Bagan alir penelitian disajikan pada Gambar 4.
Gambar 4 Bagan Alir Penelitian
3.3.1 Peremajaan 4 Isolat Ganggang Mikro dalam Media BG 11 pada Skala Laboratorium
Tahapan penelitian diawali dengan peremajaan 4 isolat ganggang mikro. Sebanyak 2 ml isolat diinokulasikan ke dalam 50 ml media BG11 dalam botol bening berukuran ± 100 ml. Selanjutnya dilakukan proses kultivasi selama 3 minggu dengan cara digoyang (shaker).
3.3.2 Kultivasi 4 Isolat Ganggang Mikro dalam Media 50 ml 0.75 M4 pada Skala Laboratorium
Tahapan kultivasi selanjutnya dilakukan dalam media 50 ml 0.75 M4. Pada tahapan ini pengaruh perlakuan kombinasi sumber N dan P terhadap
Peremajaan 4 isolat ganggang mikro dalam media BG 11 pada skala laboratorium
Kultivasi 4 isolat ganggang mikro terseleksi dalam media 50 ml 0.75 M4 pada skala laboratorium
Kultivasi 4 isolat ganggang mikro pada media 2 L 0.75 M4 skala laboratorium
Kultivasi ganggang mikro pada media 150 L 0.75 M4 pada kolam raceway
Analisis karbohidrat
Analisis protein
Analisis kadar air Biomassa kering ganggang mikro
Identifikasi 4 isolat ganggang mikro Analisis lipid
produktivitas biomassa dievaluasi berdasarkan kerapatan optik (nilai OD, optical density) selama periode pertumbuhan hingga 27 hari, yang menghasilkan nilai OD
≥ 0.5, pada panjang gelombang 620nm.
3.3.3 Kultivasi Ganggang Mikro dalam Media 150 L 0.75 M4 pada Kolam Sistem Raceway
Kultivasi biakan ganggang mikro pada skala lapang, dilakukan di kolam raceway (Chisti 2007) dengan volume 150 L media 0.75 M4. Selanjutnya dievaluasi berdasarkan produksi karbohidrat, protein dan lipid dari biomassa ganggang mikro tiap isolat.
3.3.4 Produksi Biomassa pada Skala Lapang
Pada tahap produksi biomassa ganggang mikro di skala lapang, dilakukan pemanenan 2 kali pada interval 2 hari. Laju pertumbuhan ganggang direpresentasikan oleh nilai kerapatan optik (OD). Setelah biakan ganggang mikro mencapai nilai OD minimum yaitu 0.5 maka dilakukan proses kultivasi kembali dengan tujuan menentukan OD minimum dan volume biakan (L) pada hari ke-0 agar nilai OD panen minimum 0.5 tercapai untuk setiap isolat ganggang mikro. Penentuan penambahan volume untuk setiap isolat berdasarkan persamaan linier dari kurva laju pertumbuhan ganggang mikro. Untuk penetapan produksi biomassa kering dilakukan dengan metode gravimetri yaitu pemisahan, pengeringan dan penimbangan berat kering.
3.3.5 Tahapan Identifikasi Ganggang Mikro
Tahapan identifikasi ganggang mikro dilakukan dengan mikroskop fluorescence perbesaran hingga 1000X berdasarkan karakteristik morfologi umum serta sifat-sifat selular seperti jenis pigmen fotosintetik serta struktur sel dan flagela dengan mengacu pada (Heaps 1977), (Prescott 1978) serta (Bold dan Wynne 1985).
3.3.6 Produksi Karbohidrat
Produksi karbohidrat (%) = 100 - % (produksi protein + kadar air + produksi lipid + kadar abu) (SNI 01-2973-1992).
