HASIL DAN PEMBAHASAN
OPTIMASI EKSTRAKSI ENZIMATIK
Penentuan Konsentrasi Optimum Enzim β-glukosidase
Penentuan konsentrasi optimum enzim β-glukosidase penting dilakukan agar penggunaaan enzim lebih efektif dan efisien. Adapun data penentuan konsentrasi optimum β-glukosidase dapat dilihat pada Gambar 30.
1.52 15.62 16.09 16.99 17.15 16.72 16.57 76.75 73.95 80.61 82.07 79.98 79.12 3.12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 konsentrasi (unit) kadar (%bk ekstrak)
Gambar 30 Penentuan konsentrasi optimum enzim β-glukosidase
Pada Gambar 30 dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan kadar vanilin dari 1.52%bk (tanpa penambahan enzim β-glukosidase) menjadi 17.15%bk setelah penambahan 40 unit aktifitas β-glukosidase. Hal ini menunjukkan adanya aktifitas enzim dan rendahnya kandungan senyawa penghambat seperti ion logam berat dalam sistem reaksi (Tucker 1995). Sering diasumsikan bahwa laju reaksi berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Hal ini benar adanya jika konsentrasi substrat melebihi konsentrasi enzim seperti terlihat pada perlakuan 0 unit hingga 40 unit. Dengan kata lain, pada konsentrasi enzim yang rendah, seluruh bagian aktif enzim telah diduduki oleh substrat yang berlebih sehingga laju reaksi pembentukan produk berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Sebaliknya pada konsentrasi enzim yang sangat tinggi, penambahan enzim tidak lagi meningkatkan laju reaksi. Hal ini terjadi pada penambahan enzim β-glukosidase 40 unit, dimana vanilin sebagai produk hasil reaksi tidak lagi mengalami peningkatan walaupun konsentrasi enzim ditambah. Bahkan terlihat terjadinya
vanilin glukosa
penurunan dari perlakuan 40 unit hingga 60 unit berturut-turut sebesar 17.15, 16.72 dan 16.57%bk ekstrak. Disamping substrat yang habis, hal ini bisa disebabkan adanya penghambat dalam jumlah besar sehingga mengganggu aktifitas enzim. Penghambat adalah molekul yang secara alami ada atau molekul sintetik yang menurunkan atau menghilangkan aktifitas enzim. Beberapa penghambat dapat mengikat enzim sangat kuat dan menginaktifkannya secara
irreversible (http://wikipedia.org/wiki/Enzyme, 2006).
Pada Gambar 30 dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan kadar glukosa dari 3.12%bk (tanpa penambahan enzim β-glukosidase) menjadi 82.07%bk ekstrak setelah penambahan 40 unit aktifitas β-glukosidase. Selanjutnya kadar glukosa menurun kembali seiring dengan menurunnya kadar vanilin.
Berdasarkan percobaan pada tahap ini, konsentrasi optimum penambahan enzim β-glukosidase adalah 10 unit karena menghasilkan kadar vanilin ekstrak yang tidak berbeda nyata dengan penambahan enzim β-glukosidase pada konsentrasi yang lebih tinggi. Oleh sebab itu, percobaan tahap berikutnya adalah optimasi waktu inkubasi β-glukosidase, dimana β-glukosidase yang ditambahkan sebesar 10 unit. Ekstrak vanili segar yang dihasilkan dari penambahan β- glukosidase sebanyak 0, 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 unit dapat dilihat pada Gambar 31.
Dari Gambar 31 terlihat bahwa perlakuan dengan berbagai konsentrasi enzim β-glukosidase menghasilkan penampakan visual yang tidak terlalu berbeda. Namun demikian, apabila diperhatikan lebih jeli pembentukan warna coklat ekstrak pada penambahan β-glukosidase 10 unit hingga 60 unit mengikuti trend
Gambar 31 Ekstrak vanili segar dengan konsentrasi enzim
β-glukosidase yang berbeda
Penentuan Waktu Inkubasi Optimum Enzim β-glukosidase
Penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase dilakukan dengan memvariasikan waktu inkubasi enzim selama 0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 24 jam dengan penambahan enzim β-glukosidase sebanyak 10 unit. Data penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase dapat dilihat pada Gambar 32.
