ALI ZUM MASHAR
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2009
Pseudomonas sp.AZM-1 Melalui Mutagenesis Dengan Transposon
Nama Mahasiswa : Ali Zum Mashar
Nomor Pokok : P055040071 Program Studi : Bioteknologi
Menyetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Suharsono, DEA, Ketua
Dr. Aris Triwahyudi, M.Si.
Anggota
Diketahui Ketua Program
Studi Bioteknologi
Dr. Ir. Muhammad Jusuf, DEA.
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS.
Bismillairrahmanirrahiim,
Segala puji penulis panjatkan kepada Allah Subhanaahu Wa Ta’alaa atas limpahan berkat dan rahmat-Nya yang tiada terhingga sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini yang berjudul ” Isolasi Gen Yang Terlibat Dalam Pelarutan Fosfat Dari Pseudomonas aeroginosa Melalui Mutagenesis Dengan Transposon”.
Terima kasih penulis sampaikan kepada pihak-pihak yang telah membimbing dan membantu dengan penuh perhatian dan kecintaan selama proses penelitian ini baik secara langsung maupun tidak langsung. Terimakasih disampaikan kepada Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB yang telah menyediakan fasilitas penelitian ini. Untuk itu penulis menyampaikan terima kasih kepada:
1. Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku pembimbing yang telah meluangkan waktu didalam memberikan pembimbingan dan wawasan berfikir yang sangat berharga bagi penulis.
2. Dr. Aris Triwahyudi, M.Si selaku pembimbing yang telah memberi bimbingan, nasehat dan bahan selama proses penelitian bagi penulis.
3. Dr. Ir.Muhammad Jusuf, DEA selaku ketua Program Studi Bioteknologi SPs IPB.
4. Anak dan Istriku tercinta atas segala pengorbanannya yang memberikan dukungan moril dan materiil.
5. Teman-temanku: Firdaus (Btk), mbak Pepy (Biorin), mbak Arie (Seafast), Rika Indri Astuti (Biologi), Syahnada Jaya, Pak Mulya, Efrizal, dan teman-teman se-angkatan bioteknologi 2004 yang banyak membantu.
Akhirnya berharap Allah SWT memberikan balasan rahmat dan kebaikan kepada kita semua. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi kita semua.
Bogor, April 2009
Penulis dilahirkan di Bakung, Kec. Mijen, Kabupaten Demak, Propinsi Jawa Tengah pada tanggal 19 Mei 1972. Penulis adalah anak keenam dari tujuh bersaudara dari pasangan yang berbahagia H. M. Ali Mukti dan Hj. Sri Tasriah. Saat ini penulis telah menikah dengan Sonni Anna, SPt. dan dikaruniai tiga orang anak : Zumarizka Akbar Ibrahim, Kalyana Daeva Ali dan Mughni Vada Ali.
Penulis lulus dari SMU Negeri I Kudus tahun 1991 dan melanjutkan di Fakultas Pertanian UNSOED Purwokerto. Penulis pada bulan September 2004 melanjutkan pendidikan Sekolah Pascasarjana di Institut Pertanian Bogor, Program Studi Bioteknologi. Setelah lulus S1 (1997) bekerja sebagai PNS Deptrans dan PPH Kalteng dan saat ini menjadi peneliti di Puslitbangtrans Depnakertrans serta tenaga ahli di beberapa perusahaan swasta Nasional.
