BAB III METODE PENELITIAN
C. Tata Cara Penelitian
8. Optimasi ketinggian lampu UV dan waktu perlakuan
Pada rangkaian alat lampu UV dibuat untuk dapat digerakan naik turun sehingga dapat mengoptimasikan jarak lampu UV yang dapat merubah warna larutan �-karoten dan masih dapat terukur dengan jarak 100 cm dari
dasar, 50 cm dari dasar, dan 35 cm dari dasar. Ditiap perbedaan ketinggian diukur intensitas cahaya lampu UV dengan alat lightmeter. Ditiap perbedaan ketinggian, pelat KLT yang sudah dicelupkan ke dalam larutan �-karoten dan dimasukkan ke dalam rangkaian alat dengan lampu UV yang menyala. Diukur perubahan warnanya menggunakan indikator warna tiap menit hingga 15 menit. Perubahan warna setiap diamati tiap 0, 1, 3, 6, 9, 12, dan 15 menit. 9. Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak dan isolat
Enam buah pelat KLT disiapkan, satu buah pelat untuk kontrol, lima buah pelat untuk perlakuan tiga kali replikasi pada ekstrak dan dua buah pelat untuk pengujian isolat yang tidak dilakukan replikasi. Larutan ekstrak ditotolkan dengan konsentrasi 5 mg/mL dan isolat konsentrasi 1 mg/mL (ditotolkan hingga mendapatkan mass loading 10 μg, 20 μg, dan 30 μg), kemudian elusikan pada fase gerak yang paling optimal. Larutan �-karoten 0,5mg/mL disiapkan dengan melarutkan �-karoten dalam kloroform. Lampu UV disiapkan dengan ketinggian optimal dan ukur intensitas cahaya yang dikeluarkan oleh lampu UV menggunakan lightmeter. Pelat KLT dicelupkan satu per satu kedalam larutan �-karoten dan dimasukkan pada rangkaian alat lampu UV selama 0, 1, 3, 6, 9, dan 12 menit tiap hitungan waktu dilihat perubahan warna yang terjadi menggunakan indikator skala warna. Nilai Rf pada spot pemisahan yang dapat mempertahankan warna orange kekuningan dihitung.
10. Uji kualitatif aktivitas antibakteri
Seluruh pekerjaan dilakukan secara aseptis menggunakan bunsen dan alkohol antiseptik.
a. Pembuatan media pertumbuhan 1) Media padat
Triptic Soy Broth (TSB) ditimbang sebanyak 6 g dan agar sebanyak 2,4 g. TSB dilarutkan kedalam aquadest 300 mL sambil dipanaskan. Tambahakan agar sedikit demi sedikit hingga homogen dan campuran menjadi bening. Autoklaf selama 15 menit. Selagi masih panas, tuangkan media pada cawan petri yang sudah disterilisasi.
2) Media cair
TSB ditimbang sebanyak 3 g dan larutkan kedalam erlenmeyer berisi aquadest 100 mL sambil dipanaskan. Aduk hingga homogen kemudian autoklaf selama 15 menit. Selagi panas pindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup.
b. Pengawetan bakteri
Koloni bakteri S. aureus dan E. coli yang masih segar dicuplik sebanyak satu goresan ose. Pindahkan kedalam tabung reaksi yang berisi media cair. Lakukan lagi hingga bakteri tidak tersisa. Inkubasi selama 24 jam pada inkubator suhu 37℃. Setelah diinkubasi, tabung reaksii yang berisi pertumbuhan bakteri divortex hingga homogen. 1000μL kultur bakteri diambil dan dimasukkan ke dalam tabung eppendrof kemudian dimasukan
gliserol 50μL, lakukan hingga habis kemudian ditutup rapat. Kultur bakteri diinkubasi dalam inkubator selama 1 jam kemudian disimpan di freezer. c. Pembuatan kultur bakteri uji
Satu tabung eppendrof berisi bakteri S. aureus dan satu tabung berisi bakteri E. coli disiapkan. Pada tabung reaksi yang berisi cairan fisiologis 0,9% sebanyak 10 mL ditambahkan koloni bakteri yang sudah siap tetes demi tetes hingga sama dengan MacFarland 0,5 yang setara dengan jumlah bakteri (1,5x108 CFU).
d. Perlakuan uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak menggunakan metode bioautografi
Pada cawan petri yang berisi media padat, digoreskan menggunakan cottonbud steril yang sudah dimasukkan dalam larutan bakteri uji yang sudah disiapkan secara merata keseluruh bagian.
