Persiapan lahan dilakukan pada minggu pertama dengan membersihkan lahan dari segala macam gulma dan sampah yang ada di sekitar areal penelitian.
Kemudian dibuat blok dengan ukuran jarak antar blok 10 cm dan jarak antar polybag tanaman 20 cm.
Pembuatan Media Tanam
Media tanam yang digunakan adalah campuran top soil, sekam, dan kompos dengan perbandingan 1 : 1 : 1 yang seluruhnya dicampur secara homogen.
Pembuatan Larutan Kolkisin
Pembuatan larutan kolkisin dilakukan dengan cara pengenceran kolkisin Agro Biotech dengan konsentrasi 100 ppm menjadi 50 ppm. Untuk konsentrasi 50 ppm dilakukan dengan cara melarutkan 25 ml kolkisin, kemudian ditambahkan aquadest sampai volumenya 50 ml. Sedangkan konsentrasi 100 ppm dilakukan dengan cara mengambil kolkisin sebanyak 50 ml tanpa ditambahkan aquadest.
Persiapan Benih
Benih direndam selama 12 jam dengan menggunakan larutan kolkisin sesuai dengan konsentrasi.
Penanaman Benih
Langkah pertama adalah mengisi media tanam sampai penuh kedalaman polybag. Benih dikeluarkan dari wadah perendaman, setelah itu masukkan benih tepat di tengah-tengah polybag dan menimbunnya dengan media. Lalu menyiram tanahnya dengan air biasa hingga kondisi lapang. Penanaman dilakukan pada sore hari.
Pemeliharaan Tanaman Penyiraman
Penyiraman dilakukan dua kali sehari, disesuaikan dengan kondisi tanaman di lapangan. Penyiraman dilakukan dengan menggunakan gembor, setiap tanaman diusahakan mendapatkan jumlah air yang sama yaitu 1 L per tanaman.
Penyiraman dilakukan dengan membasahi media tanah hingga kapasitas lapang tanpa membasahi tanaman. Hal ini dilakukan untuk mencegah tanaman menjadi busuk, karena tanaman sangat rentan terhadap kelembaban yang tinggi.
Penyiraman dilakukan pada pagi hari dan sore hari.
Pemupukan
Pemupukan dilakukan dengan menggunakan pupuk NPK dengan perbandingan 16 : 16 : 16 dengan dosis 5 gram/ tanaman yang diberikan pada 10 HST, lalu 10 gram/ tanaman yang diberikan pada 24 HST dan 15 gram/ tanaman yang diberikan pada 38 HST.
Penyiangan (Pengendalian Gulma)
Penyiangan dilakukan secara manual dengan mencabut rumput yang berada di dalam pot. Penyiangan dilakukan sesuai dengan kondisi di lapangan.
Pengendalian Hama dan Penyakit
Pengendalian hama dilakukan secara manual dengan menangkap hama yang terlihat di sekitar tanaman. Di lapangan dilakukan penyemprotan fungisida berbahan aktif mankozeb 80% 2 gram/liter air. Pengendalian dilakukan tergantung pada tingkat serangan hama dan penyakit di lapangan.
Analisis Kromosom Pengambilan Bahan
Pengambilan bahan dilakukan dengan mengambil akar tanaman yang telah berumur 3 minggu dengan panjang ± 0,5 cm dari ujung akar. Ujung akar yang dipotong lalu dicuci dengan air yang bersih. Pemotongan akar dilakukan pada pukul 08.00 – 09.00 WIB. Penggunaan ujung akar sebagai bahan pembuatan sediaan karena ujung akar merupakan organ yang aktif mengalami pertumbuhan (meristematis) (Setyawan dan Sutikno, 2000).
Fiksasi
Fiksasi dilakukan dengan merendam ujung akar kedalam larutan asam asetat glasial 45% dan disimpan selama 15 menit pada suhu ruang (± 25oC).
Hidrolisis
Hidrolisis dilakukan dengan merendam akar kedalam asam klorida 1N lalu didiamkan selama 10 menit dengan suhu kamar. Kemudian akar dibilas dengan air suling sebanyak 3 kali.
