KELAPA DAN ASAL KAKAO
P. palmivora capsici Isolat
palmivora Co5 (A1) Co2 (A2) N2 (A1) N4 (A2) Tipe kawin Anteridium Asal kelapa P12KpMpgSU - + - + A1 amphigynous P13KpMpgSU + - + - A2 amphigynous P34KpMrwSU + - + - A2 amphigynous P35KpMrwSU - + - + A1 amphigynous P41KpHbGrto + - + - A2 amphigynous P42KpHbGrto + - + - A2 amphigynous P43KpKdGrto - + - + A1 amphigynous P44KpByASU + - + - A2 amphigynous P46KpByASU + - + - A2 amphigynous P51KpSkjtiJT - + - + A1 amphigynous P52KpTuSU - + - + A1 amphigynous P53KpTuSU - + - + A1 amphigynous P58KpSdkSU - + - + A1 amphigynous Asal kakao P61KoSLorJT - + - + A1 amphigynous P02KoKlTgJT + - + - A2 amphigynous P04KoTrbslJT + - + - A2 amphigynous P05KoKlwgJT + - + - A2 amphigynous P06KoKlwgJT - - - - P09KoKlkptJT + - + - A2 amphigynous P19KoPngklSU - + - + A1 amphigynous P22KoMrwSU - - - - P40KoMpySU - + - + A1 amphigynous
Keterangan : (+) = ada oospora ; (-) = tidak ada oospora
Karakter molekuler isolat P. palmivora asal kelapa dan asal kakao
A
B
Amplifikasi ruas ITS-DNA.
Diantara 22 isolat P. palmivora asal kelapa dan asal kakao yang berhasil diekstraksi DNAnya, hanya 4 isolat yang di amplifikasi ruas DNA dengan teknik PCR menggunakan primer ITS 4R dan ITS 5F. Keempat isolat tersebut adalah dua isolat P. palmivora asal kelapa (P44KpByASU dan P53KpTuSU) dan dua isolat P. palmivora asal kakao (P22KoMrwSU dan P40KoMpySU). Hasil amplifikasi DNA keempat isolat P. palmivora tersebut menghasilkan satu pita DNA dengan ukuran 900 bp (Gambar 23). Pita DNA dengan ukuran 900 bp merupakan spesies P. palmivora (Umaya 2004). Pita DNA dari empat isolat P. palmivora tersebut dengan ukuran 900 bp selanjutnya dinalisis runutan DNAnya dengan menggunakan mesin sekuensing ABI-Prism 3100 Avant Genetic Analyser.
Gambar 23 Hasil amplifikasi ruas ITS-DNA beberapa isolat P. palmivora menggunakan sepasang primer ITS 4F dan ITS 5R. Lajur 1 Penanda DNA 1 kb DNA ladder (Invitrogen), lajur 2 isolat asal kakao (P22KoMrwSU) , lajur 3 isolat asal kakao (P40KoMpySU), lajur 4 isolat asal kelapa (P44KpByASU) dan lajur 5 isolat asal kelapa (P53KpTuSU)
Perunutan ITS-DNA P. palmivora
Perunutan DNA dilakukan terhadap empat fragmen DNA hasil amplifikasi PCR dari isolat P. palmivora asal kelapa (P44KpByASU dan P53KpTuSU) dan isolat asal kakao (P22KoMrwSU dan P40KoMpySU). Dari empat isolat P. palmivora yang dianalisis runutan DNAnya hanya tiga isolat P. palmivora yang menghasilkan runutan DNA yaitu isolat P22KoMrwSU, P40KoMpySU, dan
900 bp
1 2 3 4 5
1000 850
P53KpTuSU sedangkan hasil runutan DNA isolat P44KpByASU tidak teramati jenis nukleotidanya. Dari keempat isolat P. palmivora tersebut hanya data isolat P22KoMrwSU, P40KoMpySU, dan P53KpTuSU yang selanjutnya digunakan sebagai bahan analisis kesamaan genetiknya.
Isolat P. palmivora asal kelapa dan asal kakao ini dianalisis kemiripan genetiknya dengan P. palmivora dari daerah geografi lainnya berdasarkan informasi perunutan DNA yang tersedia dalam GeneBank melalui program BLAST dari NCBI (www.ncbi.nlm.nih). Hasil analisis tiga isolat P. palmivora asal kelapa dan asal kakao dengan menggunakan analisis Clustal.W nampak beberapa bagian yang diapit oleh ruas ITS4R dan ITS5F memiliki homologi (Gambar 24).
