Tiga pasang primer (CfF2-CfR3, CfF3-CfR4, CfF4-CfR5) dari sepuluh pasang kombinasi primer yang disusun (CfF2-CfR2, CfF2-CfR3, CfF2-CfR4, CfF2-CfR5, CfF3-CfR3, CfF3-CfR4, CfF3-CfR5, CfF4-CfR4, CfF4-CfR5, CfF5- CfR5) berhasil mengamplifikasi empat ekson gen endoglukanase C. curvignathus. Walaupun hanya tiga pasang primer yang berhasil mengamplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus, sudah mencakup semua ekson target.
Tujuh kombinasi primer yang tidak berhasil mengamplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus mungkin disebabkan karena primer yang disusun berdasarkan CfEG tidak cocok sehingga tidak menempel pada target yaitu gen endoglukanase C. curvignathus. Ketidakcocokan ini karena adanya perbedaan nukleotida primer dengan gen endoglukanase C. curvignathus yaitu pada primer CfR2 (Gambar 8a). Primer dapat bekerja dengan baik apabila sekuen nukleotida primer cocok dengan lokasi gen target yang akan saling berkomplemen (Hillis et al. 1996). Daerah yang digunakan sebagai template adalah daerah yang conserve dari gen target yang akan mendukung kecocokan dari primer (Birt & Baker 2000). Kemungkinan yang lain adalah perbedaan suhu penempelan primer yang berbeda jauh antara primer forward dan reverse (3-17 0C) serta adanya struktur hairpin dan dimer. Penentuan suhu penempelan primer adalah langkah yang paling penting di dalam proses PCR (Koressaar & Remm 2007). Struktur sekunder pada primer dapat menyebabkan masalah selama proses PCR, sehingga perlu dihindari sekuen yang saling berkomplemen di dalam primer (hairpin) atau sekuen yang saling berkomplemen antara primer forward dan reverse (primer-dimer) itu sendiri (Newton & Graham 1997; McDowell 1999; Birt 2000; Rapley 2000).
Kesulitan dalam menyusun primer disebabkan keterbatasan data gen endoglukanase rayap yang ada. Data gen endoglukanase rayap yang ada terbatas pada daerah subtropik atau pada genus dan famili yang berbeda (Mastotermitidae, Hodotermitidae, Termopsidae, Kalotermitidae, dan Termitidae). Selain itu, sebagian besar data yang ada merupakan data sebagian (partial) dari gen endoglukanase (Watanabe et al. 1998; Tokuda et al. 1999, 2004; Lo et al. 2000; Nakashima et al. 2002b; Li et al. 2003; Scharf et al. 2005; Itakura et al. 2006).
28
Homologi DNA dan Asam Amino Putative Gen Endoglukanase C.
curvignathus dan C. formosanus
Berdasarkan analisis homologi diketahui bahwa ekson dua sampai lima gen endoglukanase C. curvignathus yang berhasil dikarakterisasi juga terdapat pada CfEG. Persentase homologi antara gen endoglukanase C. curvignathus dengan CfEG (EU853671) sebesar 95%. Asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus memiliki homologi dengan asam amino CfEG. Homologi asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus dengan asam amino CfEG (BAB40696) sebesar 94%.
Semakin tinggi nilai homologi menunjukkan bahwa sekuen gen endoglukanase C. curvignathus terhadap CfEG semakin tepat. Dua fragmen DNA dikatakan homolog jika 70% sekuen basa atau 25% sekuen asam amino identik (panjang sekuen minimal 100 pasang basa) (Claviere & Notredame 2003).
Nilai probabilitas atau peluang yang terhitung secara statistik dalam kesamaan sekuen antara gen endoglukanase C. curvignathus dan CfEG di GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) digambarkan dengan nilai Expectation value (E-value). Ekson dua sampai lima gen endoglukanase C. curvignathus memperlihatkan nilai E-value yang rendah dibandingkan CfEG yaitu 0.0. Nilai E- value yang rendah juga terlihat pada asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus yaitu sebesar 9e-92. Hasil BLASTP asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus ini signifikan. Pada analisis melalui BLAST, E- value signifikan apabila nilainya 1e-10 atau lebih kecil (Altschul et al. 1990).
Berdasarkan penelitian ini terdapat perbedaan sekuen DNA antara gen endoglukanase C. curvignathus dengan CfEG. Perbedaan tersebut terlihat dari hasil alignment antara sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan CfEG. Besarnya ukuran gen endoglukanase C. curvignathus yang telah berhasil dikarakterisasi pada penelitian ini adalah 564 pb. Sedangkan CfEG yang telah dikarakterisasi Nakashima et al. (2002) totalnya 1347 pb. Hal ini menandakan bahwa sebagian besar gen endoglukanase C. curvignathus belum diketahui sekuennya dan perlu dikarakterisasi.
29
Analisis Filogeni dan Jarak Genetik Gen Endoglukanase C. curvignathus
Analisis filogeni membandingkan 188 asam amino gen endoglukanase C. curvignathus dengan sekuen endoglukanase fungi, protozoa simbion rayap, bakteri, echinodermata, cacing tanah, dan moluska, didapatkan dua kelompok terpisah (Gambar 14). Pertama adalah kelompok GHF 9 yang terdiri atas rayap, echinodermata, cacing tanah, dan moluska. Kelompok GHF 9 terbagi menjadi dua sister group yaitu kelompok rayap dan kelompok bakteri, echinodermata, cacing tanah, dan moluska. Hal ini didukung dengan nilai bootstrap yang tinggi (100%). Kedua adalah kelompok GHF 7 yang terdiri dari fungi dan protozoa. Hal ini didukung oleh Davison & Blaxter (2005) dan Zhou et al. (2007), analisis filogeni sekuen selulase dari fungi, protozoa simbion rayap, eubakteria, dan metazoan mengelompokkan taksa yang berbeda menjadi dua kelompok yaitu GHF 9 dan GHF 7. Kelompok GHF 9 terdiri atas endoglukanase metazoa (Annelida, Arthropoda, Chordata, Echinodermata, dan Moluska) dan eubakteria, sedangkan kelompok GHF 7 terdiri atas endoglukanase fungi dan protozoa. Hal ini menunjukkan bahwa selulase protozoa simbion rayap berbeda dengan selulase pada rayap.
Gen endoglukanase C. curvignathus termasuk ke dalam kelompok GHF 9. Endoglukanase rayap termasuk ke dalam GHF9. Anggota GHF 9 rayap terdiri dari endoglukanase rayap tingkat tinggi (Tokuda et al. 1999, 2004; Watanabe & Tokuda 2001) dan rendah (Nakashima et al. 2002b). Berdasarkan analisis DNA mitokondria, rayap tingkat rendah (Mastotermitidae, Hodotermitidae, Termopsidae, Kalotermitidae, Serritermitidae, Rhinotermitidae) berada pada basal dan lebih primitif dibandingkan dengan rayap tingkat tinggi (Termitidae) yang lebih maju (Kambhampati & Eggleton 2000; Austin et al. 2004). Coptotermes curvignathus dan C. formosanus termasuk ke dalam rayap tingkat rendah, sedangkan N. takasagoensis termasuk ke dalam rayap tingkat tinggi.
Kekerabatan terdekat gen endoglukanase C. curvignathus dengan endoglukanase rayap yang lain adalah dengan gen endoglukanase C. formosanus EG3, C. formosanus, dan C. formosanus EG4 yang memiliki jarak genetik terkecil (0.055), sedangkan kekerabatan terjauh adalah dengan gen endoglukanase N. takasagoensis dengan jarak genetik terbesar (0.174). Semakin kecil nilai jarak
30
genetik maka semakin dekat kekerabatan antar taksa yang dibandingkan dan semakin besar nilai jarak genetik maka semakin jauh kekerabatannya (Nei & Kumar 2000).
Coptotermes curvignathus dan C. formosanus termasuk ke dalam famili Rhinotermitidae, sedangkan N. takasagoensis termasuk ke dalam famili Termitidae. Famili yang berbeda pada rayap memiliki perbedaan perilaku, misalnya habitat dan jenis makanan. Perilaku merupakan respon hewan terhadap lingkungan dan melibatkan beberapa gen (Sokolowski 2001). Lingkungan dapat memberikan dampak terhadap keragaman genetik (Freeland 2005; Hughes et al. 2008). Habitat dan jenis makanan C. curvignathus lebih mirip dengan C. formosanus dibandingkan dengan N. takasagoensis. Enzim yang dihasilkan pada saluran pencernaan berhubungan dengan jenis makanan rayap. Salah satu enzim yang terlibat dalam pencernaan rayap adalah gen endoglukanase. Hal ini menyebabkan C. curvignathus lebih dekat dengan C. formosanus dibandingkan dengan N. takasagoensis.
Analisis Protein Putative dan Homologi Ekspresi Gen Endoglukanase C.
curvignathus dengan C. formosanus
Alignment asam amino gen endoglukanase C. curvignathus, CfEG1 dan CfEG3 menunjukkan berada pada famili yang sama. Motif protein putative gen endoglukanase C. curvignathus menunjukkan adanya satu consensus signature GHF 9, nucleophile, co-nucleophile, salt bridge, dan N-terminal. Motif ini juga terdapat pada endoglukanase rayap yang lain (Watanabe & Tokuda 2001; Nakashima et al. 2002b). Hal ini menguatkan bahwa gen endoglukanase C. curvignathus termasuk ke dalam GHF 9.
Motif DAGD (Asp53-Ala54-Gly55-Asp56) pada Thermomonospora fusca E4 berperan sebagai penanda GHF 9 (Sakon et al. 1997) dan ditemukan pada semua endoglukanase rayap (Watanabe & Tokuda 2001). Secara spesifik consensus signature GHF 9 terdiri atas {G-[WY]-[YFH]-D-A-G-D-[HNY]- [VLG]-[KRM]-[FY]} (Sakon et al. 1997), {[STV]-x-[LIVMFY]-[STV]-x(2)-Gx- [NKR]-x(4)-[PLIVM]-H-x-R}, {[FYW]-x-D-x(4)-[FYW]-x(3)-E-x-[STA]-x(3)- N-[STA]} (Nakashima et al. 2002b).
31
Pada alignment asam amino ekson satu sampai empat gen endoglukanase C. curvignathus hanya didapatkan satu consensus signature GHF 9 yaitu {G-[WY]- [YFH]-D-A-G-D-[HNY]-[VLG]-[KRM]-[FY]} dan belum ditemukan posisi donor proton dari pusat katalitik. Pada CfEG dan NtEG memiliki tiga consensus signature GHF 9 dan adanya residu donor proton dari pusat katalitik yaitu Glu 411 pada CfEG (Nakashima et al. 2002b) dan Glu412 pada NtEG (Khademi et al. 2002). Hal ini menunjukkan bahwa gen endoglukanase C. curvignathus belum terkarakterisasi secara utuh.
Gen endoglukanase C. curvignathus masuk ke dalam famili gen GHF 9 yang termasuk ke dalam CL0059 yaitu six-hairpin glycosidase superfamily. Six- hairpin glycosidase superfamily terdiri dari 20 famili termasuk famili GHF 9. Anggota dari kelompok ini memiliki struktur yang umum yaitu terdiri dari enam hairpin yang berbentuk heliks. Hampir semua anggota six-hairpin glycosidase superfamily adalah enzim glycosyl hydrolase (Bateman et al. 1999).
