Rayap di daerah subtropik disebut dengan ’semut putih’ (white ants) karena memiliki morfologi yang mirip dengan semut. Berdasarkan hubungan evolusi (filogeni), tidak ada hubungan antara rayap dengan semut. Hubungan lebih dekat terjadi antara rayap dengan kecoa (Blattodea) (Lo et al. 2000; Inward et al. 2007).
Rayap merupakan salah satu kelompok serangga dengan jumlah keragaman yang besar. Rayap (Ordo Isoptera) terdiri atas tujuh famili, yaitu Mastotermitidae, Kalotermitidae, Termopsidae, Hodotermitidae, Rhinotermitidae, Serritermitidae, dan Termitidae. Sampai sekarang sudah tercatat 14 subfamili, 281 genus dan lebih dari 2600 spesies termasuk dalam kelompok ini (Kambhampati & Eggleton 2000). Famili Termitidae merupakan famili terbesar dalam Ordo Isoptera dan mencakup tiga perempat spesies yang diketahui dan merupakan kelompok rayap yang paling maju. Spesies rayap yang termasuk famili Termitidae dikelompokkan ke dalam rayap tingkat tinggi, sedangkan enam famili yang lain dikelompokkan ke dalam rayap tingkat rendah (Gambar 1). Pembagian kelompok ini didasarkan atas morfologi dan DNA mitokondria (16S rRNA dan NADH 5 dehydrogenease). Karakter yang digunakan sebanyak 197 karakter morfologi dan biologi dari pekerja dan prajurit dengan menekankan pada struktur usus pekerja (Kambhampati & Eggleton 2000). Gen pada mitokondria seperti 16S rRNA, NADH 5 dehydrogenease, dan cytochrome oxidase II (COII) dapat digunakan sebagai kronometer evolusi karena bukan merupakan hasil rekombinasi, berubah sesuai dengan waktu tetapi tidak terlalu cepat, ada pada semua organisme, dan memiliki fungsi yang sama (Sogin et al. 1986; Hoy 1994; Gupta 1998; Philippe et al. 2000; Freeland 2005)
Rayap merupakan serangga sosial yang memiliki pembagian tugas yang jelas yang dinyatakan dalam pembagian kasta. Berdasarkan kemampuan bereproduksi rayap dibagi menjadi dua kasta yaitu kasta reproduktif dan kasta steril (Krishna 1969; Lee & Wood 1971).
Kasta reproduktif terdiri atas reproduktif primer dan reproduktif sekunder. Kasta reproduktif primer (pendiri koloni) biasa disebut laron terdiri atas jantan (raja) and betina (ratu). Ciri khas kasta reproduktif primer adalah adanya sepasang
4
sayap pada bagian toraks. Sedangkan kasta reproduktif sekunder berfungsi menggantikan kasta reproduktif apabila raja atau ratu mati atau untuk menambah jumlah telur apabila telur yang dihasilkan oleh ratu tidak mencukupi kebutuhan koloni (Krishna 1969).
Kasta steril terdiri atas pekerja dan prajurit. Ciri dari kasta ini adalah tidak adanya sayap dan perkembangan organ seksual ditekan atau tidak berkembang. Pekerja bertanggungjawab untuk mencari makan dan memelihara telur, larva dan ratu. Larva, prajurit dan ratu tidak mampu untuk memberi makan dirinya sendiri sehingga bergantung pada makanan yang diberikan pekerja. Jumlah pekerja mencapai 90% dari seluruh anggota koloni. Rayap prajurit bertugas menjaga koloni dari serangan musuh dan juga menjaga pekerja yang mencari makan di sekitar sarang. Prajurit dibedakan dengan pekerja berdasarkan modifikasi bagian mulut dan kepala yang mengalami kitinasi yang kuat, biasanya terpigmentasi dan seringkali lebih besar daripada ukuran kepala kasta yang lain (Krishna 1969).
Secara umum makanan rayap adalah semua bahan yang mengandung selulosa. Bignell dan Eggleton (2000), membagi rayap menjadi beberapa kelompok berdasarkan jenis makanannya. Pertama, rayap pemakan tanah (soil-
Gambar 1 Filogeni rayap berdasarkan morfologi dan DNA mitokondria (16S rRNA dan NADH 5 dehydrogenease) (Kambhampati & Eggleton 2000). Termitinae Apicotermitinae Termitinae Nasutitermitinae T er m it id a e Macrotermitinae Rhinotermitidae Serritermitidae Kalotermitidae Termopsidae Hodotermitidae Mastotermitidae R a y a p t in g k a t r en d a h R a y a p t in g k a t t in g g i
5
feeder) yang mendapatkan makanan dari mineral tanah. Material yang dicerna sangat heterogen, mengandung banyak bahan organik tanah dan silika. Rayap jenis ini ditemukan pada Apicotermitinae, Termitinae, Nasutitermitinae, dan Indotermitinae. Kedua, rayap pemakan kayu (wood-feeder) yang mendapatkan makanan dengan memakan kayu dan sampah berkayu, termasuk cabang mati yang masih menempel di pohon. Hampir semua rayap tingkat rendah adalah pemakan kayu, semua subfamili dari Termitinae kecuali Apicotermitinae. Ketiga, rayap pemakan serasah (litter-feeder). Rayap jenis ini mendapatkan makanan dari daun atau kayu-kayu kecil. Rayap ini terdapat pada Macrotermitinae, Apicotermitinae, Termitinae, dan Nasutitermitinae.
Beberapa jenis rayap yang ada di Indonesia antara lain Neotermes tectonae, Cryptotermes cyanocephalus, C. curvignathus, Schedorhinotermes javanicus, Procapritermes setiger, Pericapritermes semarangi, Macrotermes gilvus, Microtermes insperatus, Microtermes jacobseni, Nasutitermes javanicus, dan Nasutitermes matangensis (Lee & Wood 1971; Harris 1971; Teguh 2009).
Taksonomi dan Biologi C. curvignathus
Coptotermes curvignathus merupakan salah satu rayap subteran. Secara taksonomi C. curvignathus termasuk dalam Klas Insekta, Ordo Isoptera, Famili Rhinotermitidae, Subfamili Coptotermitinae, Genus Coptotermes (Ahmad 1958; Krishna 1969). Berdasarkan analisis gen cytochrome oxidase II (COII) genus Coptotermes terletak diantara genus Reticulitermes dan Nasutitermes (Gambar 2) (Austin et al. 2004).
Rayap C. curvignathus berwarna pucat (Gambar 3a). Prajurit memiliki kepala berbentuk oval, melebar, dan datar dengan fontanel menonjol yang dapat mengeluarkan cairan berwarna putih seperti susu apabila diserang. Eksudat ini berguna untuk melumpuhkan musuhnya. Mandibula berwarna merah kecoklatan dan melengkung di bagian ujungnya. Ukuran prajurit relatif besar (±4.5 mm); lebar kepala 1.34-1.52 mm; antena 14-15 ruas, ruas kedua dua kali panjangnya atau sedikit lebih panjang daripada ruas ketiga (Gambar 3b) (Ahmad 1958).
Perbedaan rayap prajurit C. curvignathus dengan beberapa rayap prajurit spesies Coptotermes yang lain adalah pada Coptotermes gestroi lebar pronotum 0.65 mm, kepala kuning dengan rambut yang jarang, antenna 15 ruas, ruas ketiga
6
Gambar 2 Filogeni genus Reticulitermes, Coptotermes, dan Nasutitermes berdasarkan gen cytochrome oxidase II (COII) (Austin et al. 2004).
N a su tit er m es C o p to te rm es R et ic u lit er m es R h in o te rm it id a e T er m it id a e
sedikit lebih pendek dari ruas keempat. Sedangkan pada Coptotermes formosanus kepala menyempit sebanding dengan panjang, perbedaan antara panjang dan lebar kepala 0.26-0.38, tebal kepala 0.86, antenna 13-15 ruas, ruas kedua sedikit lebih panjang dari ruas ketiga. Ciri Coptotermes havilandi adalah pronotum menyempit dan tepi anterior sedikit cembung, labrum lebih panjang dari lebarnya dan lancip, kepala oval memanjang, dan antena 15-18 ruas, ruas kedua satu setengah kali lebih panjang daripada ruas ketiga (Ahmad 1958).
7
Coptotermes curvignathus terdapat di Asia Tenggara seperti Malaysia, Singapura, Indonesia (Jawa, Sumatra, Kalimantan), Thailand, Vietnam, Kamboja, Filipina, dan Cina bagian selatan. Rayap ini termasuk hama yang serius menyerang pohon karet hidup di Asia Tenggara dan menyerang kulit kayu dan bagian lain termasuk bagian dalam kayu, bahkan sering membunuh tanaman. Untuk mencapai makanannya rayap ini membuat saluran bawah tanah dan jika diperlukan mampu membentuk saluran-saluran yang ditutupi tanah yang dibuat di atas tanah (Roonwal 1970).
Simbiosis Pada Saluran Pencernaan Rayap dan Metabolisme Selulosa
Saluran pencernaan rayap terdiri atas usus depan, usus tengah, dan usus belakang (Gambar 4). Saluran pencernaan ini menempati sebagian besar dari abdomen. Usus depan terdiri atas esofagus dan tembolok yang dilengkapi dengan kelenjar saliva. Esofagus dan tembolok memanjang pada bagian posterior atau bagian tengah dari thorak. Kelenjar saliva mensekresikan endoglukanase dan enzim lain ke dalam saluran pencernaan. Usus tengah merupakan bagian yang berbentuk tubular yang mensekresikan suatu membrane peritrofik di sekeliling material makanan. Usus tengah pada rayap tingkat juga diketahui mensekresikan endoglukanase. Usus belakang merupakan tempat bagi sebagian besar simbion (Noirot & Noirot-Timothée 1969; Scharf & Tartar 2008).
Gambar 3 Rayap C. curvignathus (a) pekerja dan (b) prajurit. (a)
1 mm
1 mm
8
Gambar 4 Morfologi saluran pencernaan rayap (Scharf & Tartar 2008). KS=kelenjar saliva, E=esofagus, T=tembolok, UT=usus tengah, UB=usus belakang.
Rayap bersimbiosis dengan bakteri dan protozoa pada saluran pencernaannnya. Pada rayap tingkat rendah lebih banyak bersimbiosis dengan protozoa dibandingkan dengan bakteri, sebaliknya pada rayap tingkat tinggi lebih banyak bersimbiosis dengan bakteri dibandingkan dengan protozoa (Krishna 1969; Bignell 2000; Breznak 2000).
Protozoa yang bersimbiosis dengan rayap tingkat rendah berbeda pada tiap spesies. Zootermopsis angusticollis bersimbiosis dengan Tricercomitis, Hexamastix, dan Trichomitopsis. Mastotermes darwiniensis bersimbiosis dengan Mixotricha paradoxa (Breznak 2000). Coptotermes formosanus bersimbiosis dengan Pseudotrichonympha grassii, Spirotrichonympha leidy, Holomastigoides mirabile (Inoue et al. 2005; Nakashima et al. 2002b), dan Holomastigoides hartmanni (Tanaka et al. 2006). Coptotermes lacteus bersimbiosis dengan Holomastigoides mirabile (Watanabe et al. 2002). Reticulitermes speratus bersimbiosis dengan Teranympha mirabilis, Triconympha agilis (Ohtoko et al. 2000), Dinenympha exilis dan Pyrsonymphagrandis (Todaka et al. 2007).
Rayap dapat bertahan hidup dengan memanfaatkan lignoselulosa yang mengandung sedikit nutrisi (Ohkuma 2003). Rayap dapat mencerna lignoselulosa dengan menggunakan enzim selulase yang dihasilkan oleh rayap itu sendiri dan simbion (Watanabe et al. 1998; Ohkuma 2003; Scharf & Tartar 2008).
Lignoselulosa adalah suatu campuran dari tiga polimer yang dihasilkan tanaman yaitu selulosa, hemiselulosa, dan lignin. Selulosa adalah polimer glukosa yang terikat oleh ikatan -1,4 dan terikat bersama dengan hemiselulosa (Scharf & Tartar 2008). UB UT KS T E
9
Selulase merupakan enzim ekstraseluler yang terdiri atas kompleks endo-ß- 1,4-glukanase (endoglukanase), kompleks ekso-ß-1,4-glukanase (eksoglukanase) yang terdiri dari cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) atau cellodextranase (EC 3.2.1.74), dan ß-glukosidase (EC 3.2.1.21). Endoglukanase aktif dalam menghancurkan kristal atau selulosa murni. Eksoglukanase menghidrolisis selulosa non-kristal atau turunan selulosa terlarut. ß-1,4-glukosidase menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa (Wood & Garcia-Campayo 1990).
Endoglukanase rayap termasuk ke dalam GHF 9. Anggota GHF 9 rayap terdiri dari endoglukanase dari rayap tingkat tinggi (Tokuda et al. 1999, 2004; Watanabe & Tokuda 2001) dan rendah (Nakashima et al. 2002b). Anggota GHF 9 famili selulase yang secara taksonomi tersebar luas, termasuk pada tanaman, bakteri, slime mold, dan rayap. Selulase simbion diklasifikasikan menjadi beberapa famili GHF yaitu 3, 5, 7, 8, 10, 11, 26, 43, 45, 62. Selulase simbion dari C. formosanus termasuk anggota GHF 5 (Inoue et al. 2005) dan GHF 7 (Nakashima et al. 2002a). Selulase simbion dari C. lacteus (Watanabe et al. 2002) dan R. flavipes (Zhou et al. 2007) termasuk anggota GHF 7. Selulase simbion dari R. speratus termasuk anggota GHF 3, 5, 7, 8, 10, 11, 26, 43, 45, dan 62 (Ohtoko et al. 2000; Todaka et al. 2007). Selulase simbion dari M. darwiniensis termasuk anggota GHF 45 (Li et al. 2003) dan selulase bakteri simbion Nasutitermes termasuk anggota GHF 11 (Brennan et al. 2004).
Rayap tingkat rendah secara utama memakan kayu yang kaya selulosa kristalin dan amorf, hemiselulosa dan lignin. Tingkat hidrolisis hemiselulosa dan lignin yang tinggi dapat membatasi aktivitas selulolitik melalui penghambatan produk akhir. Hal ini yang menyebabkan rayap mengekspresikan berbagai macam gen selulase. Pada R. speratus dan R. flavipes dihasilkan selulase yang termasuk GHF 7, 9, dan 45 (Ohtoko et al. 2000; Zhou et al. 2007).
Struktur Ekson-Intron dan Ekspresi Gen Endoglukanase Rayap
Struktur ekson-intron gen endoglukanase rayap belum banyak diketahui. Sebagian besar data yang ada merupakan data sebagian (partial) cDNA dan cDNA lengkap. Data genomik DNA lengkap pada N. takasagoensis (Tokuda et al. 1999) dan data partial genomik gen endoglukanase terdapat pada R. speratus (Itakura et al. 2006). Genom DNA NtEG memiliki panjang 13005 pb terdiri atas
10
sepuluh ekson dengan sembilan intron. Semua intron NtEG diawali dengan GT dan diakhiri dengan AG. Pada partial genomik RsEG diketahui ukuran dari tiga intron. Dua intron pada RsEG memiliki posisi yang identik dengan NtEG yaitu intron tujuh dan delapan (Tokuda et al. 1999). Itakura et al. (2006) mengkarakterisasi intron sembilan RsEG sebesar 529 pb. Situs pemotongan intron 10 berbeda dengan situs pemotongan eukariot pada umumnya (GT/AG), yaitu diawali dengan AG dan diakhiri dengan GC.
Data cDNA lengkap terdiri atas R. flavipes (Scharf et al. 2005), R. speratus (Tokuda et al. 1999), C. formosanus (Nakashima et al. 2002b), C. acinaciformis, N. walkeri (Tokuda et al. 1999). Data partial cDNA terdiri atas M. darwiniensis (Tokuda et al. 1999; Li et al. 2003), H. sjoestedti (Tokuda et al. 2004), H. japonica (Lo et al. 2000), Glyptotermes sp. (Tokuda et al. 1999), N. koshunensis (Lo et al. 2000; Tokuda et al. 2004), R. speratus (Watanabe et al. 1998; Itakura et al. 2006), S. mushae, dan O. formosanus (Tokuda et al. 2004).
Endoglukanase rayap diekspresikan pada saluran pencernaan rayap. Terdapat perbedaan ekspresi endoglukanase pada rayap tingkat rendah dan rayap tingkat tinggi. Ekspresi NtEG dan NwEG yang termasuk ke dalam rayap tingkat tinggi terjadi di usus tengah (Tokuda et al. 1999). Sedangkan pada rayap tingkat rendah terjadi perbedaan ekspresi dari tiap spesies. Ekspresi RsEG terjadi di kelenjar saliva/usus depan (Tokuda et al. 1999), CfEG diekspresikan di kelenjar saliva, usus depan, dan usus tengah, dan RfEG terdapat pada bagian kelenjar saliva, usus depan, usus tengah, dan usus belakang (Zhou et al. 2007). RfEG diekspresikan paling tinggi pada pekerja kemudian nimfa. Ekspresi EGase menurun pada laron tetapi meningkat 50% pada kasta reproduktif sekunder (Scharf et al. 2005).
Secara filogeni, taksa rayap yang berada pada bagian basal secara konsisten mengekspresikan selulase secara spesifik pada kelenjar saliva (Mastotermitidae, Termopsidae, Kalotermitidae, Rhinotermitidae). Sedangkan taksa yang lebih maju mengekspresikan selulase terutama pada bagian usus tengah (Termitidae) (Gambar 5). Hal ini menunjukkan adanya pergeseran tempat ekspresi selulase dari kelenjar saliva ke usus tengah selama proses evolusi (Tokuda et al. 2004).
11
Aktivitas selulase rayap tingkat rendah dan rayap tingkat tinggi berbeda. Pada rayap tingkat rendah M. darwiniensis (Mastotermitidae), H. sjoestedti (Termopsidae), N. koshunensis (Kalotermitidae), R. speratus (Rhinotermitidae), dan C. formosanus (Rhinotermitidae), aktivitas endoglukanase tertinggi ditemukan di kelenjar saliva (45-86%). Secara keseluruhan pada rayap tingkat rendah aktivitas endoglukanase tertinggi pada Kalotermitidae dan Rhinotermitidae. Sedangkan Termitidae yang termasuk rayap tingkat tinggi yaitu O. formosanus (Macrotermitinae), N. takasagoensis (Nasutitermitinae), dan S. mushae (Termitinae) aktivitas endoglukanase tertinggi ditemukan di usus tengah (96-99%) (Tokuda et al. 2004). Termitinae Nasutitermitinae Macrotermitinae Rhinotermitidae Kalotermitidae Termopsidae Mastotermitidae Cryptocercidae Blattidae
Pergeseran ekspresi selulase dari kelenjar saliva ke usus tengah Termitidae (kehilangan flagelata pada usus belakang)
Dibutuhkan habitat pada tempat jamur tumbuh
Ekspresi nenek moyang pada kelenjar saliva
Rayap
Gambar 5 Filogeni rayap berdasarkan gen endoglukanase dan pergeseran tempat ekspresi (Tokuda et al. 2004).
T er m it id a e K ec o a
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat
Penelitian berlangsung dari Agustus 2009–Juli 2010. Koleksi sampel dilakukan di lingkungan kampus IPB Darmaga Kabupaten Bogor. Identifikasi, analisis molekular dan pengolahan data dilakukan di Bagian Fungsi dan Perilaku Hewan dan Laboratorium Terpadu, Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Bahan dan alat untuk ekstraksi DNA terdiri atas Cetyl Trimetyl Amonium Bromide (CTAB 0.2% (b/v) (7.5 ml 1M Tris-HCl pH 8; 3 ml 0.5 M NaEDTA pH 8; 6.135 g NaCl; 1.5 g CTAB; air hingga 75 ml)), proteinase K (5 mg/ml), PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1), CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1), fenol, isopropanol, etanol 70% (v/v), Tris-HCl EDTA ((TE) (10 mM Tris-HCl-EDTA pH 8; 1 mM EDTA)), nitrogen cair, grinder, pinset, scalpel, dan tabung 1.5 ml. Bahan untuk campuran PCR yaitu akuades steril, primer forward, primer reverse, dan KAPA Taq ReadyMix DNA Polymerase (bufer dengan 1.5 mM Mg2+, dNTP 0.4 mM, 0.05 U/µl KapaTaq DNA polymerase). Bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah medium polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 6% (12 ml akuades; 4 ml acrylamide 30%; 5xTBE 4 ml; TEMED (tetramethylethylene-diamine) 15 µl; 10% APS (Amonium Peroxo Sulfat) 150 µl), bufer 1xTBE (Tris 0.5 M, asam borat 0.65 M, EDTA 0.02M), penanda 100 pb DNA ladder (Promega), dan 6x loading dye (Promega). Visualisasi DNA menggunakan CTAB (0.2 g/200 ml akuades), NH4OH (2.4 ml/200 ml akuades), AgNO3 (0.32 g/200 ml akuades), Na2CO3 (4 g/200 ml akuades), NaOH (4 g/10 ml akuades), formalin, dan asam asetat (200 µl/200 ml akuades).
Metode
Koleksi Coptotermes curvignathus
Coptotermes curvignathus dikumpulkan dari sarang rayap yang berada di pohon pinus (Pinus mercusii) pada halaman parkir Perpustakaan IPB, Kampus
13
IPB Darmaga, Bogor. Rayap yang didapatkan dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml yang berisi alkohol absolut, kemudian dilakukan penggantian alkohol absolut sebanyak dua kali. Sampel yang didapatkan diidentifikasi berdasarkan Triplehorn & Johnson (2005) sampai dengan tingkat famili dan Ahmad (1958) untuk tingkat genus dan spesies.
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA menggunakan metode ekstraksi CTAB 0.2% dan presipitasi alkohol (Sambrook et al. 1989) yang telah dimodifikasi. Sebelum ekstraksi, rayap dimasukkan ke dalam TE (10 mM Tris-HCl EDTA pH 8; 1 mM EDTA) untuk menghilangkan etanol dari jaringan. Penggantian TE dilakukan sebanyak tiga kali. Jaringan sumber DNA yang digunakan adalah kepala dan toraks rayap pekerja.
Kepala dan toraks rayap dipisahkan dari bagian abdomen dengan menggunakan scalpel. Tabung berisi satu kepala dan satu toraks rayap dimasukkan ke dalam nitrogen cair selama 15 menit, kemudian toraks digerus sampai hancur. Bufer CTAB 0.2% ditambahkan sebanyak 200 µl ke dalam tabung yang berisi hancuran kepala dan toraks. Proteinase K (5 mg/ml) ditambahkan sebanyak 14 µl untuk mendegradasi protein, kemudian diinkubasi pada suhu 55 0
C selama 2 jam. Setelah diinkubasi, tabung beserta isinya disentrifugasi 13000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung yang baru, kemudian ditambahkan larutan PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1), sebanyak 250 µl, digoyang dengan tangan perlahan selama 5 menit lalu disentrifugasi 13000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas yang berisi DNA dipindahkan ke tabung yang baru, kemudian ditambahkan larutan CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1) sebanyak 200 µl, digoyang dengan tangan perlahan selama 5 menit dan disentrifugasi 13000 rpm selama 3 menit. Tahapan ini dilakukan dua kali ulangan.
Lapisan atas yang berisi DNA dipindahkan ke tabung yang baru. Presipitasi DNA dilakukan dengan menambahkan isopropanol 300 µl dan disimpan selama semalam pada suhu 4 0C. Pengendapan DNA dilakukan dengan sentrifugasi 13000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 0C. Porsi isopropanol dibuang, kemudian ditambahkan etanol 70% sebanyak 500 µl dan disentrifugasi 13000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 0C. Etanol 70% dibuang, kemudian pelet DNA dikeringkan
14
dengan cara divakum selama 30 menit. Pelet DNA kemudian disuspensikan dalam TE 0.5 mM sebanyak 15-20 µl dan disimpan pada suhu –4 0C.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan secara in vitro dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan mesin thermocycler (ESCO SWIFT MAXI-BLC1). Segmen DNA yang diamplifikasi adalah gen endoglukanase C. curvignathus. Amplifikasi DNA target diamplifikasi dengan menggunakan beberapa pasang primer (Tabel 1, Gambar 6). Primer disusun secara manual berdasarkan CfEG nomor aksesi Genbank AB058670 dan NtEG nomor aksesi Genbank AB019146 dan verifikasi menggunakan program Primer3 (Rozen & Skaletsky 2000; Koressaar & Remm 2007). Primer disusun menggunakan template dari CfEG yang merupakan endoglukanase yang berasal dari kelenjar saliva dan perkiraan posisi intron berdasarkan NtEG.
Total pereaksi yang digunakan adalah sebanyak 20 µl, terdiri atas 7.4 µl akuades steril, 10 µl KAPA Taq ReadyMix DNA Polymerase (bufer dengan 1.5 mM Mg2+, dNTP 0.4 mM, 0.05 U/µl KapaTaq DNA polymerase), 0.8 µl primer forward 10 µM, 0.8 µl primer reverse 10 µM, dan1 µl DNA hasil ekstraksi.
Proses amplifikasi dilakukan pada kondisi suhu pra-denaturasi 94 0C selama 5 menit, dilanjutkan 30 siklus yang terdiri atas tahap denaturasi DNA 94 0C selama 1 menit, penempelan primer pada suhu 53 0C (pasangan primer CfF2 dan CfR3), 58 0C (pasangan primer CfF3 dan CfR4, CfF4 dan CfR5) selama 1 menit dan sintesis DNA ruas target pada suhu 72 0C selama 2 menit. Proses diakhiri dengan sintesis DNA akhir pada suhu 72 0C selama 7 menit.
Tabel 1 Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA target gen endoglukanase C. curvignathus
Ekson Primer Urutan basa (5’-3’) Posisi berdasarkan cDNA C. formosanus (AB058670) 2 CfF2 gcttacgactacaagacag 49-67 CfR2 tatccccctgtcaggtcctcg 180-200 3 CfF3 cggcttccctatggcgtacac 228-248 CfR3 gccttgcgaccatcatccagagc 307-329 4 CfF4 gcgctctggatgatggtcgcaaggc 305-329 CfR4 ctggtttggacgtgtcgatcttgta 463-487 5 CfF5 gagacagccgccgccctcgctgc 505-527 CfR5 gccgcgataattgttggcgaagtcg 600-624
15
Elektroforesis dan Pewarnaan DNA
Segmen DNA hasil amplifikasi dipisahkan dengan PAGE 6% menggunakan bufer 1xTBE. Pemisahan dilakukan pada tegangan 200 V selama 50 menit. Visualisasi DNA pada gel poliakrilamid menggunakan metode pewarnaan perak (Tegelstrom 1986) di dalam shaking bath.
Setelah dielektroforesis gel dicuci dengan larutan CTAB selama 8 menit. Kemudian dicuci dengan akuades sebanyak dua kali masing-masing selama 2 menit. Selanjutnya gel tersebut direndam dalam larutan NH4OH selama 8 menit. Kemudian gel direndam dalam larutan perak (0.32 g AgNO3; 0.8 ml NH4OH; 80 µl NaOH; akuades 200 ml) selama 10 menit. Setelah proses ini gel dicuci kembali dengan akuades sebanyak tiga kali, masing-masing selama 2 menit. Untuk tahap pemunculan pita DNA, gel direndam dalam larutan Na2CO3 (4 g Na2CO3; 100 µl formalin; 200 ml akuades). Tahap terakhir adalah proses perendaman gel pada larutan asam asetat 1%.
Sekuen dan Alignment DNA dan Asam Amino
Proses sekuen DNA menggunakan jasa sekuensing. Produk sekuen diedit menggunakan program Genetyx Win versi 4.0, kemudian dilakukan alignment menggunakan Clustal X (Thompson et al. 1997) dan Mega 4.0 (Tamura et al. 2007). Alignment DNA dilakukan antara sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan sekuen CfEG (AB058670) dan NtEG (AB019146) dari GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Analisis homologi dilakukan melalui BLASTN untuk urutan basa dan BLASTP untuk urutan asam amino hasil translasi melalui situs NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Gambar 6 Skema posisi primer untuk amplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus berdasarkan CfEG (AB058670). Kotak menunjukkan ekson, angka di dalam kotak menunjukkan posisi ekson.
CfF2 CfF3 CfF4 CfF5
CfR4 CfR3
16
Analisis Filogeni dan Jarak Genetik
Analisis filogeni menggunakan program Mega 4.0 (Tamura et al. 2007). Analisis filogeni berdasarkan asam amino dengan menyamakan awal dan akhir asam amino terlebih dahulu berdasarkan hasil alignment. Rekonstruksi filogeni menggunakan metode Maximum Parsimony dengan bootstrap 1000 kali. Data endoglukanase bakteri, protozoa simbion rayap, fungi, rayap, echinodermata, cacing tanah, dan moluska (Tabel 2) diambil dari genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Perhitungan jarak genetik dilakukan antara gen endoglukanase C. curvignathus dengan gen endoglukanase rayap lain dengan program MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007).
Analisis Protein Putative
Analisis motif protein putative (misal: protein signature) gen endoglukanase C. curvignathus menggunakan data yang ada pada Prosite (Falquet et al. 2002, www.expasy.org/prosite), Nakashima et al. (2002b), dan Zhou et al. (2007). Analisis gen famili dari protein putative gen endoglukanase C. curvignathus menggunakan Pfam (Protein family, Bateman et al. 1999, pfam.sanger.ac.uk). Tabel 2 Data endoglukanase pembanding dari GenBank
Domain Spesies Inisial Nomor akses
Rayap C. acinaciformis C. acinaciformis AAK12339
C. formosanus C. formosanus ACI45756
C. formosanus C. formosanusEG1a BAB40693
C. formosanus C. formosanusEG1b BAB40694
C. formosanus C. formosanusEG2 BAB40695
C. formosanus C. formosanusEG3 BAB40696
C. formosanus C. formosanusEG4 BAB40697
R. flavipes R. flavipes AAU20853
R. speratus R. speratus BAA31326
N. takasagoensis N. takasagoensis BAA76619 Protozoa Pseudotrichonympha grassii P. grassiiEG1 BAB64560
P. grassii P. grassiiEG2 BAB64561
P. grassii P. grassiiEG3 BAB64562
Holomastigotoides mirabile H. mirabile1 BAB64563
H. mirabile H. mirabile3 BAB64564
H. mirabile H. mirabile3 BAB64565
17
Tabel 2 Lanjutan
Echinodermata Strongylocentrotus purpuratus S. purpuratus XP_001176148 Cacing tanah Eisenia andrei E. andrei AAX92641 Moluska Biomphalaria glabrata B. glabrata AAT76428 Bakteri Bacillus pumilus B. pumilus AAF15367
Cellulomonas flavigena C. flavigena AAW62376
Cellulomonas fimi C. fimi AAA23086
Thermomonospora fusca T. fusca AAA20892
Caldocellum saccharolyticum C. saccharolyticum AAA91086
Clostridium thermocellum C. thermocellum CAA28255
Clostridium stercorarium C. stercorarium CAA39010
Clostridium cellulolyticum C. cellulolyticum AAA73867 Fungi Trichoderma reesei T. reesei P07981
Trichoderma longibrachiatum T. longibrachiatum Q12714
Hypocrea jecorina H. jecorina AAX28897
Humicola insolens H. insolens P56680
Humicola grisea H. grisea Q12622
Fusarium oxysporum F. oxysporum P46237
Cochliobolus carbonum C. carbonum Q00328
Cryphonectria parasitica C. parasitica Q00548
Aspergillus aculeatus A. aculeatus O59843
Agaricus bisporus A. bisporus Q92400
HASIL
Amplifikasi DNA Gen Endoglukanase C. curvignathus
Pita DNA gen endoglukanase C. curvignathus hasil amplifikasi menggunakan pasangan primer CfF2 dan CfR3 menghasilkan dua pita yaitu pita tebal berukuran sekitar 900 pasang basa (pb) (Gambar 7a) dan pita tipis yang berukuran sekitar 2000 pb. Berdasarkan panjang ekson CfEG (AB058670) yang berukuran 281 pb dan ketebalan pita DNA, target yang benar adalah pita yang berukuran 900 pb yang selanjutnya dilakukan sekuen DNA. Pasangan primer CfF3 dan CfR4 menghasilkan pita DNA sekitar 1100 pb dan pasangan primer CfF4 dan CfR5 sekitar 500 pb (Gambar 7b).
Sekuen dan Alignment DNA dan Asam Amino Gen Endoglukanase C.
curvignathus
Hasil sekuen DNA gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan pasangan primer CfF2 dan CfR3, CfF3 dan CfR4, CfF4 dan CfR5 masing-masing sebesar 856, 1077, dan 484 pb (Gambar 8, Lampiran 1-6).
a. Hasil sekuen DNA gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan pasangan primer CfF2 dan CfR3
Gambar 7 Pita DNA hasil amplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus pada gel poliakrilamid dengan menggunakan (a) pasangan primer CfF2 dan CfR3; (b) pasangan primer CfF3 dan CfR4 (no 3-4) dan pasangan primer CfF4 dan CfR5 (no 5-6). M = penanda 100 pb DNA ladder (Promega).
1100 pb 500 pb M 3 4 5 6 pb 1000 500 400 900 pb M 1 2 pb 1000 500 400 (a) (b) GCTTACGACTCAAGACAGTACTGAAGAATTCGCTGCTTTTCTACGAGGCTCAGCGATCGGGACAATTGCCC GCTGATCAGAAGGTCACGTGGAGGAAGGATTCCGCCCTTAACGACAAGGGAAACAACGGCGAGGATCTGAC AGGGGGATATTATGACGGTAAGACTACATACACAAATTTCAAATTCