Sirih merah (Piper crocatum) merupakan salah satu tanaman yang dapat dimanfaatkan sebagai obat alternatif. Telah dilakukan uji identifikasi kandungan kimia ekstraketanol daun sirih merah dan didapatkan bahwa sirih merah mengandung alkaloid, saponin, flavonoid dan polifenolat (Yulias dkk, 2011). Selain itu daun sirih merah mengandung nilai nutrisi yang dibutuhkan untuk peningkatan proses penyembuhan, misalnya vitamin A dan C (Prahastuti, 2004). Sedangkan pada penelitian lain menunjukan bahwa komponen senyawa yang terkandung pada ekstraketanol 70% daun sirih merah adalah golongan asam lemak, terpenoid, flavonoid, steroid, alkaloid, pirimidin, minyak atsiri, polifenol dan vitamin E (Alfarabi, 2010). Hal ini dapat menjadi bahan pertimbangan untuk penggunaan daun sirih merah sebagai bahan obat alternatif untuk Stomatitis Aftosa Rekuren (SAR).
Untuk mengembangkan bahan pengobatan Stomatitis Aftosa Rekuren (SAR) yang alami maka harus diuji terlebih dahulu dengan uji biokompatibilitas sesuai dengan syarat material di bidang kedokteran gigi terutama yang digunakan di dalam mulut. Salah satu pengujian untuk menentukan berbagai sifat dari suatu bahan kedokteran gigi adalah uji sitotoksisitas terhadap jaringan (Maat, 2001). Untuk mengetahui sitotoksisitas ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum)
maka dilakukan pengujian terhadap sel fibroblas menggunakan esei MTT.
Penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanol daun sirih merah terhadap sel fibroblas ini menggunakan ekstrak etanol daun sirih merah dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, dan 12,5%.
39
Penelitian ini merupakan uji pendahuluan, yaitu uji toksisitas dari bahan secara in vitro yang diujikan secara langsung pada kultur sel atau jaringan. Uji sitotoksisitas dapat dilakukan dengan menggunakan hewan coba secara in vivo atau menggunakan kultur sel secara in vitro. Prinsip dasar menumbuhkan sel secara in vitro adalah merancang sistem kultur agar menyerupai keadaan in vivo. Sel yang akan diteliti dipindah dari jaringan asalnya, kemudian ditempatkan dalam wadah kultur untuk mendapatkan tempat pertumbuhan dan nutrisi yang cukup pada temperatur 37 C dan lingkungan gas (95% CO2 95% udara) pada pH 7,4-7,7 (Freshney, 2000).
Uji sitotoksisitas menggunakan esei MTT ini berdasar kemampuan sel hidup untuk mereduksi garam [3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromide] (MTT). Reduksi garam tetrazolium terjadi di intrasel dan melibatkan enzim dari retikulum endoplasma dan mitokondria. Dengan demikian jumlah sel yang hidup dapat diukur sebagai konsentrasi hasil produksi MTT. Parameter sitotoksisitas yang utama berdasarkan pada nilai absorbansi. Apabila warna sel semakin pekat (biru keunguan), maka nilai absorbansi semakin tinggi yang berarti semakin banyak sel yang hidup. Namun bila warna sel semakin pudar, maka nilai absorbansi semakin rendah, artinya banyak sel yang mati (Fazwishni dkk, 2000).
Pada penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanol dauh sirih merah (Piper Crocatum) terhadap sel fibroblas ini didapatkan bahwa jumlah sel hidup pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5% secara berurutan adalah 100%, 63,47%, 52,52%, dan 56,21%. Hal ini berarti persentase sel hidup menunjukan lebih dari 50% setelah terpapar ekstraketanol daun sirih merah (Piper crocatum) yang menunjukan sirih merah tidak bersifat toksik (Telili dkk, 1999).