Endoglukanase C. curvignathus homolog dengan CfEG (BAB40696) yang berasal dari kelenjar saliva. Hal ini bisa dilihat berdasarkan E-value sebesar 9e-92. Endoglukanase C. formosanus dihasilkan di kelenjar saliva dan usus tengah. Endoglukanase C. formosanus dapat mendegradasi selulosa kristalin membentuk glukosa. Glukosa dan gula tereduksi yang dihasilkan pada kelenjar saliva lebih besar jumlahnya dibandingkan dengan usus depan dan usus tengah. Pada usus tengah C. formosanus tidak memiliki aktivitas cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) yang diketahui dapat memutus ikatan kristalin selulosa dan menghasilkan selobiosa. Tidak ada cellobiohydrolase pada C. formosanus mungkin disebabkan karena adanya mandibula yang secara fisik dapat memecah kayu menjadi parikel- partikel yang berukuran 20-50 µm atau kurang dari 50 µm untuk C. formosanus (Nakashima et al. 2002b). Hal ini secara efektif dapat menyebabkan enzim selulolitik dengan mudah dapat mencapai substrat dengan adanya peningkatan permukaan area yang dapat terjangkau. Pemecahan partikel oleh mandibula mungkin merupakan kompensasi tidak adanya cellobiohydrolase (Watanabe & Tokuda 2001). Aktivitas ß-glukosidase (EC 3.2.1.21) yang dapat menghidrolisis selobiosa ditemukan pada kelenjar saliva dan usus tengah C. formosanus (Nakashima et al. 2002b).
32
Kelenjar saliva pada rayap memiliki struktur umum yang sama dengan Orthoptera dan Dictyoptera. Masing-masing kelenjar terdiri atas beberapa lobus atau acinus dihubungkan dengan saluran saliva yang terbuka pada bagian dasar labium (Noirot 1969). Kelenjar saliva terletak pada esofagus dan tembolok yang berada pada bagian toraks. Kelenjar saliva mensekresikan endoglukanase dan enzim lain ke dalam saluran pencernaan (Noirot & Noirot-Timothée 1969; Scharf & Tartar 2008). Saliva berfungsi untuk melubrikasi bagian mulut dan lebih banyak dihasilkan apabila makanan yang dicerna kering. Saliva juga mengandung enzim yang mengawali pencernaan makanan. Adanya beberapa enzim pada saliva berhubungan dengan makanan yang dicerna (Chapman 1998).
Pada rayap tingkat rendah, RsEG diekspresikan hanya di kelenjar saliva/usus depan dan CfEG diekspresikan di kelenjar saliva dan usus tengah (Lo et al. 2000; Nakashima et al. 2002b). Pada rayap tingkat tinggi, NtEG dan NwEG diekspresikan di usus tengah (Tokuda et al. 1999). Taksa rayap dari keturunan basal (Mastotermitidae, Termopsidae, Kalotermitidae, Rhinotermitidae) secara konsisten mengekspresikan endoglukanase secara spesifik di kelenjar saliva sedangkan taksa yang lebih maju (Termitidae) hanya pada usus tengah (Gambar 5). Hal ini menunjukkan bahwa ekspresi pada kelenjar saliva merupakan kondisi primitif kemudian terjadi pergeseran selama proses evolusi (Tokuda et al. 2004).
