3 BAHAN DAN METODE
3.4 Pelaksanaan Penelitian
Spesimen Goniopora spp. dikumpulkan dari berbagai habitat di perairan P. Pramuka dan P. Panggang di daerah Kepulauan Seribu. Masing-masing pada kedalaman 3 - 6 meter. Dari setiap koloni diambil sampel berukuran ± 10 cm secara acak. Sampel yang akan digunakan untuk analisa morfologi disimpan dalam air laut mengandung formalin 4% yang kemudian dalam waktu 24 jam dibilas dengan akuades steril dan dipindahkan ke dalam larutan alkohol 70%. Sementara sampel yang akan digunakan untuk analisis DNA berupa karang hidup yang disimpan kontainer bertutup berisi air laut, dan untuk jaringan polip karang disimpan dalam kontainer berisi etanol absolute atau di dalam termos berisi Nitrogen cair.
b) Karakterisasi Morfologi
Karakter morfologi yang akan diamati adalah jumlah tentakel pada setiap polip karang (24 buah) saat karang masih hidup, bentuk dan kerangka kapur, diameter koralit (coralite) dan calyx (calice), bentuk koralit, paliform lobe, columella dan dinding koralit, serta jumlah septa tiap koralit. Metode pengamatan yang dilakukan mengacu pada Klemm et al. (1995), Veron (2000) dan Kleemann (2002).
35
Gambar 9 Ilustrasi karakteristik morfologik yang diamati pada karang Goniopora.
c) Isolasi DNA Total, Purifikasi dan Elektroforesis DNA Total
Isolasi dan Purifikasi DNA Total
Isolasi DNA Total dilakukan menggunakan modifikasi metode Duryadi (1993). Sampel polip karang segar dicacah dan dihaluskan dalam mortar sambil ditetesi larutan CTAB sebanyak 600 μl sedikit demi sedikit. Setelah itu dimasukkan ke dalam ependorf 1.5 ml, sambil dikocok sebentar. Kemudian dinkubasi selama 3 jam dengan suhu 65 ºC. Tambahkan proteinase-K sebanyak 2 μl, dan diinkubasi selama semalaman dengan suhu 55 ºC. ditambah larutan fenol sebanyak 400 μl dan dikocok manual selama 40 menit, disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 13 000 rpm, sedangkan supernatannya dipindahkan ke ependorf lain, lalu fenolnya dibuang. Kemudian ditambah larutan CIAA sebanyak 600 μl (minimum 500 μl), dikocok lagi secara manual selama 20 menit hingga berbusa dan terlihat bening, kemudian disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 13 000 rpm, supernatannya dipindahkan ke ependorf lain. Selanjutnya
ditambah etanol absolut sebanyak 1000 μl, dikocok lagi secara manual selama 10 menit. Kemuidan dimasukkan ke dalam freezer ± 15 menit, lalu disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 13 000 rpm. Etanolnya dibuang (usahakan agar endapan DNA yang terbentuk tidak terbuang), kemudian ditambahkan etanol 70% sebanyak 600 μl. Dikocok lagi secara manual hingga terbentuk endapan selama 5 menit, kemudian disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 13 000 rpm. Etanol tersebut dibuang sampai menyisakan endapannya saja, lalu dikering- udarakan dan divakum selama ± 10 menit. Kemudian dimasukkan TE+RNAase 50 μl dan diinkubasi ± 10 menit dengan suhu 37 ºC. Selanjutnya disentrifugasi selama beberapa detik dengan kecepatan 6 500 rpm, dan dimasukkan ke dalam freezer dengan suhu -20 ºC.
Elektroforesis Gel
Gel elektroforesis merupakan metode analisis kualitatif untuk memisahkan dan menganalisis DNA. Untuk membuat satu agar penuh, campurkan TBE 1 x sebanyak 50 l dicampur dengan 0.6 g bubuk agarosa (1.2% gel agarosa) dan dipanaskan hingga mendidih. Agarosa merupakan polisakarida yang berasal dari rumput laut dan akan membentuk gel padat jika diarutkan dengan pemanasan pada konsentrasi antara 0.5 dan 2% (w/v). Agarosa ini kemudian akan membentuk pori yang besarnya sesuai dengan konsentrasi agarosa. Molekul DNA yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat di dalam gel agarosa sebaliknya molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat. TBE digunakan karena larutan ini memungkinkan DNA bergerak dengan perlahan di dalam gel. Larutan ini akan mengoptimalisasi pH dan mengkonsentrasikan ion di dalam gel sekaligus merendam gel sehingga arus listrik dapat mengalir dalam gel. TBE mengandung Tris yang merupakan senyawa kimia yang membantu mempertahankan konsistensi pH dalam larutan. Selain itu juga mengandung asam borat yang berfungsi untuk menyediakan konsentrasi ion yang tepat untuk buffer dan EDTA yang berfungsi mengkelat kation divalen Magnesium (Saunders dan Parkes 1999). Kemudian larutan didinginkan lalu ditambah dengan 2.5 l EtBr (Ethidium bromide) merupakan pewarna yang digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang terseparasi dalam gel. EtBr
37 yang mengandung zat fluorosence akan terikat diantara dua untai ganda DNA sehingga pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar jika diihat menggunakan UV transluminator (Saunders dan Parkes 1999). Larutan gel ini kemudian dituang kedalam cetakan gel yang telah diatur posisinya dalam keadaan sejajar (datar) dan telah dipasangi sisir. Cetakan harus benar-benar datar agar proses migrasi DNA dapat berjalan baik dan hasil migrasi tidak dipengaruhi oleh kemiringan gel akibat cetakan yang tidak datar. Gel kemudian didiamkan selama 30 menit hingga mengeras dan dimasukkan ke dalam bak gel lalu dituang dengan TBE buffer sampai gel terendam. TBE ini berfungsi sebagai konduktor listrik. Sampel DNA kemudian diambil 5 l dan dicampur dengan loading dye 0.5 l diatas plastik bersih sampai merata lalu dipipet kembali dan dimasukkan ke dalam sumuran
(well). Loading dye berfungsi sebagai pemberat untuk meningkatkan densitas DNA sehingga DNA akan tenggelam dalam sumuran sehingga tidak melayang dalam larutan TBE. Selain itu, loading dye juga digunakan sebagai penanda visual untuk mengetahui seberapa jauh pergerakan DNA di dalam gel.