Nilai absorbansi tertinggi didapatkan pada kelompok yang menggunakan ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) dengan konsentrasi 100% dan terendah pada kelompok yang menggunakan ekstraketanol daun sirih merah (Piper crocatum) dengan konsentrasi 25%. Pada konsentrasi 12,5%, 25% dan 50% tidak memiliki perbedaan yang bermakna, kemungkinan dikarenakan bahan aktif yang terkandung di dalamnya juga semakin sedikit. Pada konsentrasi 12,5%, dan 25% jumlah sel fibroblas mengalami penurunan. Mekanisme dan intensitas kematian sel tergantung pada kadar bahan atau obat yang berkontak dengan sel. Sel yang terpapar bahan atau obat melebihi puncak paparan akan menyebabkan kematian sel (Soenartyo, 2003). Pada konsentrasi 100% memiliki jumlah persentase sel hidup sebesar 100% yang artinya tidak terjadi kematian sel. Hal ini disebabkan kemungkinan oleh adanya kadar bahan yang terkandung dalam sirih merah yang berpengaruh terhadap proliferasi sel fibroblas. Berdasarkan analisis GC-MS (Gas Chromatogrpahy Mass Spectrometry ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) 70% ditemukan bahwa polifenol merupakan bahan aktif yang paling banyak terdapat dalam sirih merah yaitu sebesar 44,69% (Alfarabi, 2010). Flavonoid merupakan salah satu senyawa golongan terbesar dalam polifenol. Flavonoid merupakan senyawa yang terdapat dalam sirih merah (Piper crocatum) yang diketahui berperan dalam proses antiinflamasi dan mempunyai efek sebagai antioksidan. Flavonoid berfungsi untuk membatasi pelepasan mediator inflmasi dengan cara penghambatan siklooksigenase dan lipoksigenase sehingga terjadi pembatasan jumlah sel inflamasi yang bermigrasi ke jaringan perlukaan. Selanjutnya reaksi inflamasi akan berlangsung lebih singkat dan kemampuan proliferatif dari transforming growth factor-β (TGF- ) tidak
41
terhambat sehingga proses proliferasi segera terjadi. Aktifitas flavonoid dalam mempercepat proses penyembuhan luka didukung juga oleh mekanisme antioksidan dalam melakukan penghambatan aktifitas radikal bebas (Indraswary, 2011). Hal ini didukung oleh penelitian yang telah dilakukan sebelumnya yang membuktikan bahwa daun sirih merah mempunyai kemampuan antioksidan yang disebabkan adanya kandungan flavonoid yang bekerja dengan jalan menghambat oksidasi lipid (Alfarabi dkk, 2010). Antioksidan mampu memblokir inisiasi dari susunan radikal bebas sehingga hormon pertumbuhan (Growth Factor) dapat memicu proliferasi sel fibroblas (Kumar dkk, 2000). Migrasi dan proliferasi dari sel fibroblas dipengaruhi oleh sejumlah Growth Factor seperti platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor
(EGF) dan transforming growth factor-β (TGF- ). TGF- yang terkandung dalam sel inflmasi, jika muncul akan memberikan peran yang penting karena dapat mempengaruhi deposisi dari jaringan fibrous. Hal ini dikarenakan TGF- diproduksi oleh sel-sel dalam jaringan granulasi serta menyebabkan migrasi dan proliferasi sel fibroblas (Vegad, 1995). Stimulasi TGF- akan meningkatkan
aktifitas fibronektin di dalam pembentukan gumpalan fibrin. Gumpalan fibrin yang terbentuk oleh peningkatan aktifitas fibronektin akan menjadi kerangka bagi re-epitelisasi dan proliferasi fibroblas (Indraswary, 2011). Selain polifenol, sirih merah juga diketahui mengandung mengandung alkaloid, saponin, flavonoid dan polifenolat (Yulias dkk, 2011). Daun sirih merah juga mengandung nilai nutrisi yang dibutuhkan untuk peningkatan proses penyembuhan, misalnya vitamin A dan C (Prahastuti, 2004) Saponin diketahui sebagai salah satu senyawa yang memacu pembentukan kolagen, dan dapat meningkatkan kepadatan fibroblas
dengan aktifasi TGF- (Kanzaki, 1998). Selain itu terpenoid merupakan bahan aktif yang membantu mempercepat pembentukan sabut kolagen yang dihasilkan oleh sel fibroblas (Waha, 2000). Bahan aktif lain yang terkandung dalam sirih merah yaitu vitamin A dan vitamin C yang berperan secara tidak langsung terhadap proliferasi sel fibroblas. Vitamin A dapat mempercepat fase inflmasi ke fase proliferasi dengan meningkatkan monosit dan makrofag ke daerah luka (Jeffcoate dkk, 2004). Salah satu fungsi makrofag yaitu menghasilkan Gowth factor yang berperan dalam proliferasi sel fibroblas (Vegad, 1995). Selain itu vitamin A dapat mempengaruhi aktifitas sel limfosit T dan produksi sitokin. Berdasarkan sitokin yang dihasilkan sel T helper (Th) dibagi menjadi Th1 dan Th2. Sel Th1 akan menghasilkan sitokin interlukin-2 (IL-2) dan Tumor Necrosis Factor (TNF) yang berperan langsung dalam mengaktifkan makrofag. Vitamin A dalam bentuk asam retinoat (alltrans retinoic acid) juga merupakan regulator transkripsional ekspresi gen yang mengkode sitokin stimulator terhadap makrofag yaitu interferon-alpha (IFN- ) dan interlukin-4 (IL-4) (Isnaeni, 2012). Vitamin C berfungsi menstimulir respon kemotaktik dan proliferasi dari neutrofil serta transformasi limfosit. Material-material yang terlepas dari neutrofil dapat menstimulasi migrasi dan proliferasi dari sel fibroblas. Neutrofil memproduksi dan melepaskan mediator inflamasi seperti Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) dan interlukin-1 (IL-1) yang mempercepat aktifasi sel fibroblas dan sel epitel (Rinasiti, 2003). Hal ini dapat dijadikan pertimbangan untuk mengembangkan potensi daun sirih merah sebagai obat penyembuh luka dalam perawatan SAR (Stomatitis Aftosa Rekuren).
43