Gambar 32 Penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase
60 unit
10 unit 20 unit 30 unit 40 unit 50 unit
0 unit 0.93 14.50 14.52 14.67 15.00 15.49 15.04 1.96 73.86 74.65 73.86 71.76 71.35 75.10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 4 8 12 16 20 24 waktu (jam) kadar (%bk ekstrak) vanilin glukosa
Pada Gambar 32 dapat dilihat bahwa kadar vanilin mengalami peningkatan hingga mencapai optimum 15.49%bk ekstrak pada perlakuan 8 jam dan menurun kembali menjadi 14.50% pada perlakuan 24 jam. Pada saat awal pengamatan, kadar vanilin yang dihasilkan berbanding lurus dengan bertambahnya waktu. Namun sejalan dengan berlalunya waktu tersebut, kadar vanilin tidak mengalami peningkatan lagi.
Pada Gambar 32 terlihat bahwa laju produksi awal mungkin linier, tapi selanjutnya laju reaksi mulai menurun. Beberapa enzim dapat menunjukkan laju awal linier hanya untuk beberapa menit saja, sedangkan enzim lainnya lebih dari beberapa jam. Hilangnya aktifitas seiring waktu ini, dapat menguntungkan jika keberadaan aktifitas enzim pada produk akhir tidak diinginkan. Akan tetapi, hilangnya aktifitas enzim, jika masih diperlukan dalam proses, justru dapat menurunkan efisiensi dan menuntut adanya biaya tambahan.
Selama tahap awal reaksi, ketika konsentrasi substrat diasumsikan konstan, reaksi enzim ada pada orde 0 terhadap pembentukan produk. Tapi kenyataannya, konsentrasi substrat menurun seiring waktu sehingga reaksi mengikuti orde 1. Alasan lain mengapa laju enzim menurun seiring waktu adalah penghambatan oleh produk yang terbentuk serta inaktivasi enzim akibat molekul- molekul enzim yang tidak stabil. Dalam hal ini aktifitas enzim yang paling penting tergantung pada molekul protein yang dapat mempertahankan struktur 3 dimensinya secara tepat (Tucker 1995).
Pada Gambar 32 dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan kadar glukosa dari 1.96%bk ekstrak (tanpa penambahan enzim β-glukosidase) menjadi 74.65%bk ekstrak setelah penambahan β-glukosidase 40 unit. Selanjutnya kadar glukosa menurun kembali seiring dengan menurunnya kadar vanilin hingga perlakuan 20 jam. Namun berbeda dengan kadar vanilin, perlakuan 24 jam inkubasi menyebabkan kadar glukosa meningkat kembali menjadi 75.10%bk ekstrak. Hal ini kemungkinan besar disebabkan pada waktu inkubasi 24 jam dimungkinkan senyawa-senyawa penghasil glukosa selain prekursor vanilin yang sukar didegradasi dapat terurai. Meski demikian peningkatan kadar glukosa pada waktu inkubasi 24 jam tersebut tidak terjadi signifikan.
Pada umumnya, selama ekstraksi, holding time harus cukup agar pelarut mampu melarutkan solut dan untuk perubahan komposisi sehingga mencapai kesetimbangan. Waktu yang diperlukan tergantung pada kelarutan solut terhadap pelarut dan juga tergantung pada beberapa faktor, antara lain suhu dan luas permukaan padatan yang terekspos dengan pelarut (Fellow 2000).
Berdasarkan percobaan pada tahap ini, waktu inkubasi optimum bagi aktifitas enzim β-glukosidase adalah selama 4 jam karena menghasilkan kadar vanilin ekstrak yang tidak berbeda nyata dengan waktu inkubasi yang lebih lama. Adapun ekstrak vanili segar yang dihasilkan dengan enzim β-glukosidase selama 0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 24 jam dapat dilihat pada Gambar 33.
Gambar 33 Ekstrak vanili segar dengan waktu inkubasi enzim β-glukosidase yang berbeda
Pada Gambar 33 terlihat bahwa perlakuan waktu inkubasi yang berbeda akan menghasilkan warna ekstrak vanili segar yang berbeda pula. Penampakan warna yang paling mencolok adalah perlakuan dengan waktu inkubasi 0 jam yang berwarna hijau kekuningan. Apabila waktu inkubasi ditingkatkan maka warna menjadi lebih coklat sesuai dengan kandungan vanilin dan glukosa yang terbentuk. 24jam 20jam 16jam 12jam 8jam 4jam 0jam