BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
D. Optimasi Metode Folin-Ciocalteau
D. Optimasi Metode Folin-Ciocalteau 1. Pembuatan Larutan Standar
Standar yang digunakan dalam penelitian ini adalah phloroglucinol. Alasan pemilihan phloroglucinol sebagai standar karena phloroglucinol merupakan monomer phlorotannin alga. Selain itu, Zhang, et al. (2006) mendapatkan hasil pembacaan panjang gelombang maksimum produk berwarna biru yang dihasilkan dari metode Folin-Ciocalteau pada sampel alga A. nodosum dan standar phloroglucinol sama-sama berada pada panjang gelombang 750 nm atau dengan kata lain terdapat kesamaan karakteristik antara phlorotannin dengan standar phloroglucinol saat direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau.
Standar phloroglucinol yang telah dilarutkan dalam aseton 75% kemudian direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau, dibiarkan selama 2 menit, lalu ditambahkan Na2CO3 1,9 M untuk memberikan suasana basa sehingga fenol lebih mudah bereaksi. Setelah penambahan basa larutan menjadi berwarna biru. Agar homogen maka campuran divortex. Sebelum dibaca absorbansinya campuran disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan senyawa-senyawa yang tidak diketahui yang tidak larut dalam aseton maupun air. Supernatan hasil sentrifugasi berwarna biru sedangkan endapan berwarna putih. Supernatan tersebut kemudian dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer visibel.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
2. Penentuan Operating Time (OT)
Penentuan operating time (OT) perlu dilakukan dalam analisis dengan metode kolorimetri karena warna hasil reaksi tidak selalu stabil. Waktu reaksi dan pembentukan warna kompleks molybdenum-blue merupakan salah satu variasi dalam metode Folin-Ciocalteau. Oleh karena itu perlu ditentukan rentang waktu setelah sampel direaksikan dengan reagen sehingga hasil yang diperoleh dapat memberikan absorbansi yang stabil pada saat dibaca dengan spektrofotometer.
Operating time diukur dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis phloroglucinol, yaitu 750 nm. Hasil pengukuran operating time seperti pada gambar 9.
absorbansi 0,100 0,200 0,600 0,400 0,300 0,500 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 Waktu (menit)
Gambar 9. Spektra operating time phloroglucinol konsentrasi 4,0 ppm Dari hasil spektra pada gambar 9 maka dapat disimpulkan bahwa hasil reaksi memberikan nilai absorbansi yang stabil pada menit ke-50 hingga menit ke-90, dihitung sejak sampel direaksikan dengan reagen. Pada rentang waktu tersebut
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
senyawa polifenol yang terkandung dalam alga telah bereaksi sempurna dengan reagen Folin-Ciocalteau.
Pada saat reaksi terjadi, reagen Folin-Ciocalteau mendapatkan proton (H+) dari phloroglucinol dan air (tereduksi) membentuk kompleks oktahedral molybdenum blue. Sementara itu, phloroglucinol akan mendapatkan tambahan oksigen dari air dan reagen (teroksidasi) sehingga membentuk kuinon (gambar 10). Kompleks oktahedral yang terbentuk merupakan kompleks MoO3-fosfat dengan fosfor (P) sebagai pusatnya. Molibdat pada kompleks tersebut dapat disubstitusi oleh tungsten.
Reaksi reduksi reagen Folin-Ciocalteau : H3PO4(MoO3)12 2H H3PO4(MoO3)12 4H + 2e + H5(PMo12O40) ( + 4e + H7(PMo12O40) ( 2) 3) OH OH HO H2O O OH O HO 4H+ + + + 4e oksidator
Gambar 10. Reaksi oksidasi phloroglucinol
Reaksi sempurna berarti semua phloroglucinol dalam fraksi etil asetat alga coklat telah bereaksi dengan reagen dan menghasilkan molybdenum blue (gambar 11).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40 OH OH HO + H3PO4(MoO3)12 + H2O O O OH HO H7(PMo12O40) +
Gambar 11. Reaksi phloroglucinol dengan reagen Folin-Ciocalteau
3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λmaks)
Panjang gelombang maksimum (λmaks) merupakan panjang gelombang suatu senyawa memberikan absorbansi maksimum. Panjang gelombang maksimum ditentukan dan digunakan untuk membaca absorbansi sampel. Mulja dan Suharman (1995) menyatakan pembacaan absorbansi pada panjang gelombang maksimum akan memberikan sensitivitas dan presisi analisis yang maksimal.
Zhang, et al. (2006) telah melakukan penelitian mengenai estimasi kandungan polifenol total pada sampel rumput laut dan ekstraknya berdasarkan reaksi Folin-Ciocalteau. Pada penelitian tersebut diperoleh panjang gelombang maksimum standar phloroglucinol adalah 750 nm. Untuk melihat puncak spektrum yang lebih jelas di sekitar panjang gelombang 750 nm maka scanning dilakukan pada rentang 400-900 nm.
