BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
B. Pengembangan Metode Analisis Alpurinol dalam Jamu secara
1. Optimasi Sistem KCKT
a. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Alopurinol
Penentuan panjang gelombang maksimum (maks) larutan baku alopurinol bertujuan untuk mendapatkan hasil analisis dengan sensitivitas tertinggi.
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan mengamati panjang
gelombang pada rentang 200-400 nm dan menggunakan lima level konsentrasi,
yaitu 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; dan 15,0g/mL. Panjang gelombang maksimum merupakan karakteristik fisiko kimiawi suatu senyawa, oleh karena itu panjang
gelombang maksimum tidak berubah meskipun konsentrasi berbeda. Panjang
gelombang pengamatan pada penelitian ini.Berikut adalah tabel panjang
gelombang maksimum alopurinol hasil pengukuran.
Tabel VI. Panjang gelombang maksimum alopurinol hasil pengukuran
Konsentrasi
(g/mL) maks terukur Rata-rata maks terukur 5,0 272,9 273,7 ≈ 274 nm 7,5 273,9 10,0 273,7 12,5 274,0 15,0 273,8
Menurut Clarks (2005) maksteoritis alopurinol sebesar 257 nm dalam NaOH 0,1 N namun dalam penelitian ini diperoleh rata-rata maks terukur sebesar 274 nmdalam pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol (Tabel VI).
Perbedaan maks tersebut dapat disebabkan adanya perbedaan pelarut yang dipengaruhi oleh kepolaran pelarut sehingga mempengaruhi maks karena kepolaran molekul berubah jika suatu elektron bergerak dari satu orbital ke orbital
lainnya.Pengaruh pelarut biasanya mencapai hingga 20 nm (Pecsok, 1968).
Menurut perhitungan polaritas, NaOH 0,1 N memiliki indeks polaritas sebesar
10,2 sedangkan amonium hidroksida sebesar 5,4 (Lampiran 8). Dalam pelarut
polar (NaOH 0,1 N) transisi * suatu molekul memerlukan energi yang lebih besar dibandingkan pelarut yang kurang polar (amonium hidroksida 5% dalam
metanol).Untuk selanjutnya digunakan panjang gelombang maksimum 274 nm.
b. Penentuan Fase Gerak
Pemisahan senyawa analit alopurinol menggunakan sistem KCKT fase
terbalik, dimana fase gerak yang digunakan lebih polar dibandingkan dengan fase
yang digunakan adalah campuran metanol : amonium hidroksida 0,1%dalam
akuabides. Pada sistem KCKT fase terbalik ini, senyawa yang lebih polar akan
terelusi terlebih dahulu dibandingkan senyawa yang lebih nonpolar. Hal ini terjadi
karena senyawa yang lebih polar akan lebih kuat untuk berinteraksi dengan fase
gerak dibandingkan dengan fase diam dan menyebabkan akan lebih mudah
terelusi melewati fase diamnya, sedangkan senyawa yang bersifat lebih nonpolar
akan cenderung berinteraksi lebih kuat dengan fase diamnya sehingga akan
tertinggal pada kolom lebih lama.
Gambar 11. Interaksi alopurinol dengan fase diam C18
melalui interaksi van Der Waals
Gambar 12. Interaksi alopurinol dengan fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides melalui interaksi hidrogen
Pada penelitian ini, fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol
p.a. dan akuabides yang ditambahkan dengan amonium hidroksida 0,1%. Metanol digunakan sebagai salah satu penyusun komposisi fase gerak karena metanol
memiliki viskositas yang rendah yaitu 0,55 cp sehingga dapat menurunkan
tekanan pada kolom (Gandjar dan Rohman, 2010). Penggunaan amonium
hidroksida 0,1% sebagai campuran fase gerak ini bertujuan untuk mengurangi
interaksi alopurinol dengan gugus silanol pada C18 yang dapat mengakibatkan
waktu retensi lebih lama dan peak tailing (Snyder dkk., 2010).
