Invensi ini berhubungan dengan penggunaan senyawa derivat kalkon bersubstituen fluoro, yaitu 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksi-fenil)-2-propen-1-on baik tunggal dan kombinasinya dengan agen ko-kemoterapi doksorubisin sebagai antikanker pada sel kanker leher rahim.
Latar Belakang Invensi
Kanker leher rahim merupakan salah satu kanker penyebab kematian kedua di dunia pada wanita setelah kanker payudara. Pada negara berkembang kanker leher rahim merupakan kanker yang paling banyak pada wanita, hampir 25% dari semua jenis kanker yang menyerang wanita (WHO, 2009). Berdasarkan sepuluh kanker primer pada wanita di Indonesia, kanker leher rahim menempati posisi pertama (28,66%) (Tjindarbumi dan Mangunkusumo, 2002). Faktor resiko kanker leher rahim meliputi infeksi Human Papiloma Virus (HPV), hubungan seks pada umur yang terlalui dini, imunosuppresi, multiple sexual partner, penggunaaan kontrasepsi oral dan kekurangan betakaroten (Tsao et al., 2004). Banyaknya faktor resiko yang dapat menyebabkan kanker leher rahim ini membuat angka kejadiannya sangat tinggi terutama di Negara
48
berkembang seperti Indonesia. Oleh karena itu, pengembangan dan penemuan pengobatan kanker leher rahim perlu terus diupayakan.
Salah satu permasalahan yang sering timbul dalam pengobatan kanker adalah resistensi obat kemoterapi (drug-resistence) (Wong et al., 2006). Diantara agen kemoterapi kanker yang telah menimbulkan resistensi adalah doksorubisin. Senyawa golongan antrasiklin ini diberikan pada berbagai jenis kanker. Selain menimbulkan resistensi, doksorubisin dapat menyebabkan kardiotoksisitas pada penggunaan jangka panjang (Ferreira et al., 2008). Salah satu alternatif untuk mengatasi resistensi adalah kombinasi agen kemoterapi dengan agen kemopreventif sehingga dapat meningkatkan keberhasilan terapi.
Kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) (Gambar 1) adalah jenis keton dengan ikatan tidak jenuh yang telah banyak di teliti sebagai senyawa terapetika, khususnya sebagai obat antitumor.
Gambar 1. Kerangka dasar struktur senyawa kalkon
Oleh karena aktivitasnya sebagai ”high therapeutic index”, kalkon di anggap sebagai ”the new era of medicines” dalam kapasitasnya sebagai antitumor, antibakterial, dan anti-inflamatory (Afzal et al., 2008). Disebutkan pula bahwa sebagian besar target utama dari senyawa-senyawa
49
kalkon adalah mempengaruhi daur sel (Boumendjel et al., 2009). Shen et al, 2007 telah membuktikan bahwa struktur dasar kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) mampu menghambat aktivasi nuclear factor kappa
(NF-aktivasi
NF-apoptosis, penghambatan siklus sel, dan menurunkan ekspresi Bcl-XL sebagai downstream target dari
NF-kanker kandung kemih T24 dan HT-1376, serta sel payudara MCF-7 dan MDA-MB-231 (Hsu et al., 2006). Beberapa senyawa derivat kalkon yang mengandung gugus hidroksi pada posisi para seperti broussochalcone A; xanthoangelol D; butein; isoliquiritigenin; licochalcone A; isoliquiritigenin 2’-metil eter, dan xanthohumol juga mampu menghambat aktivasi
NF- et al., 2011).
Penelusuran terhadap beberapa paten menunjukkan bahwa beberapa derivat kalkon telah digunakan dalam pengobatan kanker, seperti pada United States Patent US 6,498,195 B2 “Use of 1-Propanone-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-hydroxy-hydroxyphenyl as anticarcinogenic agent”, United States Patent US 7,872,029 B2 “Chalcone and its analogs as agent for the inhibition of angiogenesis and related disease states”.
Arty et al., (2000), berhasil mensintesis beberapa senyawa derivat kalkon, yaitu mono para-hidroksi kalkon, diantaranya senyawa yang mengandung substituen fuoro, yaitu
50
Gambar 2. Struktur senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on
Berdasarkan uji aktivitas penghambatan lipid peroksidasi non enzimatis, dan aktivitas penghambatan siklooksigenase, senyawa ini menunjukkan sangat poten sebagai antioksidan. Pada beberapa senyawa golongan terpenoid, adanya aktivitas antiinflamasi, antimutagenik dan antioksidan yang dimiliki dapat memacu apoptosis dan menekan karsinogenesis yang di picu oleh bahan kimia (Xu et al., 2007). Penelitian lebih lanjut dalam kaitannyanya dengan efek sitotoksik menunjukkan bahwa senyawa dengan substituen fluoro ini bersifat sitotoksik pada sel HeLa, sel Raji dan sel T47D, dan efek sitotoksis tertinggi pada sel HeLa (Arty, 2010 dan Arianingrum et al., 2011).
Invensi ini menggunakan senyawa derivat kalkon bersubstituen fluoro, yaitu 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksi-fenil)-2-propen-1-on baik tunggal dan kombinasinya dengan agen ko-kemoterapi doksorubisin sebagai antikanker pada sel kanker HeLa. Pengujian sebagai antikanker dilakukan dengan uji sitotoksik menggunakan MTT {3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida}. Perhitungan sitotoksisitas kombinasi digunakan Combination Index (CI) (Reynols and Maurer,2005).
O HO H 3C F CH3O
51
Ringkasan Invensi
Penggunaan senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on sebagai antikanker baik secara tunggal maupun kombinasinya dengan doksorubisin ini dilakukan untuk menghasilkan dosis yang efektif dalam mematikan sel kanker leher rahim HeLa. Penggunaan kombinasi senyawa ini dengan doksorubisin lebih baik bila dibandingkan penggunaannya secara tunggal. Penggunaan senyawa ini dalam treatment meliputi tahapan berikut :
a. Preparasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin (produk Ebewe) untuk uji aktivitas sitotoksik dimana
senyawa tersebut dilarutkan dalam DMSO
(Dimetilsulfoksida).
b. Pengujian aktivitas sitotoksik senyawa baik tunggal dan kombinasinya dengan doksorubisin terhadap sel HeLa (ATCC) menggunakan metode MTT dan perhitungan kombinasi dosis efektif menggunakan Combination Index (CI) (Reynols and Maurer,2005).
Uraian Lengkap Invensi
a. Preparasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on
Senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on dilarutkan dalam pelarut DMSO hingga konsentrasi 100.000 mikromolar sebagai larutan induk. Selanjutnya dibuat variasi konsentrasi 6,25; 12,5; 25; 50; 75 dan 100 mikromolar dengan menggunakan media kultur (MK). Media kultur yang digunakan dibuat dari: (1) Penisilin-streptomisin (Penstrep) 2%. (2) Fetal Bovine
52
Serum (FBS) 10%, dan (3) Fungizon 0,5% dilarutkan hingga 100 ml dengan medium Rosewell Park Memorial Institut (RPMI) 1640 (GIBCO BRL) yang dibuat dengan melarutkan 10,4 g RPMI ditambah NaHCO3 2,2 g; Hepes 2 g dilarutkan dengan akuabides steril dan dikondisikan pada pH 7,2 – 7,4, ditambahkan akuades hingga volume akhir 1 liter. Selanjutnya disterilisasi dengan filter 0,2 mikron.
