membeku pada posisi miring membentuk sudut 30-450, kemudian disimpan dalam lemari pendingin (Lay, 1994).
3.10 Pembiakan Bakteri
3.10.1 Pembuatan Stok Kultur Bakteri Propionibacterium acnes dan Staphylococcus epidermidis
Biakan Propionibacterium acnes dan Staphylococcus epidermidis dari biakan murni diambil dengan jarum ose yang sudah disterilkan di api bunsen lalu diinokulsikan pada permukaan sediaan media Nutrient Agar miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasikan di inkubator pada suhu 37
oC selama 24 jam (Chandra dkk., 2018).
3.10.2 Pembuatan Inokulum Bakteri Propionibacterium acnes dan Staphylococcus epidermidis
Koloni bakteri Propionibacterium acnes dan Staphylococcus epidermidis diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril, lalu disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml media Nutrient Broth.
Diukur transmittam pada panjang gelombang 580 nm menggunakan spektrofotometer UV-Visibel. Target nilai transmittan lebih kurang 25% pada panjang gelombang 580 nm (Depkes RI., 2020).
3.11 Pembuatan Larutan Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Kulit Kayu Manis
Sebanyak 1 g ekstrak etanol kulit kayu manis ditimbang, lalu ditambahkan DMSO hingga volume total 2 ml dan diaduk hingga larut dan didapat konsentrasi 500 mg/ml, kemudian dibuat pengenceran dengan konsentrasi 500 mg/ml; 250 mg/ml, 125 mg/ml; 100 mg/ml; 50 mg/ml; 40 mg/ml; 30 mg/ml; 20 mg/ml; 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml dan 0,5 mg/ml.
3.12 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ektrak Etanol Kulit Kayu Manis Terhadap Bakteri Propionibacterium acnes dan Staphylococcus epidermidis
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap ekstrak kulit kayu manis dengan berbagai konsentrasi (konsentrasi (0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 30; 40;
50; 100; 125; 250; dan 500) mg/ml. Pengujian ini dilakukan dengan metode difusi agar sumuran yang diuji dalam 3 kali pengulangan. Sebanyak 0,1 mL inokulum bakteri dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media Mueller Hinton Agar sebanyak 15 mL, selanjutnya cawan petri dihomogenkan dan ditunggu media memadat. Media dilubangi dengan alat pelubang gabus berdiameter 6 mm. Kemudian masing-masing lubang dituang sebanyak 25 μL. larutan uji dari setiap konsentrasi dan larutan dimetil sulfoksida (DMSO) sebagai kontrol, kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam, setelah itu diukur diameter daerah hambat atau zona bening disekitar sumuran dengan menggunakan jangka sorong (Ortez, 2005).
3.13 Pembuatan Sediaan Gel Ekstrak Etanol Kulit Kayu Manis 3.13.1 Formula Dasar
Formula dasar yang digunakan berdasarkan (Supomo dkk., 2016) yaitu:
R/ Karbopol 1 g 3.13.2 Formula yang digunakan
Sediaan gel dibuat dengan tiga konsentrasi ekstrak dan satu blanko dimana masing masing sediaan memiliki bobot 100 g dapat dilihat pada tabel berikut.
Tabel 3.1 Komposisi formula sediaan gel ekstrak etanol kulit kayu manis
Bahan Fungsi Formula
0
F0 : Formula tidak mengandung esktrak etanol kulit kayu manis (blanko) FI : Formula mengandung 20 mg/ml ekstrak etanol kulit kayu manis FII : Formula mengandung 30 mg/ml ekstrak etanol kulit kayu manis FIII : Formula mengandung 40 mg/ml ekstrak etanol kulit kayu manis
3.13.3 Prosedur Pembuatan Sediaan Gel
Karbopol dikembangkan dengan air suling panas dalam mortir hingga mengembang. Metil paraben dilarutkan dalam akuades panas di atas waterbath dan aduk hingga larut. Pada mortir yang berbeda, ekstrak digerus hingga teksturnya menjadi lembut lalu tambahkan sebagian propilen glikol dan gerus hingga homogen. Setelah karbopol mengembang, gerus terlebih dahulu dengan ditambahkan TEA sedikit-sedikit hingga membentuk basis gel. Ditambahkan gliserin dan metil paraben ke dalam basis gel sambil di gerus hingga homogen.
Sisa propilenglikol ditambahkan dalam campuran basis, gerus hingga homogen.
Campurkan gerusan ekstrak dari berbagai konsentrasi FI (20 mg/ml), FII (30 mg/ml) dan FIII (40 mg/ml) ke dalam basis gel dan gerus sampai homogen.
Ditambahkan air suling dan digerus hingga homogen (Supomo dkk., 2006).
3.14 Evaluasi Sediaan Gel Ekstrak Etanol Kulit Kayu Manis 3.14.1 Pemeriksaan Homogenitas Sediaan
Cara: sejumlah tertentu sediaan dioleskan pada dua keping kaca atau bahan transparan lain yang cocok, sediaan harus menunjukkan susunan yang homogen dan tidak terlihat adanya butiran kasar (Depkes RI, 1979). Pengamatan dilakukan pada suhu kamar pada hari minggu ke-2, 4, 6, 8, 10, dan 12..