Untuk mendapatkan kepolaran fase gerak yang sesuai, optimasi komposisi
fase gerak dilakukan terhadap perbandingan metanol :amonium hidroksida 0,1%
dalam akuabides yaitu 30:70; 20:80 dan 10:90. Pada penelitian ini dilakukan
penurunan jumlah metanol secara bertahap. Menurut Snyder dkk. (1997), dengan
meningkatnya jumlah metanol dalam sistem KCKT fase terbalik maka analit akan
terelusi lebih mudah. Namun hal tersebut tidak dilakukan, karena didalam sampel
terdapat banyak analit atau senyawa – senyawa yang terkandung, sehingga apabila
dilakukan peningkatan metanol maka alopurinol sebagai analit yang akan
dianalisis dapat terelusi lebih cepat dan terpisah dengan analit lain. Akibatnya
puncak alopurinol akan menumpuk dengan puncak lain dan menjadikan penelitian
ini menjadi tidak spesifik dan selektif.
Tabel VII. Perbandingan masing-masing komposisi fase gerak dan indeks polaritas
No.
Komposisi Fase Gerak
′= Φ . ′ + Φ . ′ Polaritas Indeks Metanol + Akuabides amonium hidroksida 0,1% 1. 10 : 90 (0,1 x 5,1) + (0,9 x 10,2) 9.69 2. 20 : 80 (0,2 x 5,1) + (0,8 x 10,2) 9,18 3. 30 : 70 (0,3 x 5,1) + (0,7 x 10,2) 8,67
Nilai indeks polaritas yang semakin besar akan menyebabkan fase gerak
bersifat lebih polar. Alopurinol yang memiliki nilai polaritas sebesar 11,92
(MarvinSketch) merupakan senyawa yang bersifat polar. Berdasarkan prinsip like dissolve like, maka komposisi fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides(10:90) dengan nilai indeks polaritas sebesar 9,69 dapat
mengelusi alopurinol pada sistem KCKT ini.
Sistem elusi yang digunakan adalah sistem isokratik dimana tidak ada
perubahan komposisi fase gerak selama proses elusi. Tujuan digunakannya sistem
isokratik karena peneliti ingin melihat respon pemisahan yang dapat dihasilkan
oleh optimasi campuran fase gerak.Pencampuran kedua komposisi fase gerak
dilakukan di dalam instrumen KCKT.
Komponen fase gerak harus disaring terlebih dahulu dengan menggunakan
kertas saring Whatmanukuran pori 0,45m dengan bantuan pompa vakum untuk menghilangkan adanya partikel-partikel kecil yang dapat menyumbat kolom
sehingga dapat mempengaruhi analisis pada sistem KCKT. Kertas saring
Whatman yang digunakan untuk menyaring fase gerak terdapat dua macam yaitu kertas Whatman organik yang digunakan untuk menyaring larutan organik (metanol) dan kertas Whatman anorganik untuk menyaring larutan anorganik (akuabides).Selanjutnya fase gerak di degassing dengan menggunakan ultrasonikator selama 15 menit yang bertujuan untuk menghilangan gelembung
udara yang terdapat dalam fase gerak. Adanya gelembung udara yang terdapat
dalam fase gerak dapat mengakibatkan tekanan pada pompa menjadi tidak stabil
c. Optimasi Komposisi Fase Gerak dan Flow Rate
Optimasi yang dilakukan dengan menggunakan metode KCKT ini adalah
mengubah komposisi fase gerak dan flow rate untuk mendapatkan pemisahan yang optimal. Komposisi fase gerak yang dilakukan adalah 10:90; 20:80 dan
30:70 (campuran metanol dan amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides)
dengan flow rate 0,5; 0,8 dan 1 mL/menit.