Setyawan dan Sutikno (2000) menyatakan bahwa hidrolisis dilakukan untuk mendapatkan sel-sel yang menyebar didalam pengamatan kromosom.
Hidrolisis ini dapat menggunakan asam atau enzim hidrolase, salah satunya adalah asam klorida (HCl).
Pewarnaan
Aseto carmine sangat cocok dgunakan untuk pewarnaan ujung akar karena penetrasinya yang cepat dan tahan lama, namun dalam penyimpanan lama (misalnya setahun) penetrasinya menjadi turun, timbul lapisan film di permukaan cairan dan mengendap. Oleh karena itu dibutuhkan waktu yang lebih lama untuk
penetrasi serta harus digojog dan disaring sebelum digunakan lagi. Pewarnaan dilakukan dengan memasukkan ujung akar kedalam larutan acetocarmin 2% pada sehu kamar selama 10 menit Setyawan dan Sutikno, 2000).
Pengamatan Kromosom
Metode squash merupakan suatu metode yang digunakan untuk menghasilkan suatu preparat dengan cara meremas suatu potongan jaringan atau suatu organisme secara keseluruhan, agar dihasilkan sediaan yang tipis dan dapat diamati dibawah mikroskop (Abisin, 2014). Metode squash biasanya digunakan untuk melihat proses mitosis pada akar bawang.
Ujung akar yang telah diwarnai diambil lalu diletakkan diatas kaca preparat dan dipotong dengan panjang 1-2 mm dari ujung kemudian di tetesi dengan larutan asam asetat 45%. Kemudian sisa pewarna dan larutan asam asetat yang terdapat pada kaca preparat dibersihkan dengan tissue. Kemudian preparat ditutup dengan cover glass dan di squash dengan ibu jari lalu diketuk-ketuk dengan menggunakan pensil berkaret.
Squash yang baik menghasilkan preparat yang hanya terdiri dari selapis sel, terpisah-pisah, tidak tumpang tindih, dan tidak terpecah-pecah. Setelah proses squash, tepi gelas penutup disegel dengan cat kuku bening. Penyegelan ini bertujuan untuk membuat preparat lebih awet serta mencegah kekeringan preparat (Setyawan dan Sutikno, 2000). Selanjutnya, preparat disegel dengan mengguna-kan cat kuku pada seluruh sisi cover glass agar preparat tidak mengering. Preparat diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000x.
Pengamatan Parameter Tinggi Tanaman (cm)
Tinggi tanaman diukur mulai dari pangkal batang sampai dengan titik tumbuh tanaman dengan menggunakan meteran. Pengukuran tinggi tanaman dilakukan pada tiap minggu hingga akhir penelitian (9 MST).
Diamater Batang (mm)
Diameter batang diukur pada bagian batang bawah dengan ketinggian 1 cm diatas permukaan tanah dengan menggunakan jangka sorong. Pengukuran dilakukan pada awal masa generatif (9 MST)
Jumlah Tangkai Daun
Jumlah tangkai daun dihitung pada daun yang telah membuka sempurna.
Jumlah tangkai daun dihitung pada tiap minggu hingga akhir penelitian (9 MST).
Panjang dan Lebar Stomata
Panjang dan lebar stomata diukur dengan melakukan pengamatan mikrokopis. Daun yang dijadikan sebagai sampel penelitian yaitu daun yang sudah berwarna hijau tua dan daun keempat dari pucuk tanaman. Permukaan epidermis bawah daun diolesi cat kuku, lalu biarkan mengering 5-10 menit.
Setelah mengering, bagian yang diolesi cat kuku di tutup dengan lakban. Lalu lakban ditarik perlahan hingga bagian epidrmis daun tertempel. Setelah itu, epidermis yang tertempel dilakban diletakkan diatas preparat. Preparat diamati dengan mikroskop yang telah terhubung dengan optilab. Panjang dan lebar stomata ditentukan dengan menggunakan program optilab.
