinik Prodia Bogor.
Desain Penelitian
Desain penelitian ini adalah eksperimental semu (Quasi Experimental) dengan 4 kelompok perlakuan, dimana kelompok pertama adalah remaja yang menerima suplemen multivitamin mineral A dan anemia (intervensi anemia), kelompok dua adalah remaja yang menerima suplemen multivitamin mineral A dan tidak anemia (intervensi non-anemia), kelompok ketiga adalah remaja anemia yang menerima suplemen B (kontrol anemia), dan kelompok keempat adalah remaja tidak anemia yang menerima suplemen B (kontrol non-anemia). Penelitian yang dilakukan bersifat tersamar ganda (double blind), di mana baik peneliti maupun subjek tidak mengetahui apakah suplementasi yang diberikan mengandung multivitamin dan mineral atau tidak (plasebo).
Teknik dan Penarikan Contoh
Populasi dalam penelitian ini adalah remaja wanita tahap akhir di asrama putri Tingkat Persiapan Bersama (TPB) IPB berusia 18–21 tahun (Monsk 2002) yang menderita anemia. Sampel adalah mahasiswa putri TPB-IPB tingkat pertama yang merupakan remaja usia 18–21 tahun yang memiliki kadar hemoglobin <12mg/dL yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi serta bersedia ikut penelitian. Kriteria inklusi dalam penelitian ini adalah remaja wanita usia 18-21 tahun, kadar hemoglobin kurang dari 12 g/dl (Hb< 12 g/dl) dan bersedia mengikuti tahap penelitian. Sedangkan kriteria ekslusi dalam penelitian ini adalah menderita penyakit kronis, mengandung, peminum alkohol dan atau obat-obatan yang terlarang, serta merokok.
Pemilihan sampel dilakukan dengan melakukan screening kadar hemoglobin terhadap mahasiswa tingkat I IPB. Mahasiswa yang anemia, diundang untuk menghadiri acara sosialisasi penelitian dan diajak untuk berpartisipasi dalam penelitian. Dalam sosialisasi tersebut, peneliti menjelaskan mengenai latar belakang, teknis pelaksanaan, manfaat dan resiko penelitian.
Mahasiswa yang diundang juga mendapat penjelasan tertulis dan lembar informed consent. Bagi mereka yang berminat, diminta untuk mengisi dan mengembalikan lembar informed consent dalam waktu sampai seminggu setelah acara sosialisasi.
Penentuan jumlah subjek dilakukan dengan menggunakan minimum sample size for estimating difference mean between groups (Lameshow et al. 1997). Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh jumlah subjek minimal, yaitu 4 orang. Untuk menghindari drop out pada saat penelitian ditambahkan minimal 2 orang subjek dari jumlah minimal sehingga total subjek yang digunakan yaitu 24 orang. Perhitungan untuk jumlah subjek adalah sebagai berikut.
n
n
n Keterangan:
n = Jumlah subjek minimal
Zα = 1.96 (α= 5%)
Zβ = 1.28 (β= 10%), power of test = 90% S2 = standar deviasi (0.14)
X1 = mean kadar MDA setelah intervensi (berdasarkan penelitian Amagase et al. 2008, yaitu 3.48)
X2 = mean kadar MDA sebelum intervensi (berdasarkan penelitian Amagase et al. 2008, yaitu 3.81)
Pengelompokan sampel ke dalam kelompok-kelompok tersebut (intervensi dan kontrol) dilakukan secara purposif dengan mempertimbangkan rata-rata nilai Hb awal dari setiap kelompok. Pengelompokan secara purposif ini bertujuan supaya tidak ada perbedaan rataan kadar Hb yang nyata antara kedua kelompok (intervensi dan kontrol).
Pelaksanaan Suplementasi
Keseluruhan suplemen multivitamin dan mineral dan plasebo diproduksi dalam waktu yang bersamaan oleh salah satu Perseroan Terbatas di Indonesia. Suplemen dan plasebo dalam bentuk sirup dan dikemas dalam botol kaca gelap dan diberi label A dan B. Peneliti dan subyek penelitian tidak mengetahui label A atau B yang merupakan suplemen atau plasebo.
Suplemen multivitamin mineral (MVM) dan plasebo diberikan secara acak kepada 2 kelompok yang berbeda. Setiap subyek penelitian mengonsumsi sirup sebanyak 15 ml/hari sesuai takaran sajinya selama 8 minggu. Untuk menjaga kepatuhan konsumsi sirup, dilakukan berbagai upaya diantaranya melalui sosialisasi pada awal kegiatan, penjelasan pada saat pengumpulan data baseline, dan dilakukan penyuluhan setiap minggu terkait konsumsi suplemen tersebut. Rancangan kelompok perlakuan pemberian suplemen ditampilkan dalam Gambar 4 dan Tabel 3.
Gambar 4 Rancangan penelitian
Tabel 3 Kandungan zat gizi suplemen multivitamin mineral
No. Kelompok perlakuan Jenis Suplemen Mikronutrien Kandungan/15mL 1. Intervensi Suplemen Multivitamin Mineral Vitamin B1 15 mg Vitamin B2 2.25 mg Vitamin B3 22.5 mg Vitamin B6 3 mg Vitamin B12 15 µg Vitamin C 150 mg Ferro gluconate 20 mg Calcium gluconate 100 mg Mangan sulfate 2 mg Zinc sulfate 5 mg 2 Kontrol Plasebo - -
Jenis dan Cara Pengumpulan Data
Peubah yang dikumpulkan selama penelitian meliputi karakteristik sampel, status gizi sampel (ukuran antropometri dan persen lemak tubuh), konsumsi pangan dan asupan zat gizi, asupan total antioksidan, dan status oksidatif (MDA plasma).
Tabel 4 Variabel, indikator dan cara pengumpulan data
No Variabel yang diamati
Indikator Cara pengumpulan data
1 Karakteristik sampel
Tempat dan tanggal lahir, alamat orang tua, lokasi kamar asrama, pemasukan setiap bulan (uang saku, beasiswa, dan penghasilan lain) dan status perkawinan
Wawancara dengan kuisiner
2 Status gizi sampel (ukuran
antropometri)
Indeks Massa Tubuh, Komposisi lemak tubuh
Penimbangan BB dan pengukuran TB, Pengukuran komposisi lemak tubuh. 4 Konsumsi pangan
dan asupan zat gizi serta asupan antioksan total
Kebiasaan makan, frekuensi pangan, dan jumlah dan jenis pangan yang dikonsumsi Konsumsi energi, P, Fe, Zn, Mn, Ca, Vit B kompleks, Vit C Asupan total antioksidan
Food record, food frequency
5 Status besi Kadar hemoglobin Analisis laboratorium metode cyanmethemoglobin
6 Status oksidatif Kadar MDA Analisis di laboratorium
dengan pengukuran reaksi TBARS dengan metode kolorimetri
Karakteristik sampel penelitian yang dikumpulkan adalah tanggal lahir, alamat orang tua, lokasi kamar asrama, pemasukan setiap bulan (uang saku, beasiswa, dan penghasilan lain), pengeluaran pangan per bulan dan status perkawinan. Data karakteristik tersebut dikumpulkan pada saat baseline melalui wawancara dengan alat bantu kuisioner.
Data antropometri dikumpulkan pada saat sebelum (baseline) dan setelah intervensi (endline). Pengukuran antropometri yang dilakukan adalah pengukuran berat badan, tinggi badan, dan persen lemak tubuh. Pada saat pengukuan antropometri, subjek diminta untuk menggunakan pakaian seminimal mungkin dan diusahakan pada 2 kali pengukuran menggunakan pakaian yang sama untuk memperoleh data yang akurat.
Data konsumsi pangan yang dikumpulkan berupa kebiasaan makan (frekuensi pangan) dan jumlah serta jenis pangan yang dikonsumsi. Data kebiasaan makan dikumpulkan pada saat baseline melalui wawancara menggunakan alat bantu kuisioner. Kuisioner Semi Food Frequency Questionnaire (semi FFQ) diberikan sebelum intervensi untuk mengetahui frekuensi pangan sebelum. Data jumlah dan jenis pangan yang dikonsumsi diperoleh melalui pengisian kuisioner food record yang dilakukan oleh subyek 2 kali setiap minggu (selama 8 minggu intervensi). Pencatatan konsumsi pangan
dilakukan pada hari kuliah dan hari libur. Berdasarkan data Food Record tersebut di hitung total asupan zat gizi dan total antioksidan yang dikonsumsi.
