buah naga merah Olahraga (Renang) Hiperglikemia Glukosa darah Antropomeri BB, PB, IMT, LP Dislipidemia Kol-T, HDL-K, TGA, LDL-K
13
METODE
Desain Penelitian
Penelitian ini menggunakan desain penelitian eksperimen di laboratorium. Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Unit percobaan penelitian ini adalah tikus putih galur Sprague-Dawley
dengan 5 taraf perlakuan (Tabel 6) dan 4 kali ulangan, sehingga diperoleh 20 unit satuan coba. Taraf perlakuan yang diberikan adalah jenis pakan yang diberikan dan ulangan merupakan banyaknya tikus dalam setiap taraf perlakuan.
Tabel 6 Taraf perlakuan dalam penelitian Taraf
Perlakuan Perlakuan yang diberikan
P0 Pakan standar (PS) P1 Pakan tinggi lemak (PTL)
P2 Pakan tinggi lemak + olahraga aerobik (PTL + OR) P3 Pakan tinggi lemak + pakan tinggi buah naga merah
(PTLBNM)
P4 Pakan tinggi lemak + pakan tinggi buah naga merah + olahraga aerobik (renang) (PTLBNM + OR)
Jumlah dan cara pengambilan sampel
Jumlah sampel yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 20 ekor tikus yang dihitung berdasarkan rumus Frederer (1997) yaitu (n-1) (t-1) ≥15, dengan n adalah jumlah sampel yang dibutuhkan, dan t adalah jumlah perlakuan. Penelitian ini telah mendapatkan persetujuan etik dari Komisi Etik Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan IPB No. 020/KEH/SKE/II/2015 (Lampiran 1).
Bahan Penelitian
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus jantan putih strain Sprague-Dawley berusia 2 bulan dengan berat badan 80-120 gram yang berasal dari Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) Jakarta. Bahan lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah naga merah lokal diperoleh dari “Sabisa Farm” yang berlokasi di Sindang Barang, Bogor sebagai bahan pembuatan tepung buah naga merah. Bahan lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah pakan untuk penggemukan tikus menjadi obesitas dengan formula pakan tinggi lemak/
Diet Induced Obesity (DIO) D12492, dan pakan standar D12450 B menurut Ulman (2006), serta pakan dengan formula buah naga merah dengan mensubtitusi tepung buah naga merah dengan pakan tinggi lemak.
14
Pereaksi atau bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi pereaksi analisis kadar glukosa darah yaitu pereaksi kit glukosa, dan pereaksi untuk analisis profil lipid darah meliputi pereaksi kit trigliserida, kit standar trigliserida, kit kolesterol, kit standar kolesterol, kit high density lipoprotein (HDL) precipitant, dan kit standar HDL.
Peralatan Penelitian
Peralatan yang digunakan untuk perawatan tikus terdiri dari kandang dengan ukuran 46cm x 35cm x 19cm (pxlxt) berisi sekam yang dilengkapi dengan wadah makanan dan botol minum, penutup kandang berbahan besi, timbangan digital untuk menimbang berat tikus dan sisa pakan, kotak berukuran 37 cm x 30 cm, x 50 cm berbahan acrylic dengan kedalaman 50 cm yang dilengkapi dengan mesin pendorong arus air untuk latihan olahraga renang (aerobik) pada hewan coba, serta seperangkat alat pembersih kandang.
Peralatan yang digunakan untuk pembuatan pakan terdiri dari baskom, loyang, mixer, vacuum evaporator, diskmill, dan pencetak pellet. Peralatan yang digunakan untuk pengambilan darah terdiri dari kapas, alkohol 70%, jarum spuit 5 mL, microhaematocrit capillary tubes mengandung Na-Heparin 80 IU/mL, tabung EDTA, dan eppendorf. Peralatan yang digunakan untuk analisis laboratorium terdiri dari spektrofotometer, pipet mikro, pipet Mohr, alat sentrifugasi, alat vortex, talenan, pinset, saringan, tissue casset, mesin processor otomatis, mesin vaccum,
freezer (-20oC), water bath 46oC, dan satu set alat gelas-gelas kimia.
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian di lakukan di beberapa laboratorium. Pembuatan tepung buah naga merah dilakukan di Laboratorium PAU IPB, pembuatan pakan dilakukan di Laboratorium Industri Pakan Ternak, Fakultas Peternakan IPB, pemeliharaan hewan coba dilakukan di Laboratorium percobaan hewan Departemen Gizi Masyarakat IPB, pengambilan darah tikus dilakukan di Feterenary Stem Cell Laboratory, analisis glukosa darah dan profil lipid darah dilakukan di Laboratorium Balai Pengobatan Muhammadiyah Kota Bogor. Penelitian ini dilaksanakan pada Bulan April 2015-Agustus 2016.
Prosedur Percobaan Pembuatan tepung buah naga merah
Pembuatan tepung buah naga merah dilakukan dengan menggunakan metode vacuum drying. Buah naga dibelah dan dipisahkan antara daging dan kulitnya. Selanjutnya daging buah dicampur dengan menggunakan mixer hingga berbentuk jus cair. Selanjutnya ditambahkan maltodextrin sebanyak 30% dari jumlah buah naga merah, kemudian dicampur hingga rata. Selanjutnya dilakukan
15 pengeringan dengan menggunakan vacuum evaporator. Hasil pengeringan selanjutnya dijadikan tepung dengan menggunakan disk mill dengan ukuran 80
mesh. Metode pembuatan tepung buah naga merah diacu dari penelitian yang dilakukan oleh Maigoda (2016).
Perhitungan dosis flavonoid
Perhitungan dosis flavonoid didasarkan pada kebutuhan flavonoid per hari pada manusia yaitu sebesar (Knab et al. 2013; Chun et al. 2009). Dosis flavonoid pada tikus diperoleh dengan melakukan konversi dosis flavonoid dari manusia dengan menggunakan tabel konversi perhitungan dosis antara manusia dan hewan percobaan (Lampiran 2). Berdasarkan estimasi dosis Flavonoid 210 mg/hari pada manusia, maka dosis yang diberikan pada tikus (berat badan 200 g) menggunakan tabel konversi 0.018 adalah 45 mg 200 g-1 BB hari-1.
Formulasi pakan intervensi
Formula pakan tikus yang digunakan dalam penelitian ini ada 3 jenis, antara lain: 1) pakan tinggi lemak Diet Induced Obesity (DIO) formula D12492, 2) pakan standar dengan formula D12450B, dan 3) pakan dengan formula buah naga merah lokal dengan substitusi dari pakan tinggi lemak DIO formula D12492. Formula ketiga jenis pakan tersebut disajikan pada Tabel 7.
Tabel 7 Komposisi formula pakan yang digunakan dalam penelitian Komposisi Pakan Standar
(%) Pakan Tinggi Lemak* (%) Pakan Buah Naga Merah (%) Jagung Dedak gandum Gluten pati jagung Minyak sawit CPO Tepung tapioka CaCO3 DCP Garam dapur Premix Tallow
Tepung buah naga merah 55.0 17.0 19.0 1.0 5.0 2.0 1.0 0.2 0.3 0.0 0.0 15.0 19.0 25.0 0.0 3.0 2.0 1.0 0.2 0.3 35.0 0.0 2.60 3.20 4.30 0.00 0.50 0.30 0.20 0.03 0.05 6.00 83.00 Total 100.0 100.0 100.0
*Modifikasi formula DIO (Diet Induced Obesity) menurut Ulman (2006)
Formula ketiga merupakan formula substitusi tepung buah naga merah dengan formula pakan tinggi lemak/ pakan buah naga merah (PBNM). Rata-rata konsumsi tikus sehari sebesar 30 g. Oleh karena itu, pakan tikus terdiri dari 25 g tepung buah naga merah dan 5 g pakan tinggi lemak. Perbandingan tepung buah naga merah dan pakan tinggi lemak pada formula PBNM adalah 5:1. Formula PBNM merupakan formula yang diacu dari penelitian Maigoda (2016).
