Sterilisasi Alat
Sterilisasi bermanfaat untuk membersihkan seluruh alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan sehingga terbebas dari hal-hal yang dapat menimbulkan kontaminasi. Alat-alat tersebut dicuci dengan deterjen, kemudian dibilas dengan air, setelah itu dikeringkan. Kemudian alat seperti scalpel, pipa skala, pinset dan cawan petri dibungkus dengan kertas, sedang untuk erlenmeyer dan gelas ukur permukaannya ditutup dengan aluminium foil. Setelah itu, semua botol kultur dan alat-alat dimasukkan ke dalam autoklaf pada tekanan 17,5 psi, dengan suhu 1210C selama 60 menit.
Pembuatan Larutan Stok
Pembuatan larutan stok bertujuan untuk memudahkan pekerjaan dalam membuat media. Stok dibuat sesuai dengan komposisi media Murashige Skoog (MS) yang diaduk dalam erlenmeyer dengan konsentrasi yang lebih pekat. Setelah membuat stok garam-garam, stok harus disimpan di dalam lemari es.
Pembuatan Media
Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media dasar Murashige Skoog (MS) padat dengan penambahan NaCl dengan konsentrasi sesuai dengan perlakuan. Tahap pertama dalam pembuatan media adalah membuat larutan stok bahan kimia hara makro, hara mikro, larutan ion, sukrosa dan myo inositol.
Untuk pembuatan media 4 liter dilakukan dengan mengisi beaker glass dengan aquadest steril sebanyak 500 ml. Kemudian ditambahkan 120 g sukrosa,
hara makro, hara mikro, 0,4 g myo-inositol, dan larutan ion. Selanjutnya ditambahkan vitamin sebanyak 20 ml yang diambil dari larutan stok, sambil diaduk dengan menggunakan magnetik stirrer. Penambahan bahan-bahan tersebut harus dilakukan secara berurutan dan bahan-bahan tersebut harus larut secara homogen, setiap bahan yang dimasukkan harus larut terlebih dahulu sebelum masuk bahan berikutnya. Kemudian larutan ini dimasukkan ke dalam gelas ukur setelah itu ditambahkan aquadest steril hingga volume mencapai 4 liter sambil diaduk hingga merata. Lalu dibagi menjadi empat bagian sehingga masing-masing menjadi 1000 ml. Setiap bagian diberi Nacl sesuai dengan perlakuan. Keasaman diukur dengan menetapkan pH yang dikehendaki yaitu 5,8. Jika pH terlalu rendah maka ditambahkan NaOH secukupnya dan jika pH terlalu tinggi maka ditambahkan HCl secukupnya.
Tepung agar sebanyak 3,2 g ditambahkan ke dalam setiap perlakuan sesuai dengan kebutuhan, lalu dipanaskan di atas piring pemanas dengan pengaduk magnetik sampai larutan menjadi bening (semua agar telah larut). Media siap dipindahkan ke dalam botol kultur steril dan dibagi sesuai dengan banyak ulangan serta jumlah sampel. Setiap botol berisi 20 ml media. Kemudian botol tersebut ditutup dengan aluminium foil dan diberi label sesuai dengan perlakuan. Media dalam botol tersebut disterilkan dengan menggunakan autoklaf dengan tekanan 17,5 psi, suhu 1210C selama 15 menit. Selanjutnya dapat disimpan dalam ruang kultur dengan suhu 240 C sebelum digunakan.
Sterilisasi Bahan Tanaman
Biji-biji kedelai direndam dalam larutan deterjen 30g/l akuades selama 30 menit. Setelah itu dibilas dengan akuades steril sebanyak tiga kali. Kemudian
direndam lagi dalam larutan Benlate 2 g/l selama 15 menit, dan setelah itu dibilas dengan akuades steril sebanyak tiga kali. Selanjutnya dilakukan sterilisasi biji kedelai didalam laminar air flow. Sebelum memakai laminar air flow, laminar air flow dibersihkan dan meja lap dengan kertas tissue atau kapas yang diberi alkohol 96%. Kemudian biji kacang kedelai disterilkan dengan larutan Clorox 20 % selama 10 menit, dan direndam dalam larutan betadin 10 % selama 5 menit.Pada setiap tahap biji-biji kacang kedelai dibilas dengan akuades steril sebanyak tiga kali.
Penanaman Eksplan
Penanaman eksplan dilakukan di Laminar Air Flow (LAF) yang telah disterilkan dengan alkohol 96%. Eksplan yang sudah steril diletakkan di petridis. Diambil botol media lalu di dekatkan dengan api bunsen kemudian eksplan ditanamkan ke dalam botol media sesuai dengan perlakuan, setiap botol media terdapat 3 eksplan. Setelah itu botol media dikembalikan ke dalam ruang kultur.
Pemeliharaan
Botol-botol yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak kultur di dalam ruang kultur. Setiap hari disemprot dengan alkohol 96% agar bebas dari organisme yang menyebabkan terjadi kontaminasi.
Parameter Pengamatan
Persentase Hidup (%)
Kultur dikatakan hidup adalah berwarna hijau, secara visual ukuran bertambah, berat bertambah dan biji menghasilkan organ tanaman
(organogenesis).
Persentase hidup dihitung pada akhir penelitian dengan rumus: Persentase Hidup =
Panjang Akar (cm)
Panjang akar dihitung dari pangkal hingga ujung akar planlet. Pengukuran dilakukan di akhir penelitian.
Tinggi Planlet (cm)
Tinggi planlet diukur dengan menggunakan kertas millimeter yang diukur dari pangkal planlet hingga titik tumbuh planlet. Pengukuran tinggi planlet dilakukan pada akhir penelitian.
Jumlah Daun (helai)
Jumlah daun dihitung dari daun yang terbentuk (daun semu) yang telah terbuka sempurna dari setiap planlet. penghitungan jumlah daun dilakukan pada akhir penelitian.
Volume Akar (ml)
Volume akar diukur dengan cara mencabut tanaman hingga ke akar. Kemudian akar dibersihkan dengan air bersih dan dimasukkan ke dalam beaker glass yang berisi air. Volume air yang naik akibat dimasukkannya akar, dicatat sebagai volume akar.
Bobot Basah Akar (g)
Bobot basah akar dihitung dengan menimbang semua bobot basah akar yang terbentuk pada setiap planlet. Pengukuran bobot basah akar dilakukan pada akhir penelitian.
Bobot Kering Akar (g)
Bobot kering akar dihitung dengan menimbang semua bobot kering akar yang sudah diovenkan selama 14 jam. Pengukur an bobot kering akar dilakukan pada akhir penelitian.
Bobot Basah Tajuk (g)
Bobot basah tajuk dihitung dengan menimbang semua bobot basah tajuk yang terbentuk pada setiap planlet. Pengukuran bobot basah tajuk dilakukan pada akhir penelitian.
Bobot Kering Tajuk (g)
Bobot kering akar dihitung dengan menimbang semua bobot kering tajuk yang sudah diovenkan salama 14 jam. Pengukuran bobot kering tajuk dilakukan diakhir penelitian.