Berikut ini merupakan kromatogram optimasi komposisi fase gerak dan
flow rate kurva baku alopurinol.
a) Fase gerak I metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90)
Gambar 13. Kromatogram baku alopurinol dengan komposisi fase gerak metanol :amonium
hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90). Keterangan : (1) baku flow rate 0,5 mL/menit;
(2) baku flow rate 0,8 mL/menit; (3) baku flow rate 1 mL/menit
b) Fase gerak II metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (20:80)
Gambar 14. Kromatogram baku alopurinol dengan komposisi fase gerak metanol :amonium
hidroksida 0,1% dalam akuabides (20:80). Keterangan : (1) baku flow rate 0,5 mL/menit; (2)
baku flow rate 0,8 mL/menit; (3) baku flow rate 1 mL/menit
c) Fase gerak III metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (30:70)
Gambar 15. Kromatogram baku alopurinol dengan komposisi fase gerak metanol :amonium
hidroksida 0,1% dalam akuabides (30:70). Keterangan : (1) baku flow rate 0,5 mL/menit; (2)
baku flow rate 0,8 mL/menit; (3) baku flow rate 1 mL/menit
Dari kromatogram diatas dilakukan pengukuran terhadap parameter
jumlah waktu retensi,jumlah lempeng (N),HETP,tailing factor, dan Rs yang disajikan pada tabel berikut.
Tabel VIII. Nilai parameter tR, N, HETP, Tf, dan Rs
Fase Gerak Flow rate (mL/ menit) N HETP Tf ( 2,0) Rs ( 1,5) Keterangan Metanol : Amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides 10 : 90 0,5 7381 20,3 0,9 2,2 Memenuhi 0,8 6007 25,0 1,0 1,8 Memenuhi 1,0 4969 30,2 1,1 1,7 Memenuhi 20 : 80 0,5 5491 27,3 1,1 1,2 Rs tidak memenuhi 0,8 4632 32,4 1,1 1,2 Rs tidak memenuhi 1,0 4015 37,4 1,1 1,4 Rs tidak memenuhi 30 : 70 0,5 7550 19,8 1,1 1,1 Rs tidak memenuhi 0,8 5092 29,4 1,2 0,2 Rs tidak memenuhi 1,0 4332 34,6 1,2 - Rs tidak memenuhi
i. Waktu retensi Alopurinol
Waktu retensi (tR) merupakan karakteristik fisiko kimiawi suatu senyawa, oleh karena itu masing-masing analit memiliki waktu retensi yang berbeda.
Sebelum dilakukan optimasi komposisi dan flow rate pada fase gerak, terlebih dahulu dilakukan orientasi untuk mengetahui letak peak tunggal dari senyawa analit. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa peak yang muncul pada larutan baku adalah alopurinol dan juga melihat parameter optimasi yang memenuhi
syarat yaitu 10 menit (Depkes RI, 1995).
Pada tabel VIII dapat diamati bahwa waktu retensi yang diperoleh
memenuhi persyaratan 10 menit, baik dengan perbandingan komposisi fase gerak dan flow rate. Pada sistem KCKT terbalik, kekuatan fase gerak dalam mengelusi akan semakin meningkat seiring dengan menurunnya polaritas.
ii. HETP danJumlah LempengTeoretis (N)
HETP menggambarkan kinetika interaksi molekul - molekul senyawa
didalam sistem KCKT yang digunakan (Noegrohati, 1994), oleh karena itu
penggunaan fase gerak yang lebih polar dan laju alir yang lebih lambat,
memberikan HETP terendah, dengan konsekuensi jumlah lempeng teoretis
tertinggi.Pada fase gerak III dengan flow rate 0,5 mL/menit menghasilkan nilai HETP yang lebih kecil dibandingkan fase gerak I dan II dengan flow rate yang sama. Hal tersebut dapat dilihat pada gambar kurva van Deemter berikut.