Tiga buah pelat KLT disiapkan dengan lebar 1 cm. dengan larutan ekstrak 5mg/mL ditotolkan sebanyak 15μL, 20μL, 30μL. Kemudian elusi menggunakan fase gerak yang optimal. Tunggu 30 menit untuk menghilangkan sisa pelarut fase gerak yang digunakan.
Setelah semua siap, pelat KLT ditempelkan perlahan pada media padat dalam cawan petri yang sudah ditumbuhi bakteri. Setelah 45 menit, pelat KLT diambil, dan media padat diinkubasi selama 18 jam. Hasil positif adalah munculnya zona jernih pada spot pemisahan.
e. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat menggunakan metode disc diffusion
Larutan isolat disiapkan dengan konsentrasi 1mg/mL. Diambil
larutan isolat sebanyak 50 μL, 75 μL, dan 100 μL kemudian kering uapkan
larutan tersebut pada paper disc blank. Media Muller Hilton yang sudah memadat diinokulasikan bakteri S. aureus dengan teknik streak hingga merata, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Paper disc isolat yang sudah siap diinokulasikan pada media yang sudah ditumbuhi bakteri dan diinkubasi selama 24 jam. Amati zona jernih yang terbentuk dan diukur besar diameternya.
11. Isolasi senyawa aktif a. Triturasi
Ekstrak kental dan seasand ditimbang sebanyak 5 g. Keduanya dicampurkan dengan cara digerus sambil ditetesi menggunakan metanol secukupnya untuk mempermudahkan homogenisasi dan diibiarkan satu malam untuk menghilangkan metanol yang ditambahkan. Campuran ekstrak dipindahkan ke dalam tube sentrifuge hingga tanda volume 1 kemudian ditambahkan pelarut n-heksana hingga tanda volume 3. Tube divortex hingga homogen kemudian disentrifuge selama 10 menit.
Supernatant yang terbentuk diambil dan disaring, lalu diuapkan. Endapan
yang tersisa pada tube dikeringkan lalu ditambahkan pelarut yang diganti dengan kloroform : metanol (95:5 v/v), dan dilanjutkan dengan pelarut kloroform: metanol (9:1 v/v).
b. Kromatografi kolom
Fraksi ekstrak dari hasil triturasi menggunakan pelarut kloroform : metanol (95:5 v/v) dicampurkan dengan serbuk silika gel masing-masing sebanyak 300 mg kemudian digerus hingga homogen. Packing kolom yang digunakan dengan urutan susunan : kapas, silika gel setinggi 2 cm, ekstrak setinggi 0,5 cm, silika gel setinggi 1 cm, dan tutup dengan kapas. Masukkan eluen secara bergradien menggunakan pelarut yang sesuai yaitu 10 mL n-heksana : kloroform (20:80 v/v), 10 mL n-heksana : kloroform (10:90 v/v), dan 20 mL kloroform, kemudian ditampung setiap 2 mL ke dalam tabung kaca. Isolat dipastikan kemurniannya menggunakan kromatografi lapis tipis. Isolat yang memiliki pola pemisahan yang sama digabungkan menjadi satu isolat, diuapkan, dan dihitung rendemen yang didapat. Isolat yang sudah kering, dipindahkan kedalam eppendrof sehingga terdapat 1 mg tiap eppendrof.
12. Alur pengerjaan isolasi senyawa aktif
Gambar 3. Bagan alur pengerjaan isolasi senyawa aktif Ekstrak kental Kromatografi kolom Isolat 2 Isolat 1 Fraksi CHCl3:MeOH (9:1v/v) Fraksi heksan Triturasi Fraksi CHCl3:MeOH (95:5v/v)