Selama mahasiswa penulis aktif di organisasi kegiatan kampus seperti ketua Badan Pelaksana Harian SMPT Unsoed, ketua Unit Kerohanian Islam (UKI) Faperta, ketua pembinaan UKKI Unsoed, ketua Perhimpunan Mahasiswa Agroindustri Jateng, ketua KSIMP Faperta, dan lain.lain. Penulis aktif di dalam kegiatan kompetisi keilmiahan antara lain mendapatkan Juara I LCTQ Unsoed (1993), Juara I LP2P4 Unsoed dan antar perguruan tinggi se-Jawa Tengah (1994), finalis Lomba Karya Inovatif Produktif Nasional LKIP (1994), Juara I LKTI Mapres Unsoed (1995), Juara I LP2PA (1995), Juara II LKTI Nasional di UGM (1996), juara harapan I pameran ilmiah PIMNAS IX dan menjadi mahasiswa berprestasi utama I Faperta Unsoed dan Mahasiswa berprestasi utama dan teladan Unsoed (1995), menerima beasiswa PERTAMINA, Supersemar dan PPA Dikti.
Beberapa hasil karya ilmiah penulis yang bersifat penemuan (invent) antara lain: Teknologi Bio Perforasi (International patent Reg: PCT/ID 01/00003.); Teknologi Pupuk Hayati Bio P 2000 Z (patent: ID 0000348S), Komposisi produk turunan dan cara pembuatan Pupuk Bio Perforasi (paten: ID 0016722, P20000368, P20000367); 21 jenis galur kedelai unggul baru produktivitas; Rekor Guiness Book MURI membuat ”Kedelai Raksasa” buah terlebat 2.400 – 3.030 polong/pohon dan setinggi “3,80 meter” dan ”4,5 meter”.
DAFTAR GAMBAR ...………….……..…… iv DAFTAR LAMPIRAN...……..…… vi PENDAHULUAN Latar Belakang...…………. 1 Tujuan Penelitian ...…………. 3 TINJAUAN PUSTAKA
Mobilitas Unsur Phosfat ...…………. 4 Mikroba Pelarut Phosfat ... 5 Peran Transposom dalam Mutagenesis... 7 aBAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian...…………. 9 Bahan...…………. 9 Metode Penelitian...…………. 10
Isolasi bakteri pelarut fosfat...…………. 11 Mutagenesis dengan Transposon ... 12 Seleksi mutan ...…………. 13 Isolasi DNA genom mutan P. aeroginosa ... 14 Pemotongan dan ligasi DNA yang mengandung mini-Tn5Km1 ... 15 Amplifikasi DNA yang diapit mini Tn5Km1 ... 16 Pengklonan hasil amplifikasi fragmen DNA pengapit mini Tn5... 17 Transformasi E. coli DH5α... ... 18 Seleksi transforman rekombinan...…………. 19 Isolasi Plasmid ... 19 Pengurutan nukleotida dan analisis bioinformatika ... 19 HASIL DAN PEMBAHASAN
Skrining Pseudomonas sp. mikroba pelarut fosfat ... 21 Mutagenesis dengan Transposon dan seleksi mutan ... 21 Isolasi dan pemotongan DNA genom total mutan negatif pelarut fosfat -
P. aereus ..... ... 22 Amplifikasi Fragmen DNA Pengapit MiniTn5 Menggunakan Inverse PCR... 23 Pengklonan dan Hasil Amplifikasi Fragmen DNA Pengapit mini Tn5... 24 Pengurutan fragmen DNA pengapit miniTn5... 26 Analisis Kesamaan Gen Sisipan Dengan Data Gen di Genbank... 28 Peta Enzim Restriksi Endonuklease fragmen ... 31 Urutan asam amino deduksi dari DNA yang disisipi Tn5………... ... 31 Analisis Domain Fragmen DNA Pengapit Tn5………... 33 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ... 35 Saran ... 35 DAFTAR PUSTAKA ... 36 LAMPIRAN... 40
Halaman 1. 2. 3. 4. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
Peta plasmid pUT mini-Tn5Km1 (7.055 kb) yang berada dalam sel E. coli S17- 1 (λ pir), peta restriksi transposon mini-Tn5Km1 (1.835 kb) yang membawa gen resistensi ...