16
Masa adaptasi
Masa adaptasi dimaksudkan untuk memastikan hewan coba berada dalam keadaan sehat sebelum dilakukan penggemukan, yaitu dilakukan selama 10 hari. Tikus dipelihara dengan kandang secara berkelompok, satu kandang terdiri atas 2- 3 ekor tikus. Tikus dipelihara dengan suhu ruangan di atur 24-26 oC, kelembaban
30-40%, dan siklus gelap terang masing-masing 12 jam. Sekam di dalam kandang diganti 2 kali per minggu. Pada masa adaptasi, tikus diberikan pakan standar dengan kandungan gizi makro yang disesuaikan menurut Ulman (2006). Pemberian makanan dan minuman dilakukan secara ad libitum.
Induksi diabetes dan penggemukan hewan coba
Setelah masa adaptasi selesai, dilakukan induksi aloksan secara intraperitoneal sebanyak 60 mg kg-1 bb pada semua kelompok tikus utuk membuat model tikus diabetes. Tikus dinyatakan hiperglikemia dan diabetes apabila kadar glukosa darah tikus darah >126 mg/dL (Jung et al. 2011, ADA 2013).
Penggemukan hewan coba dilakukan selama 18 minggu hingga usia tikus remaja dan mencapai target obesitas. Proses penggemukan dilakukan dengan pemberian pakan tinggi lemak dengan sumbangan energi dari lemak sebesar 57%. Pemberian pakan pada masa adaptasi dan masa penggemukan dilakukan secara ad libitum. Tikus model Sprague-dawley akan menjadi obesitas setelah diberikan pakan tinggi lemak selama 19 minggu (Maigoda 2016). Tikus dinyatakan obes apabila IMT ≥ 0.68 g cm-2 (Novelli et al. 2007). Rumus yang digunakan untuk
menghitung IMT adalah sebagai berikut.
Keterangan: bb= berat badan tikus (g) pb= panjang badan tikus (cm) Intervensi
Setelah 18 minggu masa penggemukan dan diperoleh kriteria obesitas pada tikus, selanjutnya dilakukan intervensi selama 4 minggu. Sebanyak 20 ekor tikus dibagi menjadi lima kelompok secara acak berdasarkan berat badannya. Setiap tikus dimasukkan dalam satu kandang secara terpisah. Lima kelompok perlakuan dalam penelitian ini antara lain pakan standar (PS), pakan tinggi lemak (PTL), pakan tinggi lemak + olahraga (PTL+OR), pakan berbasis tepung buah naga merah (PTLBNM), dan pakan berbasis tepung buah naga merah+olahraga (PTLBNM+OR). Setiap kelompok perlakuan terdiri atas 4 ekor tikus yang masing-masing tikus diberikan makanan sebanyak 30 gram per hari.
Tikus yang diberikan intervensi olahraga, melakukan olahraga renang sebanyak 3 kali seminggu selama 4 minggu pada jam 10.00 di pagi hari. Olahraga renang dilakukan di dalam kolam acrylic transparan yang berisi air dengan suhu 28 ± 1 oC dan diberikan arus. Selama olahraga dilakukan, harus dipastikan ekor tikus tidak menyentuh dasar kolam dan berenang selama 8 menit (Kregel et al. 2006). Pengukuran berat badan
Perkembangan berat badan tikus diamati selama masa penelitian berlangsung. Pengukuran berat badan dilakukan selama 18 minggu masa
IMT = bb (g) pb x pb (cm 2)
17 penggemukan dan 4 minggu masa intervensi. Berat badan tikus diukur menggunakan timbangan digital dan dilakukan sekali dalam seminggu.
Pengukuran panjang badan dan lingkar perut
Pengukuran panjang badan dan lingkar perut dilakukan dengan menggunakan aplikasi “imagej”. Aplikasi ini dapat mengukur panjang badan dan lingkar perut melalui foto. Tikus diletakkan dan dibentangkan sejajar dengan penggaris kemudian difoto. Foto tikus kemudian di drag ke aplikasi kemudian diukur. Panjang badan tikus diukur dari ujung hidung hingga anus (pangkal ekor) (Aguh et al. 2013). Lingkar perut tikus diukur pada bagian perut yang terbesar secara melingkar. Pengukuran panjang badan dan lingkar perut secara lengkap disajikan pada Lampiran 5.