KoGhana1 ----AAGGATCATTACC--ACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAAAACTTAGT 54 KoPuertoRico ---TTACC--ACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAAAACTTAGT 46 KoCostaRica ---CCGTATCAAAACTTAGT 17 KoTaiwan1 ----AAGGATCATTACC--ACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAAAACTTAGT 54 KoTaiwan2 ----AAGGATCATTACC--ACACCTAAAAACTTTCCCCGTGAACCGTATCAAAACTTAGT 54 KoGhana2 ----AAGGATCATTACC--ACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCTTTAGT 54 P53KpTuSU --TGTTGGCCTGATATCTGGTGCCTTTGAGAGGCGCGCGGAAGCTACACAAGTTCCCAAA 58 P22KoMrwSU CTGGGTTAGTCTATGACACACACCGAACGATCCTCGACGGTGGGTCCACGTTGTGTGATA 60 P40KoMpySU ---TGCTGCTCTGTGCT-CTCGTCTCATCATCGTCCAGAACAAAAAAAGCATGCGAAATA 56 * * KoGhana1 --TGGGG--GTC---TCTTTC-GGCGGCGGCTGCTGGCTTCCATTGCTG---GCGG 99 KoPuertoRico --TGGGG--GTC---TCTTTC-GGCGGCGGCTGCTGGCTTC-ATTGCTG---GCGG 90 KoCostaRica --TGGGG--GTC---TCTTTC-GGCGGCGGCTGCTGGCTTC-ATTGCTG---GCGG 61 KoTaiwan1 --TGGGG--GTC---TCTTTC-GGCGGCGGCTGCTGGCTTC-ATTGCTG---GCGG 98 KoTaiwan2 --TGGGG--GTC---TCTTTC-GGCGGCGGCTGCTGGCTTC-ATTGCTG---GCGG 98 KoGhana2 --TGGGG--GTC---TTTTTC-GGCGGCGGCTGCTGGTTTA-ATTACTG---GCGG 98 P53KpTuSU --TGGGGCGACC---CTCGAC-AGCCGAAGCCGCCACTCTACTTCGCAACACC---AAAG 109 P22KoMrwSU --CTGCATCGTC---ATCGAT-CAGCACAGCTCTACGATCACGCATCAGCATGG--ACTG 112 P40KoMpySU GATAGCGATGTCTCGATAGATGCATCACGTAGCCACGATCATACAATCGATCTGCATCCG 116 * * * KoGhana1 CTGCTGTTGGGA---GAGC-TCTATC-ATGGCGAGCGTTTGGGCTT-CGGTCTGA---AC 150 KoPuertoRico CTGCTGTTGGGA---GAGC-TCTATC-ATGGCGAGCGTTTGGGCTT-CGGTCTGA---AC 141 KoCostaRica CTGCTGTTGGGA---GAGC-TCTATC-ATGGCGAGCGTTTGGGCTT-CGGTCTGA---AC 112 KoTaiwan1 CTGCTGTTGGGA---GAGC-TCTATC-ATGGCGAGCGTTTGGGCTT-CGGTCTGA---AC 149 KoTaiwan2 CTGCTGTTGGGA---GAGC-TCTATCCATGGCGAGCGTTTGGGCTT-CGGTCTGA---AC 150 KoGhana2 TTGCTGCTGGGA---GAGC-CCTATC-ATGGCGAGCGTTTGGGCTT-CGGTCTGA---AC 149 P53KpTuSU CCAATTCAAAAACC-AAGC-TCTCATAGCTACGGGTCACCAATCATACCACCCCA---GC 164 P22KoMrwSU CGCTCGCTATGATC-GAGTATCGACCTACGCGCTCTGCGCAAGCTCGCCGCGCAAC--GC 169 P40KoMpySU CGCCTGCTATGTGCGGAGTCATGTGCCATGCGTCTGTCTCAGACTC-CAGCGACACGCGC 175 ** * * * * Gambar 24 Perbandingan hasil perunutan DNA isolat P. palmivora asal kelapa
(P53KpTuSU) dan dua isolat P.palmivora asal kakao (P22KoMrwSU, dan P40KoMpySU ) dari Indonesia dan P. palmivora dari GeneBank.
*) menunjukkan nukleotida yang sama
KoGhana1 T-AGTAGCTTTTTTAAACCCATTCTT---TATAACTGATTATACTG-TAGGGACGAA 202 KoPuertoRico T-AGTAGCTTTTTTAAACCCATTCTT---TATAACTGATTATACTG-TAGGGACGAA 193 KoCostaRica T-AGTAGCTTTTTTAAACCCATTCTT---TATAACTGATTATACTG-TAGGGACGAA 164 KoTaiwan1 T-AGTAGCTTTTTTAAACCCATTCTT---TATAACTGATTATACTG-TAGGGACGAA 201 KoTaiwan2 T-AGTAGCTTTTTTAAACCCATTCTT---TATAACTGATTATACTG-TAGGGACGAA 202
KoGhana2 T-AGTAGCTTTTTTAAACCCATTCAT---TATTACTGATTATACTG-TGGGGACGAA 201 P53KpTuSU TGAGGAAATATTCAATAAGCGTCTGTGCAGC-CGAAGCCAACCATACCG-C-GAATCGAA 221 P22KoMrwSU TCACGCCGCTCACTGAGCTCGATCATCGTTCGCGCACACGCGGGTCCCGACCCGATCACG 229 P40KoMpySU CGCCGCACTCGATCCGTCTCTGTCTCGCACATCGCTTTCGGCCGCCTCGTCTCGACATCG 235 * * KoGhana1 AGTCTCTGCTTTTA---ACTAGATAG-CAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGC 255 KoPuertoRico AGTCTCTGCTTTTA---ACTAGATAG-CAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGC 246 KoCostaRica AGTCTCTGCTTTTA---ACTAGATAG-CAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGC 217 KoTaiwan1 AGTCTCTGCTTTTA---ACTAGATAG-CAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGC 254 KoTaiwan2 AGTCTCTGCTTTTA---ACTAGATAG-CAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGC 255 KoGhana2 AGTCTCTGCTTTTA---ACTAGATAG-CAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGC 254 P53KpTuSU CACTCCTCCATTAACGCCACACCAGACAAACTGGGCGCCAGACTGGGTACGCAAGCGGCC 281 P22KoMrwSU GATTCGGATAGCGATGCGTCACGACAGACTTACATCACTACAGCAG-TGCGCGCTCAACA 288 P40KoMpySU GGTGCCGAGACTGT---CTTCCCAT-CAGTCGACACGAGTCGCTCTACCCGCCTTG 287 * * * * * * * KoGhana1 ACATCGATGAAGAACGCTGC-GAACTGCGATACGT--AATGCGAAT--TG----CAGGA- 305 KoPuertoRico ACATCGATGAAGAACGCTGC-GAACTGCGATACGT--AATGCGAAT--TG----CAGGA- 296 KoCostaRica ACATCGATGAAGAACGCTGC-GAACTGCGATACGT--AATGCGAAT--TG----CAGGA- 267 KoTaiwan1 ACATCGATGAAGAACGCTGC-GAACTGCGATACGT--AATGCGAAT--TG----CAGGA- 304 KoTaiwan2 ACATCGATGAAGAACGCTGC-GAACTGCGATACGT--AATGCGAAT--TG----CAGGA- 305 KoGhana2 ACCTCGATGAAGAACGCTGC-GAACTGCGATACGT--AATGCGAAT--TG----CAGGA- 304 P53KpTuSU TCCACAATCAGCAACGCCAC-GCTTTTGGAGAAAA--GAGAAGAAC--AGTT--CAGTAC 334 P22KoMrwSU ACATTAGTAGCCACCTCTGC-CCGCTGTGATATAACGAATCTTTAC--TAGCTGCAGACA 345 P40KoMpySU TCTTGTACGTCCAGCGTCGCGCCGGTGAGAGACAT---ATCGTTATCTTATATCTATACT 344 * * * * * ** * * * * KoGhana1 --TTCAGTGAGTCATCGAA-ATTTTGAACGCATATT-GCA---CTTCCGGGTTAGTC 355 KoPuertoRico --TTCAGTGAGTCATCGAA-ATTTTGAACGCATATT-GCA---CTTCCGGGTTAGTC 346 KoCostaRica --TTCAGTGAGTCATCGAA-ATTTTGAACGCATATT-GCA---CTTCCGGGTTAGTC 317 KoTaiwan1 --TTCAGTGAGTCATCGAA-ATTTTGAACGCATATT-GCA---CTTCCGGGTTAGTC 354 KoTaiwan2 --TTCAGTGAGTCATCGAA-ATTTTGAACGCATATT-GCA---CTTCCGGGTTAGTC 355 KoGhana2 --TTCAGTGAGTCATCGAA-ATTTTGAACGCATATT-GCA---CTTCCGGGTTAGTC 354 P53KpTuSU ATTTCAAAGGACTCTCAGCCGATCCGAAGACCAGCC-GCAAGAGACTTTACATCTGGGAC 393 P22KoMrwSU GTTGTGTGGCATGCACGAGACGCGTATCCGCGAACTCGCATG----TATCTGCGCGAGTC 401 P40KoMpySU ACCACAATGTGTGTGTCTAGAGCCCGCGAAAGAGCCCACAC---CCCCCATAT-ATCC 398 * ** * KoGhana1 CTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGTTTTCTTTCCTTC--- 409 KoPuertoRico CTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGTTTTCTT-CCTTC--- 399 KoCostaRica CTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGTTTTCTT-CCTTC--- 370 KoTaiwan1 CTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGTTTTCTT-CCTTC--- 407 KoTaiwan2 CTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAGACTTGGTTTTCTT-CCTTC--- 408 KoGhana2 CTGGAAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGGTTTCTT-CCTTC--- 407 P53KpTuSU ATCCCCCCCCGACTACACGGAAGGAAGAAAACCAAGTTTGAGGTGCGGACACTGATACAG 453 P22KoMrwSU GTGCAGACAAGCTCGCTGCGCTCTCTCGAGTGTGTGAGCGTGCTGAGCACGGCGAGCT-- 459 P40KoMpySU GCGCGCGAATATTCGTAACCCCCTCTCTCTCTCACATTTATATCGCGCCCACCAGAGCAG 458 * KoGhana1 -CGTGTAGTCGGTGGT---GGATGTGC-CAGATGTGAAGTGTCTTGCGGCTGGTC--- 459 KoPuertoRico -CGTGTAGTCGGTGGT---GGATGTGC-CAGATGTGAAGTGTCTTGCGGCTGGTC--- 449 KoCostaRica -CGTGTAGTCGGTGGT---GGATGTGC-CAGATGTGAAGTGTCTTGCGGCTGGTC--- 420 KoTaiwan1 -CGTGTAGTCGGTGGT---GGATGTGC-CAGATGTGAAGTGTCTTGCGGCTGGTC--- 457 KoTaiwan2 -CGTGTAGTCGGTGGT---GGATGTGC-CAGATGTGAAGTGTCTTGCGGCTGGTC--- 458 KoGhana2 -CGTGTAGTCGGTGGA---GGATATGC-CAGATGTGAGGTGTCTTGCGGCTGGCC--- 457 P53KpTuSU GCGTACTCCCAGGAGTAACCCGGAAGAGC-AATATGCGTTCAAAATTTCGATGACTC--- 509 P22KoMrwSU -CGCACCGTGTGTGTGCGTACACACGCACGCGAGCGTGCGCCTATCCGCTCGCACGC--- 515 P40KoMpySU AGAACCAAAGTGTGTG---TCGCGTCC-CAGAAGTGTGGCGTATCGCGCCAGAGCAGA 512 * * * * * * KoGhana1 TTCGGATCG-GCTGTGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCC-AAA 517 KoPuertoRico TTCGGATCG-GCTGTGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCC-AAA 507 KoCostaRica TTCGGATCG-GCTGTGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCC-AAA 478 KoTaiwan1 TTCGGATCG-GCTGTGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCC-AAA 515 KoTaiwan2 TTCGGATCG-GCTGTGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCC-AAA 516 KoGhana2 TTCGGGTCG-GCTGTGAGTCCCTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCG-AAA 515 P53KpTuSU ACTGAATCCTGCAATTCGCATTACGTATCGCAGTTCGCAGCGTTCTTCATCGATGT-GCG 568 P22KoMrwSU GCTCGCTCCGTACGCGACTATACGTGCACGTGCGCATCCGCCTCCGCTCGTGCTCTTGTG 575 P40KoMpySU GCCCTCTCC-CCCACAAATATACGTGCACA-ACGCGCCCACACGCGCCCTGTCTTT-GTG 569 ** * * Gambar 24 (lanjutan) KoGhana1 AGCGTGGCGTTGCTGATTGTGGAGGCTGCTTGCGTA-GCCAGTCTGGCGACCAGTTTGTC 576 KoPuertoRico AGCGTGGCGTTGCTGATTGTGGAGGCTGCTTGCGTA-GCCAGTCTGGCGACCAGTTTGTC 566 KoCostaRica AGCGTGGCGTTGCTGATTGTGGAGGCTGCTTGCGTA-GCCAGTCTGGCGACCAGTTTGTC 537 KoTaiwan1 AGCGTGGCGTTGCTGATTGTGGAGGCTGCTTGCGTA-GCAAGTCTGGCGACCAGTTTGTC 574 KoTaiwan2 AGCGTGGCGTTGCTGATTGTGGAGGCTGCTTGCGTA-GCCAGTCTGACGACCAGTTTGTC 575
KoGhana2 AGTAAAGC-TTGCTTGTTGTGGAGGCTGCTTGTGTA-ACCAGTC-GGCGACTAGTTTGTC 572 P53KpTuSU AGCCTAGACAT-CCACTGCTGAAAGTTGCTATCTAG-TTAAAAGCAGAGACTTTCGTCCC 626 P22KoMrwSU GGTGACGACCCACATGTGAGGACACGTCTATGCATGCGTTGCCATGGTTATCAGTTTGTG 635 P40KoMpySU GGAGAGCA-CCACAGAGAGAGATAGAGTATCTCTAGTTTGTACATGTATACACATTTTCA 628 * * * * * KoGhana1 TGCT---GTGGCGTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAA- 632 KoPuertoRico TGCT---GTGGCGTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAA- 622 KoCostaRica TGCT---GTGGCGTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAA- 593 KoTaiwan1 TGCT---GTGGCGTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAA- 630 KoTaiwan2 TGCT---GTGGCGTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAA- 631 KoGhana2 TGCT---GTGGCGTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGATTGGCTTCGGCTGAA- 628 P53KpTuSU TACA---GTATAATCAGTTATAAAGAATGGGTTTAAAAAAGCTACTAGTTCAGACCGAAG 683 P22KoMrwSU CACGA-GGTAGGACCCTTCACACGCGCACGTAATTACGCAGCATATGCGCCCGCTCGCGC 694 P40KoMpySU CAGAGAGGGAGCGTCTCTCTACAGCTCGCGCATGTACGCGAAAGAGATACCAGCGCCCG- 687 * * * KoGhana1 --CAGACGCTTATTG----AATATTTCTTCAGCTGTGGTGGT---ATGAT-TGGTGAA 680 KoPuertoRico --CAGACGCTTATTG----AATATTTCTTCAGCTGTGGTGGT---ATGAT-TGGTGAA 670 KoCostaRica --CAGACGCTTATTG----AATATTTCTTCAGCTGTGGTGGT---ATGAT-TGGTGAA 641 KoTaiwan1 --CAGACGCTTATTG----AATATTTCTTCAGCTGTGGTGGT---ATGAT-TGGTGAA 678 KoTaiwan2 --CAGACGCTTATAG----AATATTTCTTCAGCTGTGGTGGT---ATGAT-TGGTGAA 679 KoGhana2 --CAGAAGCTTATTG----GGCGTTTTTCCTGCTATGGCGGT---ATGAAGTAGTGAA 677 P53KpTuSU CCCAAACGCTCGCCATGATAGAGCTCTCCCAACAGCAGCCGCCAGCAATGAAGCCAGCAG 743 P22KoMrwSU CCTGGACGAGATGCT---ATCATCCTTCGTTNCCAGTCACTTTGTTTGGG--GGAGCA 747 P40KoMpySU --CGCACAAGAGAAC---ACCATCTTTCTATACACATT---TGTGTGGGCGCA 732 * * * ** KoGhana1 CCGTAGCTATGTGAG---CTTGGCT---TTTGAATTGGCTTTGCT---GTTGCGAA 727 KoPuertoRico CCGTAGCTATGTGAG---CTTGGCT---TTTGAATTGGCTTTGCT---GTTGCGAA 717 KoCostaRica CCGTAGCTATGTGAG---CTTGGCT---TTTGAATTGGCTTTGCT---GTTGCGAA 688 KoTaiwan1 CCGTAGCTATGTGAG---CTTGGCT---TTTGAATTGGCTTTGCT---GTTGCGAA 725 KoTaiwan2 CCGTAGCTATGTGAG---CTTGGCT---TTTGAATTGGCTTTGCT---GTTGCGAA 726 KoGhana2 CCGTAGTTATGTGGG---CTTGGCT---TTTGAATGTGCTC-GCT---GT-GCGAA 722 P53KpTuSU CCGCCGCCGAAAGAGACCCCCAACTAAGTTTTGATACGGTTCACGTGGAAA-GTTTTTAG 802 P22KoMrwSU CCACAACTTTGTCGCACCTCCAACGCTACCGCNATACCTCGTCCGCCGCGGCGGGACGAG 807 P40KoMpySU C-ACATTTCCCCCCCCACACCCGCGA-GCCCTATCACTACGCGGGAGAGAGGAGAGAGAA 790 * * * KoGhana1 GTAGAGTGGCGGC--TTCGGCTGTCGAGGGTCGATCCA--TTTGGGAACTTGTGTATG-- 781 KoPuertoRico GTAGAGTGGCGGC--TTCGGCTGTCGAGGGTCGATCCA--TTTGGGAACTTGTGTATG-- 771 KoCostaRica GTAGAGTGGCGGC--TTCGGCTGTCGAGGGTCGATCCA--TTTGGGAACTTGTGTATG-- 742 KoTaiwan1 GTAGAGTGGCGGC--TTCGGCTGTCGAGGGTCGATCCA--TTTGGGAACTTGTGTATG-- 779 KoTaiwan2 GTAGAGTGGCGGC--TTCGGCTGTCGAGGGTCGATCCA--TTTGGGAACTTGTGTATG-- 780 KoGhana2 GTAGAGTGGCGAC--TTTGGGTGTCGAGGGTCGATCCA--TTTGGGAAATTGTGTGTA-- 776 P53KpTuSU GTGTGGTAATGACC-TTCCGCAGTGTGATTTTGAACGC--GTATTGCACTGCCGGGTGA- 858 P22KoMrwSU GTGGGGACACGAAACAACTCCCGTCTCAGCTTCGTCTT--GTTATGTGACTTTGCCTGAT 865 P40KoMpySU AAATAATCACTCAATGTGTGTTGTGTGAGATGTGTTATACGCTGGGAAACACCCCCTGTG 850 ** * * * KoGhana1 ---CTTCGGCATGCAT---CTCAATTG---GACCTGATATCAGGCAAGAT-TACC 826 KoPuertoRico ---CTTCGGCATGCAT---CTCAATTG---GACC--- 796 KoCostaRica ---CTTCGGCATGCAT---CTCAA--- 760 KoTaiwan1 ---CTTCGGCATGCAT---CTCAATTG---GACCTGATATCAGGCAAGAT-TACC 824 KoTaiwan2 ---CTTCGGCATGCAT---CTCAATTG---GACCTGATATCAGGCAAGAT-TACC 825 KoGhana2 ---CTTCGGTATGCAT---CTCAATTG---GACCTGATATCAGGCAAGGT-TACC 821 P53KpTuSU -GTCCTGGGAGTATGC---CTGTATCACT---GTCCGTACATCAGACTTGGT-TTTC 907 P22KoMrwSU CGGGCCGACTACGATA---TTTTATTAAT---GCCGGGCGGGTCCACTTCAT-TGCT 915 P40KoMpySU -ATATATACTACGAGGGGCCGCTATCACTCTTCCCCCCCCGAGGGGAAACCTAATATCCT 909 * Gambar 24 (lanjutan) KoGhana1 CGCTGAACTTAA--- 838 KoPuertoRico --- KoCostaRica --- KoTaiwan1 CGCTGAACTTAA--- 836 KoTaiwan2 CGCTGAACTTAA--- 837 KoGhana2 CGCTGAACTTAA--- 833 P53KpTuSU TTCCTTCCGTGAAGTCAGT-GGTGGAT--- 933
P22KoMrwSU CCCCGCGCCCGGGAGGCAT-CATCCCACACCCCGCCGCG--- 953 P40KoMpySU CCCCGCGGGGAAGAGATGTGTGCTCCAGAATTATATGTGCCGCGGTTTTTCATCAAAAAA 969 KoGhana1 --- KoPuertoRico --- KoCostaRica --- KoTaiwan1 --- KoTaiwan2 --- KoGhana2 --- P53KpTuSU --- P22KoMrwSU --- P40KoMpySU AAATTTTTTCTGGCGGAAATGTGGAAACCTCATCCCCACCT 1010 Gambar 24 (lanjutan)
Keragaman genetik P. palmivora berdasarkan ruas ITS-DNA
Analisis kemiripan genetik hasil perunutan DNA ruas ITS DNA menggunakan analisis ClustalW 1.83 disajikan dalam Gambar 25.
Gambar 25 Dendrogram isolat-isolat P. palmivora asal Indonesia (P53KpTuSU, P22KoMrwSU, P40KoMpySU) terhadap isolat P. palmivora dari lokasi geografi lain yang ada di GeneBank (Ghana, Taiwan, Puerto Rico, dan Costa Rica) berdasarkan analisis urutan ITS-DNA menggunakan program ClustalW 1.83.
Hasil analisis menunjukan isolat-isolat tersebut terbagi dalam tiga kelompok yaitu kelompok pertama terdiri dari isolat P. palmivora asal Indonesia yang mempunyai tingkat kemiripan genetik 67%, dan kelompok kedua terdiri dari isolat asal Ghana2, dan kelompok ketiga yang mempunyai tingkat kemiripan genetiknya 99.8%. terdiri dari isolat P. palmivora asal Ghana1 , Taiwan 1, Taiwan 2, Puerto Rico dan Costa Rica.
Indonesia GeneBank 0.5
1.0 0
Isolat P. palmivora asal Indonesia (Jawa Timur dan Sulawesi Utara) (P53KpTuSU, P22KoMrwSU, P40KoMpySU) tidak berada dalam kelompok yang sama dengan isolat P. palmivora asal Taiwan, Ghana, Puerto Rico dan Costa Rica. Sedangkan hasil analisis filogenetik tiga isolat P. palmivora asal Indonesia menunjukkan bahwa isolat P. palmivora asal kelapa (P53 KpTuSU) tidak sekelompok dengan dua isolat P. palmivora asal kakao (P22KoMrwSU dan P40KoMpySU).
Keragaman Genetik Isolat P. palmivora Berdasarkan RAPD Profil pita DNA
Hasil seleksi 10 primer yaitu OPA20, OPA16, OPA11, OPA5, OPA2, OPA7, OPB12, OPB1, OPB5, dan OPB10 terhadap DNA total P. palmivora asal kelapa dan asal kakao dengan teknik PCR-RAPD menghasilkan 5 jenis primer yang menunjukkan pita polimorfis dan memberikan gambar pita DNA yang tajam dan jelas. Kelima primer tersebut adalah OPA16, OPA11, OPB1, OPB5, OPA2 yang kemudian digunakan untuk mengamplifikasi DNA P. palmivora.
Berdasarkan pengamatan terhadap profil pita RAPD yang dihasilkan oleh lima primer tersebut menunjukkan bahwa semua DNA isolat P. palmivora dapat diamplifikasi. Jumlah pita DNA hasil amplifikasi per primer berkisar antara 7-14 pita. Pita DNA hasil amplifikasi yang diperoleh berukuran 250-1000 pasang basa (Gambar 26).
Jumlah pita DNA hasil amplifikasi disajikan dalam Tabel 10. Dengan menggunakan kelima primer yaitu OPA-16, OPB-05, OPA-02, OPB-1, OPA-11 diperoleh 56 pita DNA. Jumlah pita DNA paling banyak terdapat pada primer OPA-11 yaitu sebanyak 15 pita DNA yang semuanya adalah pita polimorfik sedangkan yang paling sedikit adalah primer OPB-1 dan OPA-16 yang masing-masing dengan jumlah pita DNA 9 dan semua pita adalah polimorfik. Persentase pita polimorfik dari hasil amplifikasi lima primer adalah 52 pita atau 92.8% dari total pita. Jumlah pita polimorfik hasil amplifikasi pada isolat P. palmivora asal kelapa sebanyak 92.8%. Sedangkan jumlah pita polimorfik hasil amplifikasi pada isolat P. palmivora asal kakao sebanyak 88.5%.
Gambar 26 Pola pita DNA isolat P. palmivora asal kelapa dan asal kakao hasil amplifikasi menggunakan primer OPA-11. 1) Marker 1 kb (Invitrogen), 2-23) isolat P. palmivora asal kelapa dan asal kakao.
Tabel 10 Jenis primer, susunan basa, total pita DNA dan pita DNA polimorfik isolat P. palmivora asal kelapa dan asal kakao
Isolat P. palmivora
dan jumlah pita polimorfis
No. Primer Susunan basa
(5’---3’) Total Pita DNA Total pita DNA
polimorfik Asal Kelapa Asal Kakao
1 OPA-02 TGCCGAGCTG 12 12 12 10 2 OPA-11 CAATCGCCGT 15 15 14 10 3 OPA-16 AGCCAGCGAA 9 9 9 8 4 OPB-1 GTTTCGCTCC 9 8 8 8 5 OPB-5 TGCGCCCTTC 11 9 9 10 Total 56 52 52 46 Persentase (%) 92.8 92.8 88.5
Analisis filogenetik isolat P. palmivora asal kelapa dan asal kakao berdasarkan RAPD
Hasil pengelompokkan berdasarkan pada penanda RAPD menggunakan lima primer memperlihatkan bahwa antar isolat P. palmivora asal kelapa mempunyai kemiripan genetik yang rendah ditunjukkan dengan mengelompoknya
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 1
850
850 1000
seluruh isolat P. palmivora asal kelapa pada tingkat kemiripan genetik 54%. Pada tingkat kemiripan 54% pengelompokkan isolat P. palmivora asal kelapa terbagi dalam dua kelompok. Kelompok pertama hanya terdiri dari satu isolat P12KpMpgSU, dan kelompok kedua terdiri dari isolat P13KpMpgSU, P34KpMrwSU, P35KpMrwSU, P53KpTuSU, P51KpSkjtiJT, P52KpTuSU, P58KpSdkSU, P41KpHbGrto, P42KpHbGrto, P43KpKdGrto, P44KpByASU, dan P46KpByASU (Gambar 27). Demikian pula hubungan genetik antar isolat P. palmivora asal kakao hanya mempunyai kemiripan genetik 56%. Pada kemiripan genetik 56% isolat P. palmivora asal kakao terbagi dalam dua kelompok yaitu kelompok isolat P61KoSLorJT, P02KoKlTgJT, P04KoTrbslJT, P06KoKlwgJT, P05KoKlwgJT, dan P09KoKlkptJT yang semuanya berasal dari Jawa Timur, dan kelompok kedua terdiri dari isolat P19KoPglSU, P22KoMrwSU, dan P40KoMpySU yang ketiganya berasal dari Sulawesi Utara (Gambar 28). Hasil ini
Gambar 27 Dendrogram isolat P. palmivora asal kelapa berdasarkan RAPD Koefisien 0.50 0.61 0.72 0.84 0.95 P12MpgSU P13MpgSU P35MrwSU P58SdkSU P53TuSU P51SkjtiJT P52TuSU P34MrwSU P41HbGrto P42HbGrto P46ByASU P44ByASU P43KdGrto
Gambar 28 Dendrogram isolat P. palmivora asal kakao berdasarkan RAPD
mengindikasikan bahwa populasi isolat P. palmivora asal kakao lebih beragam dari pada isolat P. palmivora asal kelapa. Jika kedua kelompok populasi isolat P. palmivora asal kelapa dan asal kakao digabung analisis filogenetiknya, maka populasi isolat P. palmivora terbagi menjadi beberapa kelompok dan tidak ada pola pengelompokkan yang jelas antara isolat P. palmivora asal kelapa atau asal kakao. Seluruh isolat P. palmivora mengumpul membentuk satu kelompok pada kemiripan genetik 54% (Gambar 29).
Pada tingkat kemiripan genetik 54%, terjadi dua tingkat pengelompokan yaitu kelompok pertama terdiri atas 6 isolat yaitu P61KoSLorJT, P02KoKlTgJT, P04KoTrbslJT, P06KoKlwgJT, P05KoKlwgJT, P12KpMpgSU. Kelompok kedua terdiri dari 16 isolat yaitu P09KoKlkptJT, P13KpMpgSU, P34KpMrwSU, P35KpMrwSU, P53KpTuSU, P22KoMrwSU, P40KoMpySU, P43KpKdGrto, P51KpSkjtiJT, P52KpTuSU, P58KpSdkSU, P19KoPglSU, P41KpHbGrto, P42KpHbGrto, P44KpByASU, dan P46KpByASU. Pengelompokkan ini juga menunjukkan bahwa isolat P. palmivora asal kelapa dapat mengelompok bersama dengan isolat asal kakao berdasarkan RAPD.
Koefisien 0.50 0.61 0.72 0.84 0.95 P61SLorJT P05KlwgJT P02KlTgJT P04TrbslJT P06KlwgJT P09KlkptJT P19PgklSU P40MpySU P22MrwSU
Gambar 29 Dendrogram isolat P. palmivora antar populasi asal kelapa dan asal kakao berdasarkan RAPD
Jika dilihat dari lokasi pengambilan sampel, maka isolat yang berasal dari lokasi yang sama atau berdekatan tidak selalu menunjukkan hubungan kekerabatan yang dekat sebaliknya isolat yang berasal dari lokasi yang berjauhan tidak selalu menunjukkan hubungan kekerabatan yang jauh. Isolat asal kakao P51KpSkjtiJT dari Sukojati Banyuwangi, Jawa Timur mempunyai kemiripan genetik 86% dengan isolat asal kakao P52KpTuSU dari Tungoi Bolaang Mongondow, Sulawesi Utara. Pengelompokkan ini memperlihatkan bahwa isolat P. palmivora di lapangan sudah sangat beragam baik antar isolat P. palmivora asal kelapa maupun asal kakao.
Virulensi dan patogenisitas
Untuk mengetahui virulensi dari isolat-isolat P. palmivora dilakukan pengamatan terhadap periode laten, keparahan penyakit dan laju perkembangan penyakit melalui bercak pada buah yang muncul akibat inokulasi P. palmivora pada buah kelapa (GSK dan GKN) dan kakao (Tabel 11). Periode laten ke 22 isolat P. palmivora berkisar antara 3.8-7 hari pada kelapa GSK, 2.7-3.5 hari pada kelapa GKN, dan 2.4-7 hari pada kakao. Periode laten tercepat pada kelapa adalah 2.7 hari setelah inokulasi yaitu isolat P41KpHbGrto, sedangkan pada kakao 2.4 hari
Koefisien 0.50 0.61 0.72 0.84 0.95 P12MpgSU P02KlTgJT P04TrbslJT P06KlwgJT P61SLorJT P05KlwgJT P13MpgSU P35MrwSU P58SdkSU P53TuSU P51SkjtiJT P52TuSU P22MrwSU P34MrwSU P40MpySU P43KdGrto P41HbGrto P42HbGrto P46ByASU P19PgklSU P44ByASU P09KlkptJT
setelah inokulasi terjadi pada isolat P61KoSLorJT. Keparahan penyakit yang terjadi pada kelapa GSK dan GKN berkisar antara 3.6-50.5% dan kakao 7.5-37.25%. Keparahan penyakit ertinggi pada buah kelapa GSK terjadi pada isolat P52KpTuSU, sedangkan pada kelapa GKN keparahan tertinggi pada isolat P41KpHbGrto dan P46KpByASU. Keparahan penyakit tertinggi pada buah kakao terjadi pada isolat P61KoSLorJT.
Laju perkembangan penyakit berkisar antara 0.1-0.73 unit/hari. Pada buah kelapa GSK laju perkembangan penyakit tertinggi 0.53 unit/hari adalah isolat P46KpByASU dan pada buah kelapa GKN laju perkembangan penyakit tertinggi 0.73 unit/hari adalah isolat P46KpByASU, sedangkan pada buah kakao laju perkembangan penyakit tertinggi adalah isolat P61KoSLorJT. Isolat asal kelapa P34KpMrwSU yang diinokulasikan pada kelapa tidak menunjukkan gejala penyakit namun pada bagian yang diinokulasi terlihat adanya permukaan kulit buah (0.5 cm) yang berkerut dan agak basah. Nampak isolat P34KpMrwSU adalah isolat yang sudah kehilangan virulensinya sehingga buah kelapa yang diinokulasikan dengan isolat tersebut menunjukkan reaksi hipersensitif. Persentase keparahan penyakit yang ditimbulkan suatu isolat pada tanaman inang pada waktu tertentu merupakan dasar dari penetapan skor virulensi suatu isolat. Tingkat virulensi isolat ditentukan berdasarkan pada skor yang dimiliki setiap isolat (Tabel 12). Ketika isolat-isolat P. palmivora asal kelapa diinokulasikan pada tanaman kelapa maka diperoleh dua isolat P. palmivora yang memiliki tingkat virulensi yang tinggi pada buah kelapa GSK dan empat isolat pada tanaman kelapa GKN. Sedangkan isolat P. palmivora asal kakao diinokulasikan pada buah kakao diperoleh dua isolat yang bervirulensi tinggi. Ketika 13 isolat P. palmivora asal kelapa diinokulasikan pada buah kakao terlihat bahwa tingkat virulensi sebagian besar isolat P. palmivora tergolong avirulen dan hanya satu isolat yang tingkat virulensinya rendah yaitu P52KpTuSU. Begitu juga dengan tingkat virulensi dari sembilan isolat P. palmivora asal kakao yang diinokulasi pada buah kelapa, sebagian besar isolat P. palmivora tergolong avirulen sampai virulensi rendah dan terdapat tiga isolat P. palmivora bervirulensi sedang yaitu P61KoSlorJT, P09KoKlkptJT, dan P40KoMpySU.
Tabel 12 Tingkat virulensi 22 isolat P. palmivora asal kelapa dan asal kakao
Tingkat virulensi pada Isolat P.
palmivora Pola tanam Kelapa GSK
Kelapa
GKN Kakao
Asal Kelapa
P12KpMpgSU Monokultur rendah sedang avirulen P13KpMpgSU Monokultur rendah sedang avirulen P34KpMrwSU Tumpangsari avirulen avirulen avirulen P35KpMrwSU Tumpangsari avirulen tinggi avirulen P41KpHbGrto Monokultur avirulen tinggi avirulen P42KpHbGrto Monokultur rendah sedang avirulen P43KpKdGrto Monokultur sedang sedang avirulen P44KpByASU Monokultur sedang tinggi avirulen P46KpByASU Monokultur tinggi tinggi avirulen P51KpSkjtiJT Monokultur rendah sedang avirulen
P52KpTuSU Tumpangsari sedang tinggi rendah
P53KpTuSU Tumpangsari avirulen sedang avirulen P58KpSdkSU Monokultur avirulen avirulen avirulen
Asal Kakao
P61KoSLorJT Tumpangsari rendah sedang tinggi P02KoKlTgJT Monokultur avirulen avirulen sedang P04KoTrbslJT Tumpangsari rendah avirulen sedang P05KoKlwgJT Monokultur avirulen avirulen avirulen P06KoKlwgJT Monokultur avirulen avirulen sedang P09KoKlkptJT Tumpangsari avirulen sedang sedang P19KoPglSU Monokultur avirulen avirulen avirulen P22KoMrwSU Tumpangsari avirulen avirulen sedang P40KoMpySU Monokultur avirulen sedang tinggi
V. PEMBAHASAN
Penyakit gugur buah kelapa dan busuk buah kakao merupakan penyakit penting secara ekonomi dan dipandang sebagai ancaman utama pada perusahaan perkebunan dan petani kelapa dan kakao di Indonesia. Hasil survei pada daerah sentra produksi kelapa di daerah Sulawesi Utara dan Jawa Timur diketahui bahwa tanaman kelapa yang terserang penyakit gugur buah hanya di provinsi Sulawesi Utara. Di provinsi Jawa Timur penyakit gugur buah tidak ditemukan pada areal pertanaman kelapa. Tidak adanya penyakit gugur buah pada tanaman kelapa di Jawa Timur karena secara umum tanaman kelapa yang ditanam di daerah ini adalah populasi kelapa Dalam Banyuwangi (DBI). Mangindaan et al. (1992) melaporkan bahwa kelapa DBI adalah kelapa yang tahan terhadap penyakit gugur buah. Selain itu pada saat survey dilakukan, tanaman kelapa yang ditanam pada kebun petani di Jawa Timur sedang tidak menghasilkan buah karena bakal buahnya disadap untuk diambil niranya.
Di Sulawesi Utara penyakit gugur buah ditemukan pada populasi kelapa Hibrida PB-121 dan kelapa GKN. Kedua populasi tersebut ternyata sangat rentan terhadap penyakit gugur buah seperti yang dilaporkan oleh Kharie et al. (1992), beliau mengemukakan bahwa kelapa Hibrida PB 121 yang merupakan hasil persilangan antara kelapa Dalam Afrika dan Genjah Merah Malaysia sangat rentan terhadap penyakit gugur buah. Runtunuwu et al. (1999) juga melaporkan bahwa GKN sangat rentan terhadap penyakit gugur buah. Hasil penelitiannya juga menunjukkan bahwa luas busuk buah pada populasi kelapa GKN yang diinokulasi dengan P. palmivora berkisar antara 50.8 - 87.0 cm2 merupakan paling luas diantara beberapa populasi kelapa Genjah dan kelapa Dalam uji. Dengan demikian dapat dipahami bahwa sebenarnya gugur buah kelapa akan menjadi ancaman pada kelapa yang rentan seperti kelapa Hibrida PB-121 dan GKN tapi tidak pada kelapa Dalam. Walaupun populasi kelapa Dalam diketahui tahan terhadap busuk buah, ketahanan ini hanya akan terjadi selama tidak ada tindakan pengendalian yang bertujuan untuk memusnahkan patogen seperti aplikasi pestisida atau penggunaan tanaman tahan (vertikal resisten) secara monokultur yang luas.
Hasil survey menunjukkan penyakit busuk buah kakao ditemukan pada lokasi sentra produksi kakao di provinsi Jawa Timur dan Sulawesi Utara. Di
provinsi Jawa Timur terlihat kejadian penyakit busuk buah lebih tinggi pada lokasi dengan pola tanam monokultur dibandingkan dengan pola tanam tumpangsari. Sedangkan di Sulawesi Utara, kejadian penyakit gugur buah tidak menunjukkan perbedaan antara lokasi tumpangsari dan monokultur. Tingginya kejadian penyakit busuk buah lebih dipengaruhi oleh keadaan kebun yang tidak terawat. Ada lokasi tumpangsari kelapa dan kakao yang kejadian penyakitnya ringan yaitu lokasi Sepanjang Lor, Treblasala, dan Kalikempit (Jawa Timur). Lokasi tersebut dilakukan pemeliharaan dengan pemangkasan. Frekuensi panen setiap 3 hari sekali juga digunakan sebagai kegiatan dalam memantau adanya buah busuk untuk dimusnahkan dengan cara memendamkan buah busuk dalam tanah.
Pada lokasi Marinsow (Sulawesi Utara), tingkat kejadian penyakit busuk buah kakao adalah sedang, sedangkan pada lokasi di Desa Tungoi dan Mopuya adalah berat. Tingginya kejadian penyakit busuk buah kakao karena tidak melakukan pemeliharaan pemangkasan dan gulma di bawah tanaman. Selain itu tingginya kejadian penyakit busuk buah diperparah dengan adanya serangan penggerek buah kakao (PBK). Kurangnya pengetahuan petani tentang pemeliharaan tanaman dan pengetahuan tentang hama dan penyakit tanaman kakao juga memperparah kejadian penyakit busuk buah. Oleh karena itu untuk mengurangi munculnya penyakit busuk buah kakao dianjurkan untuk melakukan teknik budidaya yang benar. Pemangkasan ranting-ranting perlu dilakukan untuk menjaga agar kelembaban udara di dalam areal kebun rendah sehingga patogen tidak berkembang. Selain itu perlu dilakukan pengendalian terhadap penggerek buah kakao dan penggunaan varietas tahan terhadap beberapa ras patogen. Penggunaan varietas yang horizontal resisten harus menjaga kelembaban udara dan tanah di dalam kebun tetap stabil.
Analisis keragaman isolat-isolat P. palmivora asal kelapa dan asal kakao di areal sampel berdasarkan aspek morfologi diketahui ke 22 isolat P. palmivora sangat beragam. Pengamatan bentuk sporangium ke-22 isolat P. palmivora sangat beragam, tapi umumnya berbentuk ellipsoid sampai ke ovoid. Tidak ada perbedaan bentuk antara isolat P. palmivora asal kelapa maupun isolat P. palmivora asal kakao. Berdasarkan ukuran panjang dan lebar sporangium diketahui juga sangat bervariasi antar isolat P. palmivora. Kisaran panjang sporangium P palmivora asal kelapa 47-62 µm dan lebar 32-43 µm, sedangkan panjang sporangium P.
palmivora asal kakao 40-54 µm dan lebar 28-37 µm. Menurut Stamp et al. (1990) bahwa panjang dan lebar sporangium P. palmivora 35-60 µm dan 20-40 µm Sedangkan menurut Erwin dan Ribeiro (1996) ukuran panjang P. palmivora berkisar antara 40-60 µm dan lebar 20-40 µm. Panjang dan lebar sporangium isolat asal kelapa lebih panjang dan lebih lebar dari isolat asal kakao. Hasil ini juga didukung oleh beberapa peneliti sebelumnya bahwa rata-rata panjang