Peta plasmid pGEMT-Easy ... Tahapan isolasi, pengklonan dan karakterisasi fragmen gen yang terlibat dalam pelarutan fosfat dari P. aeroginosa.... Diagram skematis proses mutagenesis dengan transposon. Konjugasi dilakukan di atas filter milipore (0.45 µm) pada media LB. Pada suspensi campuran donor (D) dengan resipien (R) akan terjadi serangkaian proses transfer dan penyisipan transposon ...
Proses mutagenesis dengan transposon. Konjugasi dilakukan di atas filter milipore (0.45 µm) pada media LA modifikasi. Pada suspensi campuran donor (D) dengan resipien (R) akan terjadi serangkaian proses transfer dan penyisipan transposon ...
Skema proses amplifikasi fragmen DNA genom pengapit transposon. a) DNA genom Pseudomonas Aereus mutan non pelarut phosfat yang dipotong dengan enzim EcoRV, b) Proses sirkularisasi menggunakan enzim T4 DNA ligase, c) Proses amplifikasi DNA genom pengapit transposon dengan inverse PCR ...
Penampilan koloni P. aeroginosa pembawa gen pelarut fosfat pada media phykovskaya: a. Peremajaan dari sel tunggal P. aeroginosa hasil isolasi, b. Pertumbuhan fase logaritmatik, c. Penampilan pertumbuhan murni pada media pykovskaya menunjukkan zona bening... Mutan P. aeroginosa padapikovskaya agar + Chl 50 µg/mL + Km 50 µg/mL yang diinkubasi selama 24 jam ... Penapisan terhadap mutan untuk mendapatkan mutan negatif pelarut fosfat: a. koloni P. aeroginosa tipe liar pelarut fosfat, b. mutan P. aeroginosa negatif pelarut fosfat... Elektroforesis gel agarose DNA genom mutan P. aeroginosa yang bukan pelarut fosfat... DNA hasil Inverse PCR (1. sampel; 2. penanda ukuran 1 kb plus). ...
9 10 11 13 15 16 21 22 22 23 24
12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. .
yang mengandung 100 μg/ml ampisilin, 10 l 100 mM isopropiltio-β- galaktosida (IPTG) (Promega) dan 50 l 2%(b/v) X-gal (5-bromo-4-choloro-3- indolyl-β-D-galactoside) (Promega) hasil inkubasi pada suhu 37°C semalam...………….... Hasil PCR dengan koloni putih sebagai cetakan. 1. penanda 1 kb plus; 2. koloni 1; 3. koloni 2; 4. koloni 3; 5. koloni 4. ……….……… Verifikasi palsmid rekombinan dengan pemotongan enzim restriksi EcoRI (1. penanda 1 kb plus; 2. plasmid tidak dipotong; 3. plasmid dipotong dengan EcoRI)... Urutan nukleotida dari DNA sisipan di dalam pGEM®-T Easy ….………. Urutan gen sesungguhnya yang diinaktivasi oleh mini-Tn5 ... Kesejajaran endonuklease 1 yang disandikan oleh gen endA dari Pseudomonas Fluorescen Pf-5……….……….. Dendogram filogenetik berdasarkan urutan nukleotida menunjukkan kesejajaran endonuklease P. aeroginosa dengan endonuklease I pada P. Fluorescens Pf-5. Filogenetik berdasarkan urutan nukleotida………...…….. Peta restriksi endonuklease1 (DNAse1) dari P. aeroginosa ………..………. Deduksi asam amino penyusun enzim DNAse1 berdasarkan kodon-kodon pada daerah ORF fragmen gen pada P. aeroginosa ….……….. Kesejajaran asam amino lokal fragmen EcoRV dari P. aeroginosa dengan endonuclease I (P. fluorescens Pf-5) YP_259205………. Daerah terjaga yang menunjukkan domain endonuclease 1 pada P. fluorescens Pf-5………. 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
Halaman 1. Hasil pengurutan nukleotida dengan primer T7 - SP6... 40 2. Komposisi berbagai media pertumbuhan Pseudomonas sp. AZM-1……...... 42 3. Multiple aligment Pseudomonas sp. AZM-1dengan berbagai strain mikroba
kekerabat... ... ... ... 43 4. Filogenetik tree nukleotida model real branch dan model cladogram... 48 5. Jarak genetik berdasarkan pada urut-urutan enzim DNAse I di GenBank dengan gen
Pseudomonas spp...... 49 6. Kesejajaran jarak genetik Pseudomonas sp. sesuai urutan enzim DNAseI………….. 50 7. Hasil analisis penyejajaran sesuai urutan nukleotida fragmen gen yang diperoleh
dengan transposon Tn5Km1 dari Pseudomonas sp.AZM-1 dengan yang dimiliki Pseudomonas spp lain pada data Gene Bank dengan menggunakan program Blast-n dan Blast-p... 51 8. Pohon filogenetik dari fragmen gen yang diperoleh dengan transposon Tn5Km1
Halaman 9. Hasil pengurutan nukleotida dengan primer T7... 40 10.Komposisi berbagai media pertumbuhan Pseudomonas sp.AZM-1..……...... 42 11.Multiple aligment Pseudomonas sp.AZM-1dengan berbagai strain mikroba
sekerabat... ... 43 12.Filogenetik tree nukleotida model real branch dan model cladogram... 48 13.Jarak genetik berdasarkan pada urut-urutan enzim DNAse I di GenBank dengan
gen Pseudomonas sp Jarak Genetik berdasarkan pada urut-urutan nukleotida gen
DNAse I di GenBank dengan gen Pseudomonas sp.AZM-1 ...... 49 14.Kesejajaran jarak genetik Pseudomonas sp.AZM-1 sesuai urutan enzim DNAseI.... 50 15.Hasil analisis penyejajaran sesuai urutan nukleotida fragmen gen yang diperoleh
dengan transposon Tn5Km1 dari Pseudomonas sp.AZM-1 dengan yang dimiliki Pseudomonas spp lain pada data Gene Bank dengan menggunakan program Blast-n dan Blast-p... 51 16.Pohon filogenetik dari fragmen gen yang diperoleh dengan transposon Tn5Km1
Salah satu penyebab sulitnya melakukan peningkatan produksi pangan yang cepat dan mencapai swasembada nasional adalah karena banyak hambatan dalam pengembangan lahan pertanian pangan yang baru. Pembukaan lahan subur pertanian pangan baru masih terbatas dan tidak berimbang dengan konversi lahan pertanian produktif menjadi fungsi lain seperti pemukiman di pulau Jawa. Konversi lahan pertanian ke industri dan pemukiman di Jawa mencapai 62.000 ha/tahun, sementara itu pemerintah melalui Deptan RI hanya menggantinya dengan membuka sawah baru seluas 18.000 ha/th. Padahal untuk mencapai swasembada pangan di Indonesia saat ini, sekurangnya diperlukan tambahan luas tanam 1 juta hektar yang berarti harus membuka lahan baru dan meningkatkan produktivitasnya. Sangat ironis jika melihat potensi lahan di Indonesia yang tersedia untuk pertanian masih besar dan belum dimanfaatkan secara optimal.
Membuka dan mencetak lahan baru untuk pertanian pangan di luar pulau Jawa melalui pengembangan lahan yang potensial untuk pertanian adalah solusi kecukupan pangan jangka panjang. Indonesia mempunyai lahan tidur (alang-alang) seluas 1,08 juta ha, lahan pasang surut potensial seluas 9,5 juta ha dan lahan marginal kering 11 juta ha. Bahkan dilaporkan oleh Suhartanto (2006), bahwa di Indonesia sebenarnya terdapat 45,79 juta ha tanah Podzolik Merah Kuning (PMK/Ultisol), 14,11 juta Ha tanah Oxisol dan 27,06 juta ha Gambut (histosol) yang merupakan potensi lahan yang bisa diupayakan untuk pertanian dan potensi lahan yang sesuai untuk sawah di Indonesia ada sekitar 23 juta hektar. Jenis tanah masam menempati 29,7 % dari luas total daratan Indonesia atau sekitar 90 juta hektar dengan tanah PMK menempati urutan teratas dalam hal luasannya.