Pergeseran ekspresi endoglukanase berhubungan dengan beberapa hal yaitu organisme simbion, jenis makanan, dan habitat sarang. Salah satu evolusi yang terjadi pada rayap adalah hilangnya flagelata pada famili Termitidae. Adanya rayap pemakan tanah pada famili ini menunjukkan bahwa pada usus nenek moyang Termitidae mengandung tanah sehingga menyebabkan hilangnya flagelata melalui abrasi (Tokuda et al. 2004). Bakteri yang ada pada usus belakang rayap Termitidae menggantikan peran flagelata dalam mencerna selulosa. Hal ini didukung dengan adanya bakteri yang dapat mendegradasi selulosa dan xilan pada rayap Termitidae (Warnecke et al. 2007). Rayap dari famili yang berbeda atau subfamili yang berbeda pada Termitidae memakan substrat yang beragam mulai dari kayu keras, kayu busuk, serasah daun, dan tanah. Hal ini menyebabkan gen endoglukanase dari rayap dihadapkan pada tekanan selektif yang berbeda sehingga menghasilkan pola substitusi yang
33
berbeda (Tokuda et al. 2004). Hampir semua rayap tingkat rendah adalah pemakan kayu, sedangkan pada famili Termitidae selain memakan kayu sebagian besar memakan serasah dan tanah (Bignell & Eggleton 2000). Famili Nasutitermitinae dan Termitinae merupakan subfamili dari Termitidae yang memakan tanah dan serasah dimana mengandung sedikit selulosa. Hal ini menyebabkan subfamili ini mensekresikan endoglukanase hanya pada usus tengah (Tokuda et al. 1999, 2004) karena substrat yang dicerna sudah lebih sederhana dibandingkan dengan kayu. Ekspresi endoglukanase pada Macrotermitinae yang bersimbiosis dengan fungi sama dengan ekspresi rayap yang berasosiasi dengan flagellata yaitu pada kelenjar saliva (Tokuda et al. 2004). Hal ini mengindikasikan bahwa Macrotermitinae sebagai nenek moyang dari famili Termitidae merupakan subfamili yang menjadi peralihan antara antara rayap tingkat rendah dan rayap tingkat tinggi. Sedangkan pada rayap tingkat rendah (misal: C. formosanus) yang memakan kayu memerlukan proses degradasi selulosa yang lebih panjang, sehingga endoglukanase disekresikan mulai dari kelenjar saliva, usus depan, dan usus tengah (Lo et al. 2000; Nakashima et al. 2002b).
Keragaman struktur sarang pada rayap berhubungan dengan evolusi kehidupan sosial yaitu peningkatan ukuran koloni, diversifikasi sumber makanan, dan strategi makan (Noirot & Darlington 2000). Macrotermitinae yang merupakan basal dari Termitidae adalah rayap yang berasosiasi dengan fungi. Kemampuan bertahan hidup subfamili Macrotermitinae tanpa adanya flagellata pada saluran pencernaan adalah karena adanya kemampuan selulolitik dari fungi yang berasosiasi dengan Macrotermitinae. Peranan fungi bagi rayap Macrotermitinae adalah mendegradasi lignin sehingga memungkinkan rayap untuk menggunakan selulosa dengan lebih efisien dan selulase yang dihasilkan oleh rayap sendiri dapat dengan mudah mendegradasi selulosa (Hyodo et al. 2000). Selain itu fungi juga berperan sebagai sumber makanan. Rayap Macrotermitinae lebih banyak menggunakan substrat yang sudah dicerna oleh fungi dibandingkan dengan material tanaman (Hyodo et al. 2003). Rayap Macrotermitinae menggunakan konidiofor dari fungi sebagai sumber selulase yang merupakan tahap awal pencernaan selulosa, sedangkan bakteri simbion berperan secara keseluruhan pada aktivitas selulase di bagian usus belakang rayap (Abo-Khatwa 1978).
34
Homologi Genomik dan Aktivitas Selulase Gen Endoglukanase C.
curvignathus, C. formosanus, dan N. takasagoensis
Intron adalah bagian dari utas DNA yang tidak ditranskripsi menjadi mRNA karena telah dipotong dan dikeluarkan dari utas DNA sebelum proses transkripsi berlangsung (Page & Holmes 1998). Intron pada gen endoglukanase C. curvignathus memiliki posisi yang identik dengan intron pada NtEG (Gambar 8) dan memiliki pola pemotongan yang umum yaitu diawali dengan nukleotida GT dan diakhiri dengan AG (Gambar 7). Semua intron pada NtEG juga memiliki pola pemotongan yang sama (Tokuda et al. 1999). Situs penyambung intron pada inti dikenali oleh spliceosome pada dinukleotida yang conserve yaitu GT pada ujung 5’ intron dan AG pada ujung 3’ intron. Pengenalan situs penyambung ini terjadi sekitar 99% dari daerah sambungan intron pada sebagian besar organisme (Deutsch & Long 1999). Karakteristik lain intron gen endoglukanase C. curvignathus adalah didominasi oleh basa AT. Sekuen yang didominasi oleh basa T merupakan karakteristik yang membedakan intron pada tumbuhan dan metazoan (Lorkovic et al. 2000).
