Kentang dikupas dan dicuci bersih lalu ditimbang 250 gr, dipotong dadu berukuran 1-2 cm, kemudian kentang dimasak dengan aquades 500 ml pada oven selama 30 menit, lalu disaring ekstraknya dengan kain muslin sampai volume 500 ml. Masukkan dextrose sebanyak 20 gr dan agar sebanyak 20 gr kedalam beaker glass, tambahkan aquades sebanyak 500 ml, aduk sampai merata. Masukkan ekstak kentang yang telah disaring (500 ml) kedalam larutan dextrose+agar, aduk hingga homogen dan didihkan diatas oven selama 30 menit. Masukkan kedalam Erlenmeyer masing-masing 200 gr. Selanjutnya Erlenmeyer ditutup dengan kapas steril dan aluminium foil lalu balut dengan cling wrap atau isolasi. Selanjutnya masukkan kedalam autoclave untuk disterilkan selama 30 menit dengan suhu 120-1210 C pada tekanan 1,5 atm.
4.2. Pembuatan Media NA
Disediakan difco nutrient agar sebanyak 23 gr, letakkan di dalam beaker glass kemudian dicampur dengan aquades sebanyak 1000 ml, diaduk hingga homogen. Panaskan campuran ini hingga mendidih. Setelah itu tuang kedalam Erlenmeyer 200 gr, Tutup erlenmeyer dengan kapas steril dan aluminium foil lalu balut dengan cling wrap atau isolasi. Selanjutnya masukkan kedalam autoclave untuk disterilkan selama 30 menit dengan suhu 120-1210 C pada tekanan 1,5 atm.
4.3. Pembuatan Media King’s B
Disediakan bahan-bahan berikut : bactopeptone 20 gr, K2PO4 2,5 gr, glycerol 15 ml, MgSO4.7H2O 6 gr, agar/bacto agar 15 gr. Keseluruhan bahan tersebut campurkan dalam beaker glass kemudian ditambahkan aquadest sebanyak 1000 ml, aduk hingga homogen kemudian panaskan dengan oven hingga mendidih. Setelah itu tuang kedalam Erlenmeyer ukuran 200 gr, Tutup erlenmeyer dengan kapas steril dan aluminium foil lalu balut dengan cling wrap atau isolasi. Selanjutnya masukkan kedalam autoclave untuk disterilkan selama 30 menit dengan suhu 120-1210 C pada tekanan 1,5 atm.
4.4. Isolasi Bakteri Endofit
Isolat bakteri endofit diperoleh dengan cara mengisolasi langsung dari tanaman kedelai yang paling sehat dari suatu pertanaman kedelai, karena diduga pada tanaman kedelai yang sehat terdapat bakteri yang bersifat antagonis terhadap jamur patogen, itulah yang menyebabkan tanaman kedelai tersebut bebas dari
penyakit yang disebabkan oleh jamur patogen. Kedelai yang akan dijadikan sampel diambil dari beberapa lokasi di Kabupaten Deli Serdang.
Untuk mengisolasi bakteri endofit, pertama-tama dipotong seluruh daun kedelai sehingga yang tertinggal hanya batang, akar, dan nodul, lalu cuci dengan air hingga bersih. Setelah bersih, di potong masing-masing bagian tersebut dan tempatkan pada beaker glass steril. Rendam bagian-bagian tersebut dengan Na3OCl 5,25 % selama 5 menit, kemudian bilas dengan aquades steril, lakukan pembilasan ini sebanyak 3 kali. Setelah itu gerus masing-masing bagian (akar, batang, nodul) dengan menggunakan mortal steril dan tambahkan aquades steril secukupnya.
Hasil gerusan tersebutlah yang akan ditanam kedalam media (NA) dengan perlakuan : langsung tanam (tanpa pengenceran), pengenceran 10-1 dan pengenceran 10-2. Selanjutnya inkubasi pada temperatur kamar selama 2-3 hari.
4.5. Isolasi Jamur Sclerotium rolfsii Sacc
Jamur diisolasi dari tanaman kedelai yang terserang penyakit rebah semai (Sclerotium rolfsii Sacc.). dimana pada tanaman yang terserang penyakit ini biasanya timbul sclerotia pada pangkal batang. Sclerotia inilah yang dibiakkan pada media PDA setelah sebelumnya direndam dengan larutan klorox 0,1 % selama 3 menit. Setelah ditanam diinkubasi selama 2-3 hari.
4.6. Identifikasi Jamur
Jamur yang tumbuh pada media biakan diambil kemudian diamati dibawah mikroskop untuk diidentifikasi.
4.7. Identifikasi Morfologi Koloni Bakteri
Bakteri endofit yang berhasil diisolasi dan telah murni ditumbuh biakan dalam media NA cawan dengan metode streak kuadran. Setelah diinkubasi selama ± 48 jam kemudian diamati morfologi koloni bakteri tersebut. Adapun yang diamati adalah : warna, ukuran, bentuk, elevasi, permukaan, dan margin dari masing-masing koloni bakteri endofit.
4.8. Identifikasi Morfologi Sel Bakteri
Biakan murni bakteri endofit yang telah ditanam pada cawan petri diidentifikasi morfologi sel nya dengan cara pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram.
• Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana dilakukan dari biakan cair dan biakan padat. Bila menggunakan biakan cair, biakan dikocok terlebih dahulu setelah itu pindahkan setetes biakan keatas objek glass dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jika menggunakan biakan padat, maka biakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata. Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali). Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue, Safranin, Crystal Violet) dan tunggu kurang lebih 30 detik. Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue.