Jutaan hektar lahan di atas kurang menarik untuk diupayakan sebagai lahan pertanian oleh karena banyaknya faktor pembatas produktivitas fisik dan kimia tanah seperti keadaan asam sehingga untuk mengatasi keasaman tersebut dengan
cara-cara konvensional cukup mahal, seperti pemberian kapur/dolomit untuk menetralisir pH. Penambahan pupuk fosfat (P) secara berkelebihan harus dilakukan pada lokasi ini agar unsur tersebut tersedia dan dapat diambil oleh tanaman. Disamping itu, kekurangan hara dan jasad renik penyubur di dalam tanah juga menjadi faktor pembatas produksi petani sehingga produktivitas tanaman budidaya yang dicapai rendah, seperti kedelai: 0,5 - 0,8 ton/ha, padi: 1,5 – 3,0 ton/ha, dan jagung: 2 – 3 ton/ha yang masih jauh di bawah potensi genetis komoditas ini.
Kekurangtersediaan hara fosfat (P) menurunkan hasil panen biji-bijian sampai 35%, bahkan lebih mirip gejala cekaman fisik seperti kekurangan air. Permasalahan fisiologis yang ditunjukkan oleh tanaman jika kekurangan unsur fosfat ini adalah terhambatnya metabolisme sel tanaman karena energi aktivasi sel yang terbatas sehingga ekspresinya akan menghambat tumbuhnya tunas secara normal, tanaman kerdil, daun tumbuh tidak normal, hijau ungu tua dan cepat kuning yang pada gilirannya menurunkan mutu dan jumlah/bobot hasil panen (Panday 1997)
Melalui Bioteknologi dengan rekayasa genetik yang diterapkan pada mikroba tanah atau tanaman, cekaman fisik di atas dapat diatasi sehingga tanaman dapat normal memanfaatkan unsur fosfat di alam secara cukup meskipun dalam jumlah ketersediaan yang terbatas (Mashar 2006). Beberapa mikroba penghasil enzim pelarut fosfat yang telah dikenal seperti Pseudomonas sp., Alcaligenes sp., Bacillus pumillus, Mycorhiza glamous, Aspergillus niger, dll. telah mulai banyak dimanfaatkan peranannya baik dalam pertanian, industri pupuk (Prihatini et al. 1966) bahkan industri pengolahan pangan dan pakan ternak. Fosfat yang dilarutkan menjadi tersedia untuk dapat diserap sel tanaman atau hewan. Enzim pelarut fosfat disandikan oleh suatu gen tertentu. Guna lebih memanfaatkan gen mikroba di atas maka isolasi gen penyandi pelarut fosfat khususnya dari bakteri Pseudomonas dilakukan dalam penelitian ini.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi gen yang terlibat dalam pelarutan fosfat dari bakteri Pseudomonas sp. AZM-1 melalui teknik transposon. Transposon yang digunakan dalam penelitian ini ialah mini-Tn5Km1 yang membawa gen
penanda resistensi terhadap kanamisin. Mini-Tn5Km1 merupakan salah satu tipe transposon turunan dari transposon Tn5 (de Lorenzo et al. 1990). Transposon ini dapat menyisip secara acak pada genom bakteri dan penyisipannya bersifat stabil (Herrero et al. 1990). Penyisipan mini-Tn5Km1 ke dalam genom akan menyebabkan bakteri tersebut memiliki sifat resisten terhadap kanamisin. Transposon mini Tn5 Km1 dalam penelitian ini digunakan sebagai pelacak dan penginaktivasi gen yang terlibat dalam pelarutan fosfat pada bakteri Pseudomonas sp. AZM-1.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
1. Melakukan pengklonan fragmen DNA genom yang terlibat dalam proses pelarutan fosfat melalui teknik mutagenesis dengan transposon.