Scanning panjang gelombang dilakukan menggunakan tiga konsentrasi baku phloroglucinol yang berbeda yaitu 1,0; 3,0; dan 6,0 ppm yang direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau. Pemilihan ketiga konsentrasi tersebut didasarkan atas pertimbangan bahwa ketiganya dianggap mewakili konsentrasi rendah, menengah, dan tinggi. Hasil yang diperoleh menunjukkan tiga puncak absorbansi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
maksimum pada panjang gelombang yang berbeda, yaitu 758,7 nm; 750,1 nm; dan 743,4 nm (gambar 12). λ (wavelength) a b s o r b a n c e u n i t ( a u ) 0 ,1 0 0 0 ,2 0 0 0 ,3 0 0 0 ,4 0 0 0 ,5 0 0 0, 7 0 0 0 ,6 0 0 0 ,8 0 0 C B A
Gambar 12. Spektra scanning panjang gelombang maksimum phloroglucinol pada tiga konsentrasi (A = 1,0 ppm; B = 3,0 ppm; C = 6,0 ppm) setelah
direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau
Dari hasil scanning panjang gelombang maksimum, ditemukan bahwa semakin besar konsentrasi standar phloroglucinol yang direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau maka panjang gelombang maksimum cenderung bergeser ke panjang gelombang yang lebih kecil. Hal ini disebabkan oleh reduksi reagen Folin-Ciocalteau yang tidak terkontrol. Auterhoff dan Knabe (1978) menyebutkan dua bentuk reduksi reagen Folin-Ciocalteau, seperti tertulis pada persamaan (2) dan (3). Reaksi reduksi tersebut ditentukan oleh keasaman (pH). Keterbatasan penelitian ini adalah tidak terkontrolnya keasaman larutan pada saat dianalisis. Dengan demikian
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
reaksi reduksi reagen dapat terjadi dalam dua bentuk, sehingga berpengaruh pada hasil reaksi redoks yang menyebabkan terjadinya pergeseran panjang gelombang.
Oleh karena diperoleh tiga panjang gelombang yang berbeda, maka absorbansi standar phloroglucinol dibaca pada ketiga panjang gelombang tersebut. Hasil pembacaan absorbansi menunjukkan perbedaan yang tidak berbeda jauh. Oleh karena itu, untuk pembacaan absorbansi seri baku dan sampel dipilih panjang gelombang 750,1 nm karena merupakan panjang gelombang yang mendekati panjang gelombang maksimum teoritis phloroglucinol yaitu 750 nm (Zhang, et al., 2006).
4. Pembuatan Kurva Baku Phloroglucinol
Kurva baku phloroglucinol dibuat sebanyak tiga replikasi agar hasil yang diperoleh dapat menggambarkan kondisi yang sebenarnya. Absorbansi larutan kurva baku dibaca pada panjang gelombang 750,1 nm. Dengan demikian diperoleh tiga persamaan kurva baku yang berbeda (tabel I).
Tabel I. Data replikasi seri baku phloroglucinol
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Seri Baku Kadar (mg/100mL) absorbansi Kadar (mg/100mL) absorbansi Kadar (mg/100mL) absorbansi 1 0,1024 0,138 0,1046 0,132 0,1016 0,121 2 0,2048 0,269 0,2091 0,257 0,2032 0,238 3 0,3071 0,405 0,3137 0,407 0,3048 0,379 4 0,4095 0,516 0,4182 0,514 0,4064 0,542 5 0,5119 0,648 0,5228 0,643 0,5080 0,602 6 0,6143 0,768 0,6274 0,712 0,6096 0,720 A 0,0175 A 0,0277 A 0,0087 B 1,2274 B 1,1381 B 1,1952 r 0,9997 r 0,9956 r 0,9941 y = 1,2274 x + 0,0175 y = 1,1381 x + 0,0277 y = 1,1952 x + 0,0087
Berdasarkan hasil perhitungan pada tabel I dapat dilihat hubungan yang linier antara konsentrasi phloroglucinol dan absorbansi yang dihasilkan, yaitu dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
melihat koefisien korelasi (r) masing-masing replikasi. Koefisien korelasi (r) replikasi I (0,9997), replikasi II (0,9956), dan replikasi III (0,9941). Dari ketiga replikasi tersebut dipilih satu persamaan kurva baku yang memiliki parameter linearitas yang paling baik, yaitu persamaan kurva baku replikasi I. Persamaan kurva baku replikasi I dipilih untuk menghitung kadar sampel karena memiliki nilai r paling mendekati 1. Nilai r yang mendekati 1 menunjukkan adanya korelasi antara peningkatan konsentrasi dengan kenaikan nilai respon absorbansi. Persamaan kurva baku yang digunakan adalah y = 1,2274 x + 0,0175 (gambar 13).
Kurva Baku 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000 0.7000 Konsentrasi (ppm ) A b so rb an si y = 1.2274 x + 0.0175
Gambar 13. Kurva baku phloroglucinol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
E. Estimasi Kadar Phlorotannin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Coklat