Perbedaan antara CfEG dan NtEG adalah adanya penambahan satu ekson dan intron pada NtEG. Adanya penambahan ini merupakan hasil dari proses evolusi. Berdasarkan exon theory of genes, gen yang pertama terbuat dari potongan yang kecil yang menghasilkan 15-20 asam amino. Kemudian terjadi proses evolusi yaitu rekombinasi di dalam intron, penyisipan intron untuk mengubah sekuen asam amino di sekitar batas yang mengubah struktur gen tetapi tidak mempengaruhi struktur protein. Penambahan satu intron pada NtEG mungkin disebabkan adanya penyisipan selama evolusi untuk mengubah gen sebelumnya (introns-late view) (Gilbert et al. 1997).
Apabila dibandingkan secara keseluruhan antara CfEG dan NtEG terdapat perbedaan struktur ekson dan intron. NtEG memiliki sepuluh ekson, sedangkan CfEG hanya memiliki sembilan ekson. Panjang ekson NtEG adalah 1685 pb dan CfEG 1347 pb. Tetapi CfEG dan NtEG memiliki posisi awal dan akhir translasi yang sama (Lampiran 9). Jumlah asam amino yang dihasilkan (Lampiran 10) juga sama yaitu 448 asam amino (Tokuda et al. 1999; Nakashima et al. 2002b). Hal ini mungkin disebabkan karena adanya posttranscriptional controls, yaitu suatu
35
kontrol untuk mengatur jumlah produk gen yang dibuat. Pada transkripsi beberapa gen eukariot diperpendek melalui RNA splicing. Sel dapat memotong primary transcript melalui cara yang berbeda sehingga menghasilkan rantai polipeptida yang berbeda dari gen yang sama. Proses ini disebut alternative RNA splicing. Proses ini digunakan untuk mengubah produksi dari suatu protein yang nonfungsional menjadi protein fungsional (Alberts et al. 2002). Kesamaan posisi awal dan akhir translasi serta jumlah asam amino yang sama mengindikasikan bahwa jumlah ekson yang lebih panjang pada NtEG dibandingkan dengan CfEG tidak menjadi beban pada NtEG.
Walaupun jumlah asam amino yang dihasilkan CfEG dan NtEG sama, akan tetapi CfEG dan NtEG memiliki aktivitas selulase yang berbeda. Pada saluran pencernaan (kelenjar saliva, usus depan, usus tengah) menunjukkan aktivitas selulase CfEG lebih besar dibandingkan dengan NtEG. Aktivitas selulase CfEG terhadap selulosa kristalin dan carboxymethyl-cellulose lebih tinggi dibandingkan dengan NtEG, hal ini dilihat dari gula tereduksi dan glukosa yang dihasilkan pada saluran pencernaan C. formosanus dibandingkan dengan pada saluran pencernaan N. takasagoensis (Tokuda et al. 2005).
Perbedaan aktivitas selulase pada CfEG dan NtEG dipengaruhi oleh jenis makanan dari kedua spesies. Coptotermes formosanus merupakan rayap pemakan kayu (wood-feeder) sedangkan N. takasagoensis selain memakan kayu juga memakan serasah kayu dan daun (litter-feeder) (Traniello & Leuthold 2000). Aktivitas selulase pada rayap dipengaruhi oleh makanannya. Aktivitas selulase pada rayap pemakan kayu lebih besar dibandingkan dengan rayap pemakan serasah dan pemakan tanah (soil-feeder) (Tokuda et al. 2004).
Coptotermes curvignathus dan C. formosanus merupakan rayap pemakan kayu dan merupakan hama yang banyak menyerang tanaman. Endoglukanase C. curvignathus memiliki kedekatan dengan CfEG. Sehingga diharapkan C. curvignathus memiliki aktivitas selulase yang sama dengan CfEG yaitu memiliki aktivitas selulase yang tinggi. Hal ini akan bermanfaat dalam mencari enzim selulase yang efektif untuk aplikasi selanjutnya.