Mobilitas Unsur Fosfat
Tanah asam adalah pembatas bagi pertumbuhan tanaman karena menyebabkan ion Fe, Al, Mn, dan Ca akan mengikat kuat ion fosfat (P). pH tanah berpengaruh terhadap bentuk ion P, jumlah dan tingkat dekomposisi bahan organik, serta kegiatan jasad mikro (Brady 1974, Ismunadji et al. 1991). Toksik H+ lebih mendominasi tanah lapisan atas dan ion hidrogen dari fosfat inorganic asam fosfat (H3PO4) mengalami ionisasi membentuk ion H2PO4- , HPO42-, PO43- akan di ikat
menjadi Al-P, Fe-P dan Mn-P. Dalam keadaaan netral atau alkalin akan diikat menjadi Ca-P (Marschner 1995; Ismunadji et al. 1991).
Alumunium (Al) di dalam tanah larut dan bersifat racun bagi tanaman. Kelarutan Al menjadi tinggi pada kondisi asam. Pada kondisi asam Al lebih mengikat ion fosfat dari H2PO4-, (HPO4)2- dan PO43-. Mula-mula ikatan tersebut
bersifat koloidal dan lambat, selanjutnya menjadi kristal varisit AlPO42H2- dan
strengit FePO42- (Nyakpa et al. 1988; Havlin et al. 1999). Alumunium
mendominasi ikatan dengan –P pada lapisan sub soil dan pada kondisi asam (pH 4.0) bentuk ikatan Al3+ adalah Al(H2O2)63+. Johnson dan Wood (1990)
menemukan kation Al3+ dapat mengikat PO43+ pada DNA sehingga menghambat
proses replikasi DNA bakteri bintil akar. Ketika pH meningkat, Al berada dalam bentuk Al(OH)2+ dan Al(OH)2+ akan reaktif mengikat ion H2PO4-, HPO42- sebagai
unsur fosfat yang dapat diserap oleh tanaman. Ketika mendekati pH netral dalam bentuk Al(OH)3, pada kondisi basa dalam bentuk Al(OH)4- dan akan berikatan
dengan PO43- membentuk komplek (Al(OH)4) 3 PO4 (Marschner 1995; Delhaize dan
Ryan 1995). Ion Al ini memiliki afinitas yang tinggi dan sangat menganggu terhadap biomolekul anionik seperti asam lemak, karbohidrat, protein dan asam nukleat (Aniol 1984; de Lima & Copeland 1994; Kochian 1995; Sivaguru et al. 1999). Al juga dapat menimbulkan cekaman oksidatif dengan terbentuknya oksigen radikal (ROS) (Panda et al., 2003).
Dalam tanah mineral, P terdiri atas dua bentuk yaitu P-organik (3,75% dari P total) seperti fitin, fosfolipid, asam nukleat dan koenzim, dan P-inorganik (25 – 90%) dari P total) seperti Ca3(PO4)2 dan Al(OH)4)2H2PO4 (Sutedjo 1994;
Cosgrove 1967). Bahan-bahan penyumbang fosfat di tanah berasal dari pupuk kandang, sisa tanaman, pupuk buatan dan mineral/batuan tanah. Asam fitat dan fitin merupakan fraksi terbesar dari P-organik. Selain itu menurut Alexander (1977) bahwa sel-sel mikroba sangat kaya dengan asam nukleat dan jika mikroba itu mati maka asam nukleatnya siap untuk dimineralisasi.