Senyawa doksorubisin dilarutkan dengan media kultur yang sama dengan variasi konsentrasi 0,03125; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2,5; dan 5 mikromolar. Variasi konsentrasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on yang digunakan untuk kombinasi sebesar : 4,25; 8,5; 12,75; dan 17 mikromolar, sedangkan konsentrasi doksorubisin sebesar : 0,125; 0,25; 0,375; dan 0,5 mikromolar.
b. Uji aktivitas sebagai antikanker pada sel kanker leher rahim
Sel dengan konsentrasi 1 x 104 sel/sumuran didistribusikan ke dalam plate 96 sumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk beradaptasi dan menempel di sumuran. Keesokannya media diambil kemudian ditambahkan 100 μl media kultur yang
mengandung DMSO 0,2% (kontrol) atau sampel, inkubasi selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang mengandung sampel dibuang, dicuci dengan 100 mikroliter PBS (Phospate Buffer Saline). Kemudian ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 100 mikroliter media kultur yang mengandung MTT
53
5 mg/ml, inkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Setelah 4 jam, media yang mengandung MTT dibuang, kemudian ditambahkan larutan SDS untuk melarutkan kristal formazan. Digoyang di atas shaker selama 10 menit kemudian dibaca dengan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm.
Data yang diperoleh pembacaan ELISA reader berupa
absorbansi masing-masing sumuran dikonversi ke dalam persen viabilitas sel. Persentase viabilitas sel dihitung
menggunakan rumus:
Absorbansi sel dengan perlakuan-absorbansi kontrol media X 100%
Absorbansi kontrol sel – absorbansi kontrol media Data yang berupa viabilitas sel kemudian dianalisis dengan program probit Statistic Product and Service Solution (SPSS) 16.0 for windows untuk memperoleh nilai IC50. Nilai IC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan penghambatan pertumbuhan 50% dari populasi sel sehingga dapat diketahui potensi sitotoksisitasnya (Doyle and Griffiths, 2000). Sitotoksik kombinasi ditetapkan dengan menghitung indeks interaksi antara doksorubisin dengan senyawa
4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on menggunakan persamaan :
54
D1 dan D2 adalah konsentrasi sampel yang digunakan dalam perlakuan kombinasi. (Dx)1 dan (Dx)2 adalah konsentrasi tunggal yang dapat menghasilkan efek sebesar yang
ditimbulkan perlakuan kombinasi (Reynols and Maurer,2005). Angka CI yang diperoleh diinterpretasikan sebagaimana Tabel 1.
Tabel 1. Interpretasi Nilai Indeks Kombinasi (CI)
Nilai CI Interpretasi
< 0,1 sinergi sangat kuat 0,1 - 0,3 sinergis kuat 0,3 - 0,7 sinergis 0,7 - 0,9 sinergis ringan-sedang 0,9 - 1,1 mendekati aditif 1,1 - 1,45 antagonis ringan-sedang 1,45 - 3,3 antagonis
> 3,3 antagonis kuat-sangat kuat (Reynols and Maurer,2005)
Potensi ketoksikan senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel HeLa disajikan pada Gambar 3, yaitu memiliki nilai IC50 sebesar 34 mikromolar yang berarti sangat aktif. Sedangkan potensi ketoksikan doksorubisin disajikan pada Gambar 4, memiliki nilai IC50 sebesar
55
Gambar 3. Hubungan konsentrasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan % viabilitas sel HeLa.
Gambar 4. Hubungan konsentrasi doksorubisin dengan % viabilitas sel HeLa.
IC50 = 34 M
56
Uji sitotoksik kombinasi doksorubisin dan senyawa 1- (4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel HeLa pada konsentrasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 4,25; 8,5; 12,75; dan 17 mikromolar, sedangkan konsentrasi doksorubisin sebesar 0,125; 0,25; 0,375; dan 0,5 mikromolar. Kombinasi kedua senyawa ini mampu menurunkan viabilitas sel lebih rendah daripada penggunaan senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on maupun doksorubisin secara tunggal sebagaimana ditunjukkan pada Tabel 2 .
Tabel 2. Persen viabilitas sel perlakuan kombinasi senyawa
1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on dan doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi.
Viabilitas sel (%) pada variasi konsentrasi: 1-(4”-fluoro-fenil)- 3-(4’-hidroksi-3’- metoksi-fenil)-2-propen-1-on (mikromolar) Doksorubisin (mikromolar) 0 0,125 0,25 0,375 0,5 0 100 49,98 49,41 46,64 43,33 4,25 83,97 48,23 44,82 44,63 38,97 8,5 78,66 46,11 43,30 41,28 37,64 12,75 66,46 39,42 38,93 35,17 35,55 17 63,27 39,16 30,92 29,81 26,40
Berdasarkan perhitungan nilai CI (Tabel 3), terlihat bahwa pada kombinasi senyawa
1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-57
hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan konsentrasi sebesar 4,25; 8,5; 12,75; dan 17 mikromolar, dan konsentrasi doksorubisin sebesar 0,125; 0,25; 0,375; dan 0,5 mikromolar memberikan interprestasi sinergi kuat, karena memiliki nilai CI antara 0,1-0,3. Namun pada kombinasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan konsentrasi sebesar 17 mikromolar dan konsentrasi doksorubisin sebesar 0,125 mikromolar memiliki nilai CI di atas 0,3, sehingga masuk kategori sinergi. Dari hasil ini membuktikan bahwa senyawa
1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on berpotensi untuk digunakan sebagai agen ko-kemoterapi doksorubisin pada pengobatan kanker leher rahim.
Tabel 3. Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan
kombinasi senyawa
1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksi-fenil)-2-propen-1-on dan
doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi.
Nilai IC50 pada perlakuan kombinasi: 1-(4”-fluoro -fenil)-3-(4’- hidroksi-3’- metoksi-fenil)-2-propen-1-on (mikromolar) Doksorubisin (mikromolar) 0,125 0,25 0,375 0,5 4,25 0,203 0,222 0,279 0,211 8,5 0,284 0,294 0,301 0,265 12,75 0,278 0,304 0,270 0,299 17 0,354 0,256 0,255 0,224
58
Klaim
1. Penggunaan senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on sebagai antikanker pada sel kanker leher rahim HeLa dengan IC50 sebesar 34 mikromolar.
2. Penggunaan kombinasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 17 mikromolar dan doksorubisin sebesar 0,5 mikromolar sebagai antikanker pada sel leher rahim lebih baik daripada penggunaannya secara tunggal.
59 Draf Publikasi
Potensi Senyawa Derivat Kalkon Bersubstituen Fluoro
Sebagai Agen Ko-kemoterapi Doxorubicin Pada Sel Kanker Leher Rahim
Retno Arianingrum, Indyah Sulistyo Arty, dan Sri Atun
1. Abstrak
Dalam upaya meningkatkan efektivitas dan mengurangi resistensi, serta efek samping agen kemoterapi, dewasa ini perkembangan terapi kanker mengarah pada kombinasi agen kemoterapi dengan agen kemopreventif. Kalkon merupakan senyawa golongan flavanoid yang telah diteliti berkhasiat menurunkan proliferasi banyak sel kanker. Tujuan jangka panjang dari penelitian ini adalah mengembangkan potensi senyawa derivat kalkon sebagai agen ko-kemoterapi Doxorubicin pada sel kanker leher rahim HeLa. Target khusus yang ingin dicapai adalah : menginvestigasi aktivitas sitotoksik senyawa derivat kalkon bersubstituen fluoro, Doxorubicin, dan kombinasi keduanya dan pemacuan apoptosis.
Uji sitotoksik secara invitro terhadap sel HeLa dilakukan dengan metode MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5-dipheniltetrazolium bromide] assay. Perubahan morfologi sel juga diamati menggunakan mikroskop fase kontras. Pengamatan apoptosis dengan flowcytometer.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa derivat kalkon bersubstituen fluoro, yaitu 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on bersifat sitotoksik pada sel HeLa dengan IC50 sebesar 34 M, sedangkan nilai dengan IC50 doxorubicin diperoleh sebesar 1 M. Kombinasi senyawa tersebut dengan Doxorubicin di bawah nilai IC50 pada umumnya memberikan efek sinergi kuat dengan viabilitas sel terendah pada konsentrasi kombinasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 17 M dan doxorubicin sebesar 0,5 M. Mekanisme aksi senyawa derivat kalkon bersubstituen fluoro tunggal dan kombinasinya dengan doksorubisin adalah melalui pemacuan apoptosis.
Kata kunci : kalkon, fluoro, Doxorubicin, HeLa, dan resistensi.
2. Pendahuluan
Kanker leher rahim merupakan salah satu kanker penyebab kematian kedua di dunia pada wanita setelah kanker payudara. Berdasarkan sepuluh kanker primer pada wanita di Indonesia, kanker leher rahim menempati posisi pertama (28,66%) (Tjindarbumi dan Mangunkusumo, 2002). Banyaknya faktor resiko yang dapat menyebabkan kanker leher rahim membuat angka kejadiannya sangat tinggi terutama di Negara berkembang seperti Indonesia. Oleh karena itu, pengembangan dan penemuan pengobatan kanker leher rahim perlu terus diupayakan.
Salah satu permasalahan yang sering timbul dalam pengobatan kanker adalah resistensi obat kemoterapi (drug-resistence) (Wong et al., 2006). Salah satu agen kemoterapi kanker yang telah menimbulkan resistensi adalah Doxorubicin. Senyawa golongan antrasiklin ini diberikan pada berbagai jenis kanker. Selain menimbulkan resistensi, Doxorubicin dapat menyebabkan kardiotoksisitas pada penggunaan jangka panjang (Ferreira et al., 2008). Salah satu
60
alternatif untuk mengatasi resistensi adalah kombinasi agen kemoterapi dengan agen kemopreventif sehingga dapat meningkatkan keberhasilan terapi.
Kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) merupakan senyawa yang banyak di teliti sebagai
therapeutic, khususnya sebagai obat antitumor. Hasil penelusuran literatur menyebutkan bahwa
sebagian besar target utama dari senyawa-senyawa kalkon adalah mempengaruhi daur sel (cell
cycle) (Boumendjel, A., Ronox X., and Boutonnat, J., 2009).
Indyah, dkk. (2000), berhasil mensintesis beberapa senyawa derivat kalkon, yaitu mono para-hidroksi kalkon, diantaranya senyawa yang mengandung substituen fuoro, yaitu 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on. Berdasarkan uji aktivitas penghambatan lipid peroksidasi non enzimatis, dan aktivitas penghambatan siklooksigenase, senyawa ini menunjukkan sangat poten sebagai antioksidan. Penelitian lebih lanjut dalam kaitannyanya dengan efek sitotoksik menunjukkan bahwa senyawa dengan substituen fluoro ini bersifat sitotoksik pada sel HeLa, sel Raji dan sel T47D, dan efek sitotoksis tertinggi pada sel HeLa (Indyah, 2009 dan Retno A, dkk., 2010). Sejauh ini penelitian tersebut belum menginvestigasi lebih jauh mengenai mekanisme aksi dan target molekuler dari senyawa tersebut untuk cancer chemoprevention pada cancer cel lines HeLa.
Penelitian-penelitian tersebut menjadi dasar awal pengembangan senyawa derivat kalkon bersubstituen fluoro ini sebagai agen ko-kemoterapi untuk meningkatkan potensi agen kemoterapi Doxorubicin, sehingga diperoleh pengobatan kanker leher rahim yang efektif. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dieksplorasi apakah senyawa ini secara tunggal dan kombinasinya dengan Doxorubicin dapat memberikan efek sitotoksik dan memacu apoptosis 3. Metode Penelitian
a. Lokasi Penelitian
Sintesis dan analisis spektroskopi UV dan IR akan dilakukan di laboratorium Kimia Organik dan Biokimia, Jurdik Kimia FMIPA UNY. Uji aktivitas sebagai sitotoksik, flowcytometri, dan imunositokimia di lakukan di laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada.
b. Rancangan Penelitian
1) Sintesis senyawa derivat kalkon bersubstituen fluoro dengan mereaksikan bromo asetofenon dengan 4-hidroksi-3-metoksi-benzaldehid, melalui reaksi kondensasi aldol silang dalam suasana asam.
2) Uji sitotoksisitas senyawa derivat kalkon bersubstituen fluoro, Doxorubicin dan kombinasi keduanya pada sel HeLa.
3) Pengamatan insidensi apoptosis perlakuan senyawa derivat kalkon bersubstituen fluoro, Doxorubicin, dan kombinasi keduanya pada sel HeLa.
c. Subyek dan Obyek Penelitian
Subyek penelitian ini adalah senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on hasil sintesis. Objek penelitiannya adalah potensinya sebagai agem ko-kemoterapi Doxoribicin pada sel HeLa, meliputi : (1) uji sitotoksik, dan (2) uji aktivitas pemacuan apoptosis. d. Prosedur Kerja
61
Turunan 4-hidroksi-3-metoksi-benzaldehid (26,6 mmol) dan dengan p-fluoroasetofenon (30 mmol) dilarutkan dalam etanol yang dijenuhkan dengan HCl. Tetes demi tetes HCl dimasukkan dalam campuran reaksi bersamaan dengan itu gas N2 juga dialirkan ke dalam campuran reaksi. Pengadukan dilakukan selama 6 jam dan setiap jam di cek dengan KLT. Pengadukan dihentikan ketika noktah produk reaksi nampak dominan. Kemudian campuran reaksi dituangkan ke dalam air es dan di aduk sampai terbentuk kristal. Setelah dibiarkan selama 3 jam campuran reaksi disaring dan kristalnya direkristalisasi menggunakan pelarut yang sesuai. Identifikasi dan elusidasi struktur dilakukan dengan membandingkan data kromatografi lapis tipis (KLT) pada berbagai eluen dengan senyawa yang telah ditemukan sebelumnya, dan menggunakan analisis data spektrum UV-VIS dan IR.
2) Uji Sitotoksisitas
Sel dengan konsentrasi 1 x 104 sel/sumuran didistribusikan ke dalam plate 96 sumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk beradaptasi dan menempel di sumuran. Keesokannya media diambil kemudian ditambahkan 100 μl media kultur yang mengandung DMSO 0,2% (kontrol) atau sampel, inkubasi selama 24 atau 48 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang mengandung sampel dibuang, dicuci dengan 100 ul PBS. Kemudian ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 100 ul media kultur yang mengandung MTT 5 mg/ml, inkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Setelah 4 jam, media yang mengandung MTT dibuang, kemudian ditambahkan larutan SDS untuk melarutkan kristal formazan. Digoyang di atas shaker selama 10 menit kemudian dibaca dengan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Data absorbansi perlakuan tunggal dikonversi ke dalam persen sel. Potensi aplikasi dalam terapi kombinasi dianalisis dengan membandingkan viabilitas sel perlakuan tunggal dengan kombinasi. Data absorbansi perlakuan tunggal dikonversi ke dalam persen sel hidup dan digunakan untuk menghitung IC50. Potensi aplikasi dalam terapi kombinasi dianalisis dengan menggunakan metode indeks kombinasi (combinatorial index method/CI) berdasarkan Chou (Reynolds and Maurer, 2005).
3) Uji Pengamatan Apoptosis dengan Flowcytometer
a) Alat yang digunakan : Flowcytometer, perlengkapan perlindungan diri (sarung tangan steril, jas lab.), plate 6 well, Air Flow Hood (LAF), inkubator CO
2, tissue culture flask/dish, pen marker, mikropipet, tip, rak ampul/tempat eppendorf, tissue, alat-alat gelas, flakon, kamera digital, autoklaf, sentrifus
b) Bahan yang digunakan : Tripsin, media kultur, Phosphat Buffer Saline (PBS) dan Annexin- V-Fluos Staining Kit Roche.
c) Prosedur Penelitian
Sel (kepadatan 5 X 105 sel/sumuran) ditanam dalam plate 6 well sampai 50-60 % konfluen. Setelah itu diinkubasi dengan senyawa uji selama 24 jam. Medium diambil dan dimasukkan dalam tabung sentrifus. Sel di cuci dengan tripsin 0,25% untuk melepas sel dari plate dan dilakukan inkubasi selama 3 menit dalam inkubator CO2. Kemudian ditambahkan media kultur 1 mL. Sel beserta media kultur tersebut dipindahkan juga dalam tabung sentrifus. Selanjutnya sel yang masih tersisa dalam plate dicuci dengan PBS 2X masing-masing sebanyak 1 mL dan PBS ditambahkan dalam tabung sentrifus. Kemudian disentrifus pada 600 g selama 5 menit. Media dibuang dan sel dicuci dengan PBS 1 mL dan disentrifus pada 200 g selama 5 menit. Larutan PBS dibuang dan sel diresuspensi dengan 100 L Annexin-V-Fluos-labelling
62
solution yang terdiri dari (2 L Annexin-V-Fluos, 100 L buffer, dan 2 L propidium iodide ) untuk 1 kali reaksi. Inkubasi selama 10 menit pada ruang gelap dan dianalis dengan
flowcytometer.
4. Hasil Penelitian
a. Sintesis 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on
Identifikasi senyawa hasil sintesis yang dilakukan menggunakan KLT dengan eluen kloroforom : heksana = 2 : 1, dan heksana: metilen klorida = 1:2 menunjukkan hasil satu noda yang berarti bahwa senyawa hasil isolasi tersebut telah murni. Saat dibandingkan dengan senyawa marker, senyawa hasil sintesis memiliki harga Rf (Retardation factor) yang sama dengan senyawa marker, yang berarti bahwa senyawa hasil sintesis tersebut adalah senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on.
Berdasarkan data FT-IR (Tabel 1) diketahui bahwa senyawa hasil sintesis memiliki gugus fungsional yang sama dengan senyawa marker. Hal ini lebih memperkuat bukti bahwa senyawa hasil sintesis yang diperoleh adalah senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on.
Tabel 3. Hasil Analisis FTIR Senyawa Bilangan gelombang (cm
-1
)
Keterangan Gugus Fungsional Marker Hasil Sintesis
1-(4”- fluorofenil)- 3-(4’- hidroksi-3’- metoksifenil)- 2-propen-1-on
1637,67 1636,55 C=O, (gugus karbonil) 3439,30 3495,52 OH str aromatik 1597,16 1585,89 C=C str aromatik 3000-2800 & 1444,77 3000-2800 & 1444,46 alkil 1238,38 1340,73 metil
b. Uji Sitotoksik dengan MTT assay
1) Uji sitotoksik senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on pada sel HeLa
Gambar 3. Hubungan Konsentrasi Senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan % Viabilitas Sel HeLa.
63 2) Uji sitotoksik doxorubicin pada sel HeLa
Gambar 4. Hubungan Konsentrasi Doxorubicin dengan % Viabilitas Sel HeLa.
3) Uji sitotoksik kombinasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on dan doxorubicin pada sel HeLa
Tabel 4. Persen viabilitas sel perlakuan kombinasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on dan doxorubicin pada berbagai variasi konsentrasi.
Viabilitas sel (%) pada variasi knsentrasi : 1-(4”-fluoro-fenil)-3-(4’- hidroksi-3’-metoksi-fenil)-2-propen-1-on (mikromolar) Doxorubicin (mikromolar) 0 0,125 0,25 0,375 0,5 0 100 49,98 49,41 46,64 43,33 4,25 83,97 48,23 44,82 44,63 38,97 8,5 78,66 46,11 43,30 41,28 37,64 12,75 66,46 39,42 38,93 35,17 35,55 17 63,27 39,16 30,92 29,81 26,40
Tabel 5. Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan kombinasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on dan doxorubicin pada berbagai variasi konsentrasi.
Nilai IC50 pada perlakuan kombinasi: 1-(4”-fluoro-fenil)-3-(4’- hidroksi-3’-metoksi-fenil)-2-propen-1-on (mikromolar) Doxorubicin (mikromolar) 0,125 0,25 0,375 0,5 4,25 0,203 0,222 0,279 0,211 8,5 0,284 0,294 0,301 0,265 12,75 0,278 0,304 0,270 0,299 17 0,354 0,256 0,255 0,224 IC50 = 1 M
64
Senyawa-senyawa kalkon dapat memiliki substitusi yang berbeda pada posisi orto dan para. Selain itu kalkon memiliki ikatan rangkap terkonjugasi dan sistem electron- terdelokalisasi yang lengkap pada kedua cincin benzene. Molekul dengan sistem ini umumnya memiliki potensial redoks yang rendah dan mempunyai probabilitas tinggi untuk melakukan transfer elektron (Yadav, et.al., 2012). Senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on mempunyai gugus hidroksil dan fluoro pada posisi para dan metoksi pada posisi meta.
Hasil uji sitotoksik senyawa tunggal 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on pada sel HeLa menunjukkan senyawa ini bersifat toksik. Berdasarkan hasil pengamatan menunjukkan bahwa terdapat hubungan langsung antara perubahan konsentrasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan tingkat kematian sel HeLa. Semakin tinggi konsentrasi senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on, semakin rendah viabilitas sel HeLa atau semakin banyak jumlah sel HeLa yang mengalami kematian. Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh nilai IC50 dari senyawa ini terhadap sel HeLa sebesar 34 M yang termasuk kategori aktif. Adanya gugus OH dan gugus fluoro yang terdapat pada senyawa ini diperkirakan memberikan kontribusi pada sifat toksisitas senyawa terhadap sel HeLa. Pada beberapa hasil penelitian tentang aktivitas senyawa derivat kalkon, adanya substitusi gugus metoksi pada cincin A dan substitusi fluoro, kloro, bromo dan cincin B mampu meningkatkan penghambatan aktivitas NF-B, suatu faktor transkripsi yang berperan dalam pengembangan dan progresi kanker (Folmer, et.al., 2006, dan Kim, et. al., 2007). Selain itu adanya gugus karbonil tak jenuh -unsaturated
carbonylyang terdapat pada kalkon juga memberikan kontribusi pada aktivitas sitotoksik pada
sel HeLa. Menurut Srinivasan, et al, 2009 adanya ikatan tak jenuh yang bersifat sangat elektrofilik dapat menimbulkan radikal thiyl yang mengarah ke pengurangan alkena melalui adisi Michaelis kovalen dari nukleofil, seperti SH dari cystin dari DNA, yang mengikat NF-B.
Perlakuan senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on juga menunjukkan perubahan morfologi sel yang signifikan seiring meningkatnya konsentrasi. Perubahan morfologi sel tersebut menyebabkan menurunnya viabilitas sel HeLa.
Bila dibandingkan dengan doxorubicin, senyawa 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on memiliki aktivitas lebih rendah. Doxorubicin merupakan agen kemoterapi yang banyak digunakan dalam terapi berbagai kanker epitel. Doxorubicin dapat berinterkelasi dengan DNA sehingga fungsi DNA sebagai template dan pertukaran sister
chromatid terganggu pada pita DNA terputus. Obat ini juga dapat bereaksi dengan sitokrom