Kadar MDA dianalisis di laboratorium pangan dan gizi Departemen Gizi Masyarakat, Fakultas Ekologi Manusia, Institut Pertanian Bogor. Pengukuran kadar MDA dilakukan dengan cara melakukan Tes thiobarbituric acid-reactive subtance (TBARS). Metode pengukuran TBA yang digunakan tersebut adalah metode uji Asam Tiobarbiturat (TBA) (Jamil 2010 dalam Faigayanti 2012). Prinsip analisis MDA dengan metode ini adalah asam lemak tidak jenuh dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksidasi lipid kemudian mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA). MDA bila direaksikan dengan asam TBA membentuk senyawa merah muda. Tahapan-tahapan analisis kadar malondialdehid tersebut ditampilkan dalam Lampiran 1.
Selama intervensi, setiap minggu kepada subyek penelitian juga dibagikan formulir untuk melaporkan pengkonsumsian sirup MVM yang telah diberikan. Selama sintervensi dilakukan, subyek disarankan untuk tidak menggunakan suplemen dalam bentuk apapun kecuali obat dengan resep dokter.
Pengolahan dan Analisis Data
Data-data yang diperoleh diolah dan dianalisis secara statistik dengan menggunakan Microsoft Excel 2007 dan SPSS Statistics 16.0. Data konsumsi dari food record dan semi FFQ direkap untuk diidentifikasi berbagai jenis, ukuran, dan frekuensi pangan yang telah dikonsumsi oleh subyek. Kemudian dari daftar tersebut dilakukan survei ke tempat penjual makanan di sekitar kampus (luar dan dalam) untuk menentukan harga dan porsinya (dari URT menjadi gram). Data jenis pangan yang telah berhasil diidentifikasi kemudian dikonversi ke dalam zat gizi menggunakan Software Nutrisurvey. Jenis zat gizi yang diidentifikasi adalah energi, karbohidrat, lemak, protein dan beberapa zat gizi mikro (vitamin A, B1, B2, B6, vitamin C, kalsium, besi dan seng). Beberapa zat gizi mikro seperti Vitamin B3, B12 dan mangan tidak dapat diidentifikasi karena keterbatasan instrumen yang digunakan. Kecukupan energi dan zat gizi remaja dihitung dengan menggunakan Angka Kecukupan Gizi (WNPG 2004). Asupan
antioksidan dihitung menggunakan perhitungan total antioksidan pangan dalam mmol/100 g yang tercantum dalam Carlsen et al. 2010.
Penggolongan pangan dalam kuisioner food frequency juga digolongkan menjadi pangan kaya antioksidan (riched antioxidant), kandungan pangan tinggi
antioksidan (high antioxidant food), dan kandungan pangan antioksidan sedang (medium antioxidant), berdasarkan Carlsen et al. (2010). Golongan pangan kaya antioksidan (riched antioxidant) adalah rempah-rempah dan tumbuh-tumbuhan bumbu, obat-obatan herbal/tradisional, dan suplemen vitamin makanan. Kandungan pangan tinggi antioksidan (high antioxidant) dan sedang (medium antioxidant food) berurutan adalah berries dan produk berry, buah-buahan dan jus buah, sayur-sayuran dan produk olahan sayur, kacang-kacangan dan biji- bijian, sereal sarapan, cokelat dan gula-gula, dan berbagi jenis minuman (beverage). Carlsen et al. (2010), megestimasi total antioksidan dengan menggunakan metode The Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP). FRAP adalah alat biomonitoring yang sangat sensitif dan cepat dalam mencari nilai total kekuatan antioksidan (antioxidant power) dari cairan biologis. Metode FRAP dapat digunakan untuk plasma dan berbagai ekstrak cairan dan etanolik dari berbagai makanan, tumbuhan, minuman dan obat-obatan untuk menghasilkan total antioksidan bersih (Nesaretnam & Packer 2001).
Analisis data yang digunakan adalah deskriptif dan statistik. Analisis secara deskriptif (persentase dan rata-rata) digunakan dalam menganalisis karakteristik sampel, konsumsi pangan, meliputi tingkat kecukupan energi dan zat gizi remaja, alokasi pengeluaran, status gizi (ukuran antropometri), dan status oksidatif plasma (kadar MDA plasma). Analisis statistik yang digunakan adalah uji paired-sample t-test digunakan untuk membandingkan signifikansi peubah parametrik sebelum dan sesudah suplementasi, uji Anova untuk menguji kehomogenisasian data antar kelompok perlakuan, dan uji Anova Duncan untuk melihat kelompok yang paling berbeda signifikan. Selain itu digunakan pula analisis korelasi untuk melihat hubungan asupan zat gizi antioksidan terhadap perubahan kadar malondialdehid serta melihat korelasi antara hemoglobin dengan kadar malondialdehid. Pengkategorian variabel dan kriteria untuk setiap variabel dapat dilihat dalam Tabel 5.