Mikroba Pelarut Fosfat
Mikroba pelarut fosfat yang pertama dikomersialisasi adalah Fosfobacterin dari bakteri Bacillus megaterium var.phosphaticum (Smith et al., 1965). Beberapa jenis cendawan dilaporkan mampu melarutkan Al-P dan Fe-P seperti Aspergillus sp dan Pinicillium (Das 1963), Sclerotium dan Fusarium (Alexander, 1978). Banyak jenis bakteri pelarut P antara lain genus Pseudomonas, Bacillus, Mycobacterium, Micrococcus, Flavobacterium, Bacterium, Citrobacter, dan enterobacter (Premono 1994; Illmer et al. 1995). Bakteri Pseudomonas putida, Citrobacter intermedium dan Serratia mesenteroides mampu meningkatkan kelarutan batuan fosfat 6 – 19 kali lipat (Premono et al. 1991) sedangkan Pseudomonas fluorescens dan P. putida mampu meningkatkan P terlarut pada tanah asam sampai 50 % ( Premono, 1994). P. aeroginosa salah satu bakteri pelarut fosfat, yang bersifat gram negatif. Hasil penelitian terhadap Pseudomonas sp oleh Surya (2006) menunjukkan bahwa pertumbuhan optimal mikroba ini pada pH 6 pada media modifikasi HKsuk dimana dalam 24 jam diperoleh populasi maksimum 1.97 x 109 sel dengan laju pertumbuhan spesifik maksimum 0,5807 sel per jam yang dicapai sampai pada jam ke-4 dalam kultur dan melambat setelah jam ke-8.
Mekanisme pelarutan unsur P terikat oleh bakteri pelarut fosfat terjadi karena adanya beberapa enzim fosfatase (fosfomonoesterase, fosfodiesterase
trifosfomonoesterase dan fosfoamidase) yang terdapat di dalam tanah. Enzim- enzim tersebut bertanggung jawab dalam hidrolisis bahan organik yang mengandung fosfor menjadi fosfat organik (HPO4-2 dan HPO4-1) yang tersedia
bagi tanaman (Tabatabai 1982). Menurut Pikovskaya dalam Bora dan Bezbaruah (1999) bahwa bakteri pelarut fosfat menghasilkan zona bening disekitar koloni yang mengandung 20 gram batuan fosfat sebanding dengan 5 gram tricalcium fosfat. Zona bening mengindikasikan fosfat terlarut yang disebabkan oleh aktivitas enzim Fosfomonoesterase (FMEase). Fosfomono esterase merupakan enzim hidrolase yang berperan dalam Penambahan H2O pada ikatan ester fosfat
(Lehninger 1995). Enzim FMEase dihasilkan secara dominan dibawah kondisi ketersediaan fosfat rendah.
Enzim FMEase dapat dibagi menjadi FMEase asam dan FMEase alkali tergantung jenis subtrat dan pH optimumnya. Dalam kisaran basa FMEase intraseluler pada umumnya tinggi, sedangkan FMEase ekstraseluler tinggi pada kondisi kisaran asam (Schinner et al., 1996). Sumber fosfat yang mampu menginduksi produksi enzim FMEase ini adalah fenilfosfat dan p-nitrofenilfosfat yang mengindikasikan kemampuan hidrolisis bentuk p-organik (Ruiz et al. 2000). FMEase mengubah subtrat menjadi gugus alkohol (ROH) dan asam fosfat. Reaksi hidrololisis p-nitrofosfat oleh FMEase sebagai berikut:
p-nitrofenilfosfat + H2O -- FMEaseÆ p-nitrofenol + H3PO4.
Selain oleh reaksi di atas, sumber fosfat organik adalah phytat (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisphosphat) yang banyak tersimpan dalam jaringan tanaman seperti sereal dan biji-bijian. Fitat diuraikan oleh phytase (Myo-inositol- heksakisphosphate phosphohydrolase (EC 3.1.3.8)) menjadi inositol dan asam orthophosphoric pertama ditemukan oleh Suzuki et al., 1907 (Wang, X., et al., 2004). Enzim phytase disandikan oleh gen Phy K-W seperti pada Klebseilla
pneumoniae XY-5. Beberapa jenis Bacillus memproduksi phytase yang melarutkan fosfat dari Myo-inositol-heksakisphosphate.