Perhitungan konsumsi pakan
Konsumsi pakan tikus dihitung dan dicatat setiap hari. Berat pakan yang dikonsumsi oleh tikus merupakan selisih berat pakan yang diberikan (g) dengan berat pakan yang tersisa (g) pada hari berikutnya sebelum pakan baru diberikan. Pemberian dan perhitungan sisa pakan dilakukan setiap jam 10.00 pagi. Pengukuran pakan dilakukan dengan menggunakan timbangan digital dengan ketelitian 0.1 g. Pengambilan darah tikus
Pengambilan darah dilakukan sebanyak 2 kali, yaitu pada minggu ke-0 (sebelum intervensi) dan minggu ke-4 (setelah intervensi). Pengambilan darah tikus dilakukan dengan anestesi tikus satu per satu dengan menggunakan ketamin dosis 10 mg Kg-1 bb tikus. Darah diambil langsung dari vena mata (arteri ocular) ± 5 mL dengan menggunakan microhaematocrit capillary tubes. Darah langsung dialirkan ke dalam tabung EDTA kemudian di bolak-balik dan didiamkan pada suhu ruang selama 2 jam. Sampel darah kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 400 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC. Serum yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam eppendorf dan disimpan dalam chiller untuk segera dilakukan analisis laboratorium.
Analisis kadar glukosa darah metode glucose test
Kit yang digunakan dalam analisis bermerk Rajawali Nursindo dengan No Reg: AKL 20101803460. Serum darah tikus diambil sebanyak 10 μl dan dicampurkan dengan 1000 μl pereaksi kit. Campuran kemudian dimasukkan dalam tabung reaksi dan dihomogenkan dengan cara divortex. Selanjutnya dilakukan inkubasi selama 10 menit pada suhu 37°C atau 20 menit pada suhu 30°C kemudian dibaca absorbansi pada panjang gelombang 500 nm.
Analisis profil lipid darah
Profil lipid darah yang dianalisis antara lain Kol-T, HDL-K, TGA, dan LDL-K. Analisis dilakukan menggunakan kit merk Rajawali Nursindo dengan No Reg: AKL 10101804027 untuk TGA, No Reg: AKL 10101803466 untuk Kol-T, dan No Reg: AKL 10101804019 untuk HDL. Metode yang digunakan untuk megukur kadar trigliserida (TGA) adalah colorimetric enzymatic test menggunakan glycerol-3-phosphate-oxidase (GPO). Metode yang digunakan untuk mengukur kadar kolesterol total (Kol-T) adalah enzymatic photometric test menggunakan
18
analisis kadar Kol-T serum hampir sama dengan prosedur analisis TGA serum. Perbedaan analisis hanya terdapat pada pereaksi kit yang digunakan. Prosedur analisis kadar Kol-T secara lengkap disajikan pada Lampiran 3.
Metode yang digunakan untuk mengukur HDL-K adalah enzymatic photometric test menggunakan cholesterol oxidase paminophenozone (CHOD- PAP). Sebelum dianalisis, serum darah harus dipresipitasi dengan cara mencampurkan 200 μL serum darah dengan 500 μL pereaksi kit HDL precipitant.
Kemudian dihomogenkan selama 10 menit pada suhu ruang dan dilakukan sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 3 000 rpm. Selanjutnya dilakukan analisis kadar HDL-K dari serum darah yang sudah dipresipitasi. Prosedur lengkap analisis HDL-K secara lengkap disajikan pada Lampiran 4. Kadar LDL-K diukur secara tidak langsung (indirect) menggunakan rumus Friedewaldetal, yaitu dengan mengurangkan Kol-T dengan HDL-K dan seperlima dari TGA.
Pengolahan dan Analisis Data
Seluruh data hasil pengamatan ditabulasi dan dibuat dalam bentuk rata-rata ± standar deviasi. Data profil lipid, glukosa darah, dan IMT dianalisis dengan Analisis Ragam (Anova) pada tingkat kepercayaan 95%. Data awal dianalisis untuk melihat homogenisasi data. Karena data awal dalam penelitian ini homogen, maka hanya dilakukan analisis terhadap data akhir. Jika hasil analisis menunjukkan pengaruh signifikan terhadap peubah respon, maka dilakukan uji lanjut Duncan untuk melihat perbedaan pengaruh perlakuan antar kelompok percobaan. Pengolahan dan analisis data dilakukan dengan menggunakan program Microsoft Excell dan SPSS for Windows versi 16.0.