3.3.7 Analisis N-Total dan Protein
Penetapan N-total pada ganggang mikro dilakukan dengan menggunakan metode Kjeldahl (Apriantono et al. 1989). Serbuk ganggang kering 0.5 gram dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 25 ml, lalu ditambahkan 1.9 gram campuran Se, CuSO4 dan Na2SO4. Larutan 5 ml H2SO4
N-Total =
pekat ditambahkan ke dalam labu, digoyangkan perlahan-lahan, kemudian 5 tetes paraffin cair ditambahkan dan dipanasi, sambil digoyang perlahan-lahan, kemudian perlahan-lahan api diperbesar hingga diperoleh cairan berwarna terang (hijau biru), panasi 15 menit lalu didinginkan. Kemudian aquadest ditambahkan kira-kira sebanyak 50 ml, lalu isi labu dipindahkan ke dalam labu destilasi dan ditambahkan 5 ml NaOH 50 %. Destilat dititrasi dengan HCl 0.0999 N hingga terjadi perubahan warna dari hijau ke merah muda. Penetapan blanko juga dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas namun tanpa sampel. Rumus perhitungan:
(ml contoh - ml blangko) x Normalitas x 14 Bm
x 100%
% Protein = % N x fk
Keterangan: Bm = biomassa kering (gram) fk = faktor koreksi (6.25) 3.3.8 Kadar air (AOAC 2007)
Pengukuran kadar air ganggang mikro diawali dengan mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 ºC selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (± 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin dan ditimbang hingga beratnya konstan. Setelah itu sebanyak 5 gram sampel ganggang mikro dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 ºC selama 24 jam. Cawan kembali dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali. Perhitungan kadar air (%):
W1-W W
2 2-W Keterangan: W = kadar air (%)
3
W1
W
= berat cawan sebelum dioven (gram)
2
W
= berat cawan setelah dioven (gram)
3= berat cawan (gram)
X 100%
=
3.3.9 Produksi Lipid
Analisis produksi lipid dilakukan dengan metode chemical solvent oil extraction (Bligh dan Dyer 1959), yaitu dengan menggunakan bahan kimia sebagai pelarut. Pelarut kimia tersebut berupa metanol dan chloroform dengan perlakuan: tabung ditimbang dan dicatat berat tabung reaksi kosong, dimasukkan ganggang mikro, disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm atau setara dengan 958 x g selama 10 menit, kemudian dibuang supernatan lalu disimpan dalam oven (suhu 80 o
Perhitungan produksi lipid (%):
C) selama 1 malam hingga kering; biomassa ganggang mikro yang telah kering ditambahkan dengan 4 ml aquadest steril, ditambahkan metanol 10 ml dan chloroform sebanyak 5 ml, dikocok kembali selama 1 malam kemudian ditambahkan kembali aquadest steril sebanyak 5 ml dan chloroform sebanyak 5 ml, disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit; diambil endapan lipid yang mengendap selanjutnya diletakkan dalam tabung reaksi dan dipanaskan untuk menghilangkan campuran larutan kimia yang ditambahkan sebelumnya.
Bw
Lw
Keterangan: Lw = berat lipid (gram) Bw = berat biomassa (gram) 3.3.10 Kadar abu (AOAC 2007)
Ganggang mikro sebanyak 2 gram ditimbang dalam porselen dan ditempatkan dalam suhu terkontrol dari tanur hingga suhu 600 ºC selama 2 jam. kemudian porselen segera dipindahkan ke dalam desikator untuk didinginkan dan dilakukan penimbangan bobot akhir sampel.
Perhitungan kadar abu (%): W1-W
W
2 2-W Keterangan: W = kadar air (%)
3
W1
W
= berat cawan sebelum dioven (gram)
2
W
= berat cawan setelah dioven (gram)
3= berat cawan (gram)
X 100 % X 100% = W = Lipid
3.3.11 Rancangan Percobaan
Perlakuan kombinasi sumber hara N dan P terhadap produktivitas biomassa dievaluasi berdasarkan nilai kerapatan optik (nilai OD, optical density) ganggang mikro selama periode pertumbuhan hingga 27 hari. Percobaan dilakukan berdasarkan rancangan acak lengkap satu perlakuan dengan 9 taraf, yaitu N1P1, N1P2, N1P3, N2P1, N2P2, N2P3, N3P1, N3P2, N3P3
N
, dengan 3 ulangan sehingga didapat 27 satuan percobaan dan dilakukan 5 kali pengukuran OD yaitu pada hari ke-6, 11, 15, 19 dan 27. Adapun perlakuan yang diberikan adalah sebagai berikut:
I : 100 % (NH4)2SO4, 0 % NaNO N 3 2 : 50 % (NH4)2SO4, 50 % NaNO N 3 3 : 0% (NH4)2SO4, 100 % NaNO P 3 1 : 100 % SP36, 0 % K2HPO P 4 2 : 50 % SP36, 50 % K2HPO P 4 3 : 0 % SP36, 100 % K2HPO4 Kombinasi Perlakuan P1(100,0) P2(50,50) P3(0,100) N1 (100,0) N1P1 N1P2 N1P3 N2 (50,50) N2P1 N2P2 N2P N 3 3 (0,100) N3P1 N3P2 N3P3
Pengaruh perlakuan terhadap pertumbuhan ganggang mikro diketahui dengan menggunakan Analysis of Variance (ANOVA), kemudian dilakukan pengujian hipotesis dengan membandingkan nilai F hitung terhadap F tabel dengan selang kepercayaan 95 % dan 99 % dengan kaidah pengambilan keputusan sebagai berikut: (Steel et al.1997).
Yij= µ + αi+ βj + εij
Keterangan:
Yij : nilai pengamatan pada perlakuan kombinasi sumber hara N dan P media ke-i dan ulangan ke-j
µ : rataan umum
αi :
β
pengaruh perlakuan kombinasi sumber hara N dan P media ke-i
j : pengaruh ulangan ke-j
εij : pengaruh galat percobaan dari perlakuan kombinasi sumber hara N dan P media ke-i dan ulangan ke-j
i : perlakuan kombinasi sumber hara N dan P media ke-i j : ulangan ke-j
Berdasarkan Analysis of Variance (ANOVA), perlakuan yang memberikan pengaruh nyata diuji lanjut dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) menggunakan sofware SPSS 13.0.