Gambar 5 : Prosedur pewarnaan sederhana
Sumber: http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-5.html
• Pewarnaan Gram
Dengan menggunakan metode ini bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar yaitu : (1) organisme yang dapat menahan kompleks warna ungu kristal iodium sampai akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap dan ungu), disebut Gram positif; (2) organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alcohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna tandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut Gram negatif. Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya, pewarnaan Gram disebut juga pewarnaan differential.
Langkah pertama yang dilakukan adalah menyediakan olesan bakteri yang telah difiksasi panas, kemudian genangi olesan bakteri dengan pewarna primer yaitu kristal ungu selama 1 menit, miringkan kaca obyek diatas bak warna lalu dibilas dengan air dari botol pijit. Setelah itu genangi olesan dengan iodium Gram selama 2 menit. Setalah 2 menit cucilah olesan itu dengan pemucat
warna yaitu etanol 95 %, tetes demi setetes selama 30 detik atau sampai zat warna ungu kristal tidak lagi terlihat mengalir dari kaca obyek, kemudian cuci segera dengan air dari botol pijit lalu tiriskan. Genangi olesan dengan pewarna tandingan yaitu safranin selama 30 detik, miringkan kaca obyek untuk membuang kelebihan safranin, lalu bilaslah dengan air dari botol pijit. Tiriskan kaca obyek dan seraplah kelebihan air pada obyek dengan kertas serap. Kemudian amati di bawah mikroskop.
Gambar 6 : Prosedur pewarnaan Gram
Sumber : http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-5-html.
4.9. Uji Motilitas Bakteri Endofit
Tanam biakan pada media NA tegak atau Media Motilitas dengan cara tusuk (Stab inoculation) sedalam ± 5 mm. Kemudian inkubasi pada suhu 370 C
selama 1x 24 jam, setelah itu diamati pertumbuhan bakteri. Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan.
4.10. Uji Pendar Flour
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui bakteri mana dari beberapa isolat bakteri endofit yang didapat yang merupakan bakteri pendar flour.
Pengujian dilakukan dengan cara membiakkan bakteri endofit dalam media king’s B, setalah bakteri tumbuh pada kemudian bakteri dipaparkan dengan sinar ultra violet. Bakteri yang pendar flour akan kelihatan berwarna hijau kebiruan.
4.11. Uji antagonisme bakteri endofit terhadap jamur Sclerotium rolfsii Sacc. • Metode Dua Biakan (Koloni jamur + Koloni bakteri endofit)
Uji antagonisme dilakukan dengan cara menanam koloni dari biakan murni bakteri endofit dan jamur Sclerotium rolfsii Sacc. pada satu cawan petri. Kedua koloni tersebut diletakkan secara berhadapan. Selanjutnya diamati pertumbuhan dan zona hambat (inhibiting zone) dari bakteri dan jamur tersebut.
Gambar 7 : Metode dua biakan (Koloni jamur + Koloni bakteri endofit) (Purwantisari, 2009)
X Y
X = Koloni jamur S. rolfsii
• Metode Dua Biakan (Koloni jamur + Kertas saring yang ditetesi suspensi bakteri endofit)
Uji antagonisme dilakukan dengan cara menanam koloni dari biakan murni jamur Sclerotium rolfsii Sacc. pada satu sisi cawan petri dan disisi lain diletakkan potongan kertas saring yang sama ukurannya dengan koloni jamur, setelah itu diteteskan 10 µ l suspensi bakteri endofit ke atas kertas saring tersebut. Cawan petri diinkubasi pada suhu 300 selama 1-7 hari atau hingga terbentuk inhibiting zone.
X = koloni dari biakan murni jamur S. rolfsii Y = kertas saring yang ditetesi susppensi
bakteri endofi
Gambar 8 : Metode dua biakan (Koloni jamur + Kertas saring yang ditetesi suspensi bakteri endofit)
• Metode Pencampuran Jamur Pada Media Tanam (PDA)
Uji antagonisme dengan cara ini dilakukan dengan cara sebagai berikut : jamur S. rolfsii ditumbuhkan dalam media kemudian dilarutkan menggunakan aquades steril, suspensi yang didapat ditransfer ke dalam cawan petri sebanyak kurang lebih 1 ml kemudian dituangkan potato dextrose agar (PDA) yang bersuhu 35-400 C kedalam cawan petri tersebut, media digoyang agar homogen dan didiamkan beberapa saat hingga dingin dan beku, setelah itu diletakkan kertas saring steril berdiameter 0,5 cm tepat ditengah-tengah cawan petri. Kemudian teteskan suspensi bakteri endofit sebanyak 10 µ l yang sebelumnya telah dibiakkan
dalam larutan garam fisiologis tepat diatas kertas saring. Cawan petri diinkubasi pada suhu 300 selama 1-3 hari.
Gambar 9 : Metode pencampuran jamur ke media tanam (PDA) (Melliawati, dkk. 2006)
4.12. Menghitung Luas Miselium Jamur dan Luas Koloni Bakteri Endofit Luas miselium jamur S. rolfsii dan luas koloni bakteri endofit dihitung dengan menggunakan planimeter.
Gambar 10 : Planimeter Sumber : Foto Langsung
Adapun prosedur penggunaan planimeter adalah sebagai berikut : Diletakkan objek yang akan diukur diatas meja Diletakkan planimeter diatas meja yang rata, kemudian ditimpahkan tracer tepat diatas objek yang akan diukur luas nya. Setelah itu gerakkan tracer mengikuti alur/garis dari objek yang akan diukur. Dilihat berapa luas dari objek yang diukur pada angka di skala yang tertera di planimeter.
Media tanam yang telah dicampur dengan suspensi jamur S. rolfsii
Kertas saring yang ditetesi suspensi bakteri endofit