Morfologi Daun
Pengamatan parameter morfologi daun diamati dengan scoring menggunakan panduan UPOV (2007). Karakter morfologi daun marigold diamati secara visual dengan skoring. Skor menggunakan skala 1 sampai dengan 9. Nilai 0 menunjukkan bahwa deskriptor tidak dapat diobservasi. Skor adalah suatu intensitas ekspresi dari deskriptor, menggunakan kunci sebagai berikut 1 = sangat rendah, 3 = rendah, 5 = intermediate, 7 = tinggi, 9 = sangat tinggi. Pengamatan parameter daun diamati pada saat akhir penelitian (9 MST). Parameter morfologi daun sebagai berikut:
a. Tipe Daun
Mengamati tipe daun dan mengelompokkan sebagai acuan.
1. Simple (sederhana) 2. Pinnate (Menyirip)
Gambar 1. Tipe daun
b. Panjang Daun
Memilih 2 daun yang berada di tengah batang utama pada waktu mekar.
Mengukur panjang daun dan mengelompokkan sesuai acuan.
1. Short (Pendek) 2. Medium (menengah) 3. Long (panjang)
Gambar 2. Daerah ukur panjang daun c. Lebar Daun
Memilih 2 daun yang berada di tengah batang utama pada waktu mekar.
Mengukur panjang daun dan mengelompokkan sesuai acuan.
1. Narrow (sempit) 2. Medium (menengah) 3. Broad (luas)
Daerah Ukur (cm)
Gambar 3. Daerah ukur lebar daun Daerah ukur (cm)
Morfologi Bunga
Pengamatan parameter morfologi daun diamati dengan scoring menggunakan panduan UPOV (2007). Karakter morfologi daun marigold diamati secara visual dengan skoring. Skor menggunakan skala 1 sampai dengan 9. Nilai 0 menunjukkan bahwa deskriptor tidak dapat diobservasi. Skor adalah suatu intensitas ekspresi dari deskriptor, menggunakan kunci sebagai berikut 1 = sangat rendah, 3 = rendah, 5 = intermediate, 7 = tinggi, 9 = sangat tinggi. Pengamatan parameter daun diamati pada saat akhir penelitian (9 MST). Parameter morfologi daun sebagai berikut:
a. Panjang Tangkai Kepala Bunga Terminal
Mengamati panjang tangkai kepala bunga terminal dan mengelompokkan sesuai acuan.
1. Short (pendek) 2. Medium (menengah) 3. Long (panjang) b. Tipe Kuntum
Mengamati tipe kuntum dan mengelompokkan sesuai acuan.
1. All tubulate (semua tubulat)
2. Tubulate and ligulate (tubulat dan ligulat)
3. Tubuligulate and ligulate (tubuligulat dan ligulat) 4. All tubuligulate (semua tubuligulat)
5. All ligulate (semua ligulat)
Gambar 4. Tipe kuntum c. Diameter Bunga
Mengamati diamter bunga dan mengelompokkan sesuai acuan.
1. Very small (sangat kecil) 2. Small (kecil)
3. Medium (menengah) 4. Large (besar)
case (1) case (2)
Case (3) case (4)
d. Jumlah Warna Pada Bunga
Mengamati jumlah warna pada bunga dimana kepala bunga dianggap memiliki dua warna jika 1. Kuntum disc (zona tengah) berbeda warna dengan kuntum ray (zona pinggir); 2. Kuntum disc (zona tengah) dan kuntum ray (zona pinggir) dengan tipe kuntum yang sama berbeda warna 3. Kuntum disc (zona tengah) tipe tubulat atau tipe tubuligulat berbeda warna dan kuntum ray (zona pinggir) tipe ligulat memiliki salah satu dari warna tersebut 4. Kuntum ray (zona pinggir) tipe ligulat berbeda warna dan kuntuk disc (zona pinggir) memiliki salah satu dari warna tersebut. Lalu mengelompokkan sesuai acuan.
1. One (satu) 2. Two (dua)
Gambar 5. Jumlah warna pada bunga e. Waktu Mulai Berbunga
Mengamati waktu mulai munculnya bunga dan mengelompokkan sesuai acuan.
1. Early 2. Medium