3.14.2 Pemeriksaan Stabilitas Fisik Sediaan
Pemeriksaan stabilitas sediaan meliputi bentuk, warna dan bau yang diamati secara visual (Depkes RI., 1995). Sediaan dinyatakan stabil apabila warna, bau dan penampilan tidak berubah secara visual selama penyimpanan.
Pengamatan dilakukan pada suhu kamar pada minggu ke-2, 4, 6, 8, 10 dan 12.
3.14.3 Penentuan pH Sediaan
Penentuan pH sediaan dilakukan dengan mengunakan pH meter. Cara: alat terlebih dahulu dikalibrasi dengan menggunakan larutan dapar standar pH netral (pH 7,01) dan larutan dapar pH asam (pH 4,01) hingga alat menunjukkan nilai pH tersebut, elektroda dicuci dengan air suling, lalu dikeringkan dengan kertas tissue.
Sampel dibuat dalam konsentrasi 1% yaitu ditimbang 1 gram sediaan dan dilarutkan dalam 100 ml air suling, kemudian elektroda dicelupkan dalam larutan tersebut, sampai alat menunjukkan harga pH yang konstan. Angka yang ditunjukkan pH meter merupakan harga pH sediaan (Rawlins, 2003). Pengamatan dilakukan pada suhu kamar pada minggu ke-2, 4, 6, 8, 10 dan 12.
3.14.4 Penentuan Visktositas Sediaan
Penentuan viskositas dilakukan dengan menggunakan alat viscometer stormer tipe NDJ-8S. Dengan cara menimbang 100 g sediaan gel ekstrak etanol kulit kayu manis kemudian diatur spindle 2 dan kecepatan 12 yang digunakan dan viskometer dijalankan, kemudian viskositas dari gel akan terbaca. Pengamatan viskositas dilakukan pada suhu kamar pada minggu ke-2, 4, 6, 8, 10 dan 12.
3.15 Uji Iritasi Terhadap Kulit Sukarelawan
Pengujian iritasi dilakukan terhadap sediaan dengan tujuan untuk mengetahui sifat iritatif sediaan. Sediaan yang dipilih untuk pengujian iritasi ini adalah sediaan dengan konsentrasi tertinggi.
Teknik yang digunakan adalah uji pakai (usage test). Pengujian iritasi ini dilakukan pada 12 orang sukarelawan. Caranya, gel dengan konsentrasi tertinggi yaitu 40 mg/ml dioleskan pada kulit dibagian belakang telinga sukarelawan
kemudian dibiarkan selama 24 jam. Diamati reaksi yang terjadi. Reaksi iritasi positif ditandai dengan adanya kemerahan, gatal-gatal dan bengkak pada bagian yang diberi perlakuan (Wasitaadmaja, 1997).
Uji iritasi yang dilakukan dengan cara mengoleskan sediaan pada kulit normal manusia dengan maksud untuk mengetahui sediaan uji itu dapat menimbulkan iritasi atau tidak. Umumnya, iritasi akan menimbulkan reaksi kulit sesaat setelah pelekatan atau penyetuhannya pada kulit, iritasi demikian disebut iritasi primer. Tetapi jika reaksi itu timbul beberapa jam setelah penyentuhan atau pelekatan pada kulit, iritasi ini disebut iritasi sekunder. Tanda-tanda yang ditimbulkan reaksi kulit tersebut umumnya sama, yaitu kulit kemerahan, gatal- gatal dan bengkak (Ditjen POM, 1985).
Sukarelawan uji iritasi meliputi manusia sehat sebaiknya wanita, berusia 20-30 tahun, berbadan sehat jasmani dan rohani, tidak memiliki riwayat penyakit alergi atau reaksi alergi dan menyatakan kesediaannya dijadikan sebagai panel uji tempel. Biasanya yang paling tepat dijadikan daerah lokasi uji tempel adalah bagian punggung, lipatan siku dan bagian kulit di belakang telinga (Ditjen POM, 1985).
3.16 Uji Aktivitas Antibakteri Sediaan Gel Ekstrak Etanol Kulit Kayu Manis terhadap Propionibacterium acnes dan Staphylococcus epidermidis
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap sediaan gel ekstrak etanol kulit kayu manis dengan konsentrasi FI (20 mg/ml). FII (30 mg/ml) dan FIII (40 mg/ml). Pengujian ini dilakukan dengan metode difusi agar sumuran yang diuji dalam 3 kali pengulangan. Sebanyak 0,1 mL inokulum bakteri dimasukkan
ke dalam cawan petri steril, kemudian dituang media Mueller Hinton Agar sebanyak 15 mL dan dihomogenkan, ditunggu hingga memadat. Selanjutnya, dilubangi media dengan alat pelubang gabus berdiameter 6 mm dan masing- masing lubang diisi dengan berbagai konsentrasi gel ekstrak kulit kayu manis yang diambil dengan spatula, basis gel sebagai kontrol negatif, dan sediaan Verile acnegel (dengan bahan aktif 0,5% asam salisilat) sebagai kontrol positif, kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam, setelah itu diukur diameter daerah hambat disekitar lubang dengan menggunakan jangka sorong (Ortez, 2005).
BAB IV