Ekspresi gen promotor PhyC tergantung pada ketersediaan unsur fosfat dan regulator PhoP yang penting dalam transkripsi gen PhyC. Ikatan PhoP~P pada kotak PhoP mendorong transkripsi PhyC dan menandakan meningkatnya konsentrasi PhoP~P. Letak posisi PhoP berada pada sekuen -35 dan – 30 sebelum promotor PhyC. DNAse1 yang berada pada sekuen –80 dari lokasi PhyC bekerja menguraikan ikatan PhoP~P menjadi PhoP yang kemudian berinteraksi dengan promotor PhyC sehingga menjadi aktif melakukan transkripsi (Makarewicz et al. 2006).
Peran Transposon dalam Mutagenesis
Metode transposon merupakan salah satu metode yang sering digunakan untuk analisis genetika molekuler pada berbagai macam bakteri (Voelker dan Dybvig 1998) dan fungi (Firon et al. 2003). Transposon merupakan elemen DNA yang dapat meloncat atau menyisip dari satu tempat ke tempat lainnya di dalam DNA (Snyder & Champness 2003). Beberapa contoh penggunaan transposon dalam teknik mutagenesis adalah seperti untuk mengidentifikasi gen yang terlibat dalam virulensi bakteri Listeria monocytogenes pathogen pada manusia, analisis penanda molukuler pada Bradyrhyzobium japonicum (Wahyudi, et al. 1998), isolasi gen yang berperan dalam pembentukan magnet pada Magnetospirillum magneticum (Wahyudi et al., 2001), pengklonan fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi terhadap asam dan alumunium pada B. Japonicum (Astuti et al. 2006).
Transposon seperti mini Tn5 telah digunakan dalam mutagenesis dan pengklonan DNA bakteri gram negatif (Bruijn & Lupski 1984) seperti pada Eubacteria (de Lorenzo et al. 1990). Penggunaan Mini Tn5 transposon lebih disukai karena frekuensi transposisinya tinggi, spesififas DNA target yang relatif rendah (Goryshin et al. 1998), dan sedikit memiliki homologi dengan sekuen DNA
genom beberapa spesies bakteri (Berg & Ber 1983). Mini Tn5Km1 adalah salah satu tipe turunan dari transposon Tn5 yang membawa gen penanda resistensi kanamisin (de Lorenzo et al. 1990) sehingga penyisipannya ke dalam genom bakteri menyebabkan bakteri tersebut menjadi resisten terhadap kanamisin. Penyisipan transposon ini bersifat acak dan penyisipannya bersifat stabil pada genom bakteri (Herrero et al. 1990).
Reiznikoff and Wiliam (2002) menyatakan bahwa mekanisme transposisi transposon terjadi melalui beberapa tahap dengan pemotongan dan penyambungan. Pertama ikatan Tnp 19 pb secara dimerisasi membentuk Tnp-DNA struktur komplek synaptic, kemudian melengkung (flanking) kedua ujungnya membentuk ikatan cincin dan lepas dari utas DNA sebagai donor. Selanjutnya cincin DNA yang mengandung transposon menempel pada untai DNA target. Dengan kehadiran ion Mg 2+ cincin DNA transposon mengudar dan masuk tersambung dengan DNA target sehingga membentuk untaian DNA mutagenesis.
Bakteri tanah gram negatif seperti Pseudomonas dapat dimutasikan dengan transposon. Mini transposons Tn5 memiliki situs gen resisten kanamisin, kloramfenikol, streptomycin-spectinomycin, dan tetrasiklin yang digunakan sebagai penanda seleksi pengklonan spesifik NotI yang diapit oleh terminal 19 pb urutan sekuen dari Tn5 (de Lorenzo et.al. 1990).
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitiaan dimulai dari bulan April 2006 dan selesai pada bulan Juni 2007