Tabel 5 Kategori dan kriteria untuk setiap variabel penelitian
No Variabel Kategori Kriteria
1 Usia (Badriah 2005) Remaja pertengahan Remaja akhir 14-17 tahun 18-21 tahun 2 Tingkat kecukupan energi
dan protein (Depkes 1996)
Defisit tingkat Berat Defisit tingkat sedang Defisit tingkat ringan Normal < 70% kebutuhan 70-79% Kebutuhan 80-89% kebutuhan 90-119% kebutuhan Lebih ≥120% Kebutuhan
3 Tingkat kecukupan vitamin dan mineral (Gibson 2005)
Kurang Cukup
<77% AKG
Tabel lanjutan:
No Variabel Kategori Kriteria
4 Status gizi (WHO 2005) Kurang Normal Lebih Obes I IMT <18.5 18.5 ≤ IMT ≤ 24.9 25 ≤ IMT ≤ 29.9 30.0≤IMT≤39.9 5 Status besi (Kategori
Anemia) (ACC/SCN 1991 dalam Briawan 2008) Normal Anemia Ringan Anemia Sedang Hb≥12 10.0≤Hb<12.0 Hb<10.0 6 Status oksidatif (Kadar
MDA) (Wasowicz et al. 1993) Normal Tidak Normal MDA<1.01 µmol/L MDA>1.01 µmol/L Definisi Operasional
Sampel adalah remaja putri yang berstatus sebagai mahasiswa TPB-IPB tahun 2011/2012 yang berusia 18-21 tahun anemia dan non anemia.
Anemia adalah keadaan kadar hemoglobin (Hb) darah lebih rendah dari 12 g/dl yang dapat diakibatkan oleh defisiensi zat gizi atau infeksi
Anemia Gizi Besi adalah tahap yang paling parah dari defisiensi zat besi di dalam tubuh, dimana zat besi tidak cukup baik di dalam simpanan atau untuk sintesis hemoglobin. Indikator ini ditunjukkan oleh kadar hemoglobin yang rendah (<12 g/dl) dan serum feritin yang rendah (<15 mikro gram/L).
Asupan energi dan zat gizi makan adalah jumlah zat gizi yang dikonsumsi contoh pada hari kerja maupun pada hari libur yang diukur menggunakan Food Record.
Suplemen makanan adalah produk yang dimaksudkan untuk melengkapi kebutuhan zat gizi makanan, mengandung satu atau lebih bahan berupa vitamin, mineral, asam amino, atau bahan lain (berasal dari tumbuhan atau bukan tumbuhan) yang mempunyai nilai gizi dan atau efek fisiologis dalam jumlah terkonsentrasi.
Suplemen multi vitamin-mineral adalah jenis suplemen yang berisi berbagai jenis vitamin dan mineral yang dikombinasikan dalam satu bentuk (sirup).
Sirup plasebo adalah sirup dengan rasa, tekstur dan aroma yang hampir sama dengan sirup suplemen tetapi tidak mempunyai kandungan zat gizi mikro seperti suplemen.
Radikal bebas adalah suatu senyawa yang mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbit terluarnya yang menyebabkan
senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya. Antioksidan adalah senyawa yang dalam jumlah cukup dapat memberikan
perlindungan untuk melawan serangan oksidatif (Hudson 1990). Stres oksidatif adalah kondisi ketidakseimbangan antara antioksidan dan radikal
bebas.
Zat besi (Fe) adalah mikromineral yang paling banyak terdapat dalam tubuh manusia yang terlibat dalam pengangkutan oksigen dalam darah dan urat daging serta pemindahan/transfer elektron.
Malondialdehid (MDA) adalah produk oksidasi asam lemak tidak jenuh oleh radikal bebas yang juga merupakan metabolit komponen sel yang dihasilkan oleh radikal bebas. Konsentrasi MDA yang tinggi menunjukkan adanya oksidasi dalam membran sel (Conti et al. 1991 dalam Winarsi 2007).