Gambar 16.Kurva van Deemter (Willard, 1988)
Berdasarkan Gambar 16 dapat dilihat bahwanilai HETP dipengaruhi oleh
difusi eddy (A), difusi longitudinal (B) dan transfer massa (C). Berdasarkan data
yang diperoleh, nilai HETP dipengaruhi oleh transfer massa dan difusi
longitudinal. Pada flow rate yang tinggi, kesetimbangan dalam proses transfer massa menjadi dominan dimana semakin besar flow rate maka semakin besar nilai HETP yang diperoleh. Namun dalam penelitian terjadi ketidaksesuaian nilai
HETP pada fase gerak I dan III dengan flow rate 0,5 mL/menit. Hal ini disebabkan oleh difusi longitudinal yang berpengaruh terhadap flow rate yang rendah. Difusi longitudinal berkaitan dengan viskositas fase gerak dimana pada
fase gerak yang memiliki viskositas yang tinggi dapat terjadi difusi longitudinal
sehingga menyebabkan pembesaran nilai HETP yang diperoleh. Pada fase gerak I
memiliki viskositas 0,86 cp, sedangkan fase gerak III memiliki viskositas 0,79 cp
sehingga pada fase gerak I mengalami difusi longitudinal yang lebih besar dan
Jumlah lempeng teoritis (N) sangat penting dalam pemilihan fase
gerak.Nilai N menggambarkan efisiensi pada sistem KCKT untuk mengetahui
kemampuan sistem KCKT dalam memisahkan analit.Nilai N berbanding terbalik
dengan nilai HETP. Berdasarkan Snyder dkk (2010), jumlah lempeng yang baik
untuk kolom C18 150 x 4,6 mm dengan ukuran partikel 5 m adalah 3000 lempeng. Pada tabel VIII dapat diamati bahwa jumlah lempeng yang diperoleh
pada fase gerak I, II, dan III telah memenuhi persyaratan yaitu 3000 lempeng. iii. Tailing factor
Nilai tailing factor yang diperoleh dapat digunakan sebagai pertimbangan untuk menentukan komposisi dan flow rate fase gerak yang paling optimal.Nilai
tailing factor bertujuan untuk melihat kesimetrisan dari puncak yang terbentuk dimana puncak simetris yang sempurna yaitu menyerupai puncak Gaussian. Pada
penelitian, tailing factor dapat terjadi disebabkan oleh adanya adsorpsi atau interaksi lain yang lebih kuat antara analit dengan fase diam, sedangkan puncak
mengalami fronting karena kolom yang digunakan overload, reaksi kimia atau isomerisasi selama kromatografi (Ahuja and Dong, 2005). Syarat untuk nilai
tailing factor adalah 2, dimana jika Tf yang dihasilkan 2 maka kemungkinan terjadi permasalahan sehingga dapat mengakibatkan peak mengalami tailing
(Synder et al., 2010). Dari data yang diperoleh berdasarkan tabel VIII dapat diamati bahwa untuk semua komposisi fase gerak dan flow rate yang digunakan memenuhi syarat nilai Tf yang baik, yaitu nilai Tf 2(Synder dkk., 2010). Semakin kecil nilai Tf maka puncak yang terbentuk akan semakin simetris. Pada
data tabel tersebut menunjukkan nilai Tf paling kecil terdapat pada fase gerak I
dengan flow rate 0,5 mL/menit. iv. Resolusi
Nilai resolusi menggambarkan daya pemisahan kolom dua senyawa analit
yaitu antara alopurinol dengan puncak terdekat yang berada pada sebelah kiri
puncak alopurinol (terelusi lebih dulu). Tujuan pengamatan nilai resolusi ini
adalah untuk mengetahui komposisi dan flow rate yang dapat menghasilkan kromatogram dengan nilai resolusi 1,5 (Synder, Kirkland, and Glajch, 2012). Nilai resolusi yang besar dapat meminimalisasikan adanya gangguan analit lain
terhadap puncak sehingga pengukuran akan lebih spesifik. Pada tabel VIIIdapat
diamati bahwa nilai Rs yang memenuhi persyaratan 1,5 adalah fase gerak I. Dari ketiga flow rate pada fase gerak I, flow rate 0,5 mL/menit memiliki nilai resolusi yang paling besar yaitu 2,2.
Berdasarkan parameter diatas menunjukkan fase gerak I dengan flow rate
0,5 mL/menit sebagai fase gerak yang optimal dengan waktu retensi sebesar ± 4,9
menit, oleh karena itu komposisi fase gerak dan flow rate yang digunakan adalah fase gerak I dengan perbandingan 10:90 dan flow rate 0,5 mL/menit.