Proses migrasi DNA dengan menggunakan piranti Submarine Electrophoresis (Hoefer, USA) yang dihubungkan dengan elektroda pada voltase 85 V, 45 Amp selama 30 menit. Pada saat proses migrasi, akan terjadi aliran listrik. DNA yag bermuatan negatif akan bergerak menuju elektroda positif. Kecepatan pergerakan DNA dalam gel akan sangat bergantung pada ukuran dan bentuk DNA, konsentrasi gel dan voltase yang digunakan. Setelah proses migrasi DNA selesai, power supply dimatikan dan gel diambil kemudian diamati di bawah UV- transluminator lalu difoto.
d) Amplifikasi COI dan ITS dengan PCR dan Elektroforesis Hasil PCR Dalam penelitian ini, amplifikasi DNA dengan PCR menggunakan primer CO1 yang didisain menggunakan soft ware Primer 3 version 0.4.0
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) berdasarkan modifikasi runutan gen COX1 Porites porites, (kode akses NC_008166) dan gen COX1 Goniopora sp. ZHF- 2009 isolate Wa3 cytochrome oxidase subunit 1 (COX1) (kode akses FJ423995) yang sudah di-alignment dengan program MEGA versi 4.0 (Tamura et al. 2007). Amplifikasi primer gen mitokondrial sitokrom c oksidase sub unit 1 (COI) adalah:
GJWCO1 F 5’-CTC GGC ACA GCC TTC AGT ATG TTA-3’ (24 bp) dan GJWCO1 R 5’-AAT ATA AAC TTC AGG ATG CCC AAA-3’ (24 bp) sedangkan primer gen daerah nuclear intra transcribed spacer ribosomal (ITS) adalah primer yang dikembangkan oleh Forsman et al. (2009) dengan atau tanpa modifikasi yaitu : ITSZF 5'-TAA AAG TCG TAA CAA GGT TTC CGT A-3' (25 bp), dan ITSZR 5'-CCT CCG CTT ATT GAT ATG CTT AAA T-3' (25 bp).
Proses amplifikasi COI dan daerah ITS menggunakan mesin GeneAmpR PCR system 2004 (Perkin Elmer). Strategi dan komposisi larutan menggunakan modifikasi metode Duryadi (1993). Kondisi PCR yang digunakan untuk amplifikasi COI adalah : tahap predenaturasi pada suhu 94 ºC selama 5 menit, dilanjutkan dengan siklus utama yaitu tahap denaturasi pada suhu 94 ºC selama 45 detik, tahap penempelan (annealing) pada suhu 48 ºC selama 1 menit, tahap polimerasi (extension) pada suhu 72 ºC selama 1 menit, yang diulang sebanyak 35 siklus, dan diakhiri dengan tahap polimerasi (post extension) pada suhu 72 ºC selama 5 menit dan tahap perpanjangan (elongation) pada suhu 20 ºC. Sedangkan proses amplifikasi ITS adalah sama dengan amplifikasi COI hanya berbeda pada tahap penempelan (annealing) yaitu pada suhu 48 ºC selama 1 menit.
e) Perunutan Fragmen CO1 dan ITS
Perunutan (sequencing) DNA hasil PCR dilakukan di PT. CHAROEN POKPHAN INDONESIA. Dengan menggunakan Mesin ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA), yang menggunakan metode Dye- dideoxy-terminator menggunakan BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems, USA).
f) Analisis Data
Sisi homolog dari runutan basa nukleotida gen COI dan ITS kemudian disejajarkan (multiple alignment) dan dibandingkan dengan runutan-runutan COI dan ITS dari GenBank kemudian dianalisis menggunakan program MEGA versi 4.0 (Tamura et al. 2007) dengan metode bootstrapped neighbor joining dengan 1000 kali pengulangan.