III KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS
4.4 Pelaksanaan Penelitian
Penelitian yang dilakukan meliputi sterilisasi alat dan bahan, persiapan hewan uji, penentuan konsentrasi bakteri Enterobacter sp. secara injeksi intra peritoneal dan pengamatan gejala klinis. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.
4.4.1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Ikan nila dipelihara dalam wadah toples plastik volume 10 liter. Toples dan seluruh peralatan yang akan digunakan selama penelitian dicuci dan dibilas terlebih dahulu dengan sabun cuci agar steril setelah itu dijemur di bawah sinar matahari. Media pemeliharaan ikan nila didapatkan dari sumur bor Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga dengan kandungan salinitas 30 ppt yang telah diuji menggunakan refraktometer dan menampungnya dalam tandon 1000 liter. Media yang akan digunakan diberi kaporit dengan dosis 30 ppm (Praditia, 2009), kemudian diendapkan dan dilakukan pemberian aerasi dengan menggunakan blower selama 24 jam (Arief dkk., 2010).
Gambar 3. Diagram Alir Penelitian Persiapan hewan uji
Persiapan alat dan bahan
Isolat murni bakteri
Enterobacter sp.
Penentuan konsentrasi bakteri dengan menggunakan metode McFarland 108, 107 dan 106 sel/ml;
Adaptasi lingkungan meliputi suhu dan salinitas selama 7
hari Analisis Data Kontrol: Ikan nila tanpa injeksi bakteri Enterobacter sp. Perlakuan 1 : Ikan nila diinjeksi
0,1 ml/ekor bakteri Enterobacter sp. konsentrasi 108 Perlakuan 2 : Ikan nila diinjeksi 0,1 ml/ekor bakteri Enterobacter sp. konsentrasi 107 Perlakuan 3 : Ikan nila diinjeksi
0,1 ml/ekor bakteri Enterobacter sp. konsentrasi 106 Perlakuan 4 : Ikan nila diinjeksi 0,1 ml/ekor NaCl 0,9% secara intra
Pemeliharaan dilakukan selama 14 hari dengan pemberian pakan buatan tiga kali sehari serta pengontrolan kualitas air (suhu, pH dan salinitas) dan penggantian air setiap hari sebanyak 20%
Ikan Mati Ikan Hidup
Pengamatan gejala klinis meliputi : Keaktifan mencari makan, pembengkakan atau pendarahan pada kulit dan insang serta tingkah laku ikan
Penghitungan SR (Survival Rate) setiap hari selama 14 hari
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Sterilisasi alat-alat yang berbahan kaca dengan menggunakan autoclave. Pertama mencuci alat-alat yang berbahan kaca dengan air tawar, dikeringkan, kemudian dibungkus dengan alumunium foil. Setelah itu dimasukkan ke dalam autoclave, kemudian autoclave dioperasikan dengan suhu 121oC dan tekanan satu atmosfer selama 15 menit. Setelah proses selesai, alat-alat dikeluarkan dari autoclave dan disimpan pada wadah yang steril. Sterilisasi bertujuan menghilangkan mikroorganisme yang tidak diinginkan dari alat dan bahan yang akan digunakan.
4.4.2 Persiapan Ikan Nila
Ikan nila (Oreochromis niloticus) sebagai hewan uji dibeli dari pasar ikan Gunungsari dengan ukuran 11-12 cm/ekor sebanyak lima ekor yang dipelihara dalam lima liter media pemeliharaan (SNI, 1999) dikarenakan uji patogenitas bakteri Enterobacter sp. dilakukan secara injeksi (Masithah dkk., 2006). Ikan terlebih dahulu diaklimatisasi dengan media yang baru sebelum diberikan perlakuan meliputi aklimatisasi suhu dan salinitas. Tahapan adaptasi suhu adalah kantong plastik yang berisi ikan diapung-apungkan ke wadah adaptasi berupa bak plastik, kemudian kantong plastik dibuka secara perlahan dan dibiarkan ikan keluar dengan sendirinya. Aklimatisasi suhu berlangsung selama enam jam (Sufianto, 2008), setelah itu dilanjutkan ke tahapan adaptasi salinitas.
Peningkatan salinitas media ikan nila secara bertahap dilakukan dengan mengalirkan air bersalinitas 5, 10, 15, 20, 25 dan 30 ppt dari dalam bak stok ke dalam akuarium selama 48 jam sampai salinitas media ikan nila dalam akuarium
modifikasi penelitian yang dilakukan Watanabe (1984) dalam Triastuti (2014). Adaptasi salinitas ikan terhadap media yang baru dilakukan selama 48 jam dengan dilakukan pemberian pakan tiga kali sehari dengan jumlah pakan yang diberikan 3% dari biomasa ikan (Pusat Penyuluhan Kelautan dan Perikanan, 2011). Adaptasi ini bertujuan untuk menghindari hewan uji agar tidak stress saat diberikan perlakuan selama penelitian.
4.4.3 Pembuatan Konsentrasi Isolat Bakteri Enterobacter sp.
Pembuatan konsentrasi isolat bakteri Enterobacter sp. dilakukan secara bersamaan dengan persiapan hewan uji. Metode pembuatan konsentrasi bakteri Enterobacter sp. berdasarkan standar kekeruhan McFarland (Perilla et al., 2003). Langkah awal yaitu menyiapkan larutan McFarland komersial 0,5 yang berisi 1.175% barium chloride dihydrate (BaCl2) dan 1% sulfuric acid (H2SO4) setelah itu, menyiapkan satu tabung yang berisi 10 ml media kultur cair (TSB-SW). Langkah selanjutnya mengambil bahan isolat Enterobacter sp. dari mikrotube menggunakan jarum ose, setelah itu menanamnya pada media dan menginkubasinya selama 24 jam. Setelah selesai diinkubasi, tahap berikutnya yaitu melakukan sentrifugasi pada kecepatan 1500 rpm selama tiga menit, lalu membuang supernatannya. Endapan bakteri Enterobacter sp. hasil sentrifugasi kemudian dicampurkan dengan larutan NaCl 0,9% sampai volumenya sama dengan volume awal sebelum supernatan dibuang. Tahap terakhir yaitu melakukan pengamatan dengan membandingkan antara turbiditas kultur bakteri dengan larutan standar McFarland 0,5. Jika suspensi bakteri yang digunakan terlalu keruh dibandingkan larutan standar McFarland 0,5 maka perlu
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
pengenceran lagi dengan NaCl 0,9% sampai kecerahannya sama dengan standar McFarland 0,5 dan sebaliknya.
4.4.4 Penyuntikan Bakteri pada Hewan Uji
Suspensi bakteri Enterobacter sp. sebanyak 0,1 ml disuntikkan secara intra peritoneal dengan jarum suntik 1 ml pada lima ekor ikan nila tiap ulangan. Penyuntikan dilakukan secara perlahan dan lembut dengan cara menutup bagian mata ikan nila dengan kain bersih bertujuan menghindari ikan nila supaya tidak stres setelah proses penyuntikan. Ikan nila yang telah disuntik selanjutnya dimasukkan ke dalam toples plastik volume 10 liter dan telah diisi lima liter air bersalinitas 30 ppt dan dibiarkan selama 14 hari serta dilakukan pengontrolan setiap hari. Metode ini merupakan modifikasi dari penelitian Mangunwardoyo dkk. (2010).
4.4.5 Pemeliharaan Ikan Nila
Injeksi yang dilakukan adalah injeksi bakteri secara intraperitoneal dengan konsentrasi 108, 107 dan 106 sel/ml (Dewi, 2008) dan NaCl 0,9% (Sabariah, 2010) sebanyak 0,1 ml/ekor (Aryanto, 2011). Pemeliharaan ikan nila setelah dilakukan injeksi yaitu selama 14 hari pada wadah pemeliharan dan dilengkapi aerasi (Masithah dkk., 2006). Pakan buatan diberikan dengan kandungan protein 25% yaitu berupa pelet dengan nama produk Hi Pro Vite® 781-3 sebanyak tiga kali sehari dengan jumlah pakan yang diberikan 3% dari biomassa ikan (Pusat Penyuluhan Kelautan dan Perikanan, 2011).
Tengah, 2010) dan dilakukan penjagaan kualitas air yang meliputi suhu 25°C-30°C, pH 6,5-8,5 dan salinitas 30 ppt (SNI, 1999) agar tetap optimal. Pada akhir pemeliharaan dilakukan penghitungan terhadap kelangsungan hidup ikan dan dibandingkan dengan kontrol (tanpa injeksi bakteri Enterobacter sp.).
4.4.6 Penghitungan Kelangsungan Hidup (Survival Rate)
Penghitungan kelangsungan hidup (survival rate) ikan nila dilakukan pada akhir masa pemeliharaan kemudian dibandingkan dengan saat awal pemeliharaan. Menurut Effendie (1997) kelangsungan hidup ikan nila (Oreochromis niloticus) dapat dihitung dengan persamaan (1) berikut ini :
% 100 x No Nt SR ………... (1) Keterangan :
SR : Survival Rate atau derajat kelangsungan hidup (%) Nt : Jumlah ikan nila yang hidup diakhir penelitian (ekor) No : Jumlah ikan nila yang hidup diawal penelitian (ekor) 4.4.7 Pengamatan Gejala Klinis
Gejala Klinis adalah tanda-tanda awal yang terdapat pada ikan yang disebabkan oleh serangan hama dan penyakit ikan, berupa kelainan atau perubahan fisik, tingkah laku yang dapat dilihat secara visual (SK-BKIPM, 2015). Pengamatan gejala klinis dilakukan dengan pengamatan secara langsung tanpa menggunakan alat. Gejala yang diamati yaitu keaktifan mencari makan seperti respon terhadap pemberian pakan (cepat atau lambat), pembengkakan atau pendarahan pada kulit dan insang contohnya terdapat luka pada daerah bekas suntikan (inflamasi) serta tingkah laku ikan nila seperti cara berenang ikan masih
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
sempurna atau tidak (Haryani dkk., 2012) selama pemeliharaan dibandingkan dengan ikan nila yang tidak diberi perlakuan (kontrol).
4.5 Parameter Pengamatan A. Parameter Utama
Parameter utama dalam penelitian ini adalah survival rate (SR) atau derajat kelangsungan hidup dari ikan nila dan pengamatan gejala klinis yaitu keaktifan mencari makan, pembengkakan atau pendarahan pada kulit dan insang serta tingkah laku ikan selama pemeliharaan (Hartini dkk., 2013).
B. Parameter Pendukung
Parameter pendukung digunakan untuk melengkapi data dari parameter utama. Parameter pendukung dalam penelitian ini adalah kualitas air meliputi suhu, pH dan salinitas yang telah ditetapkan terhadap hasil penelitian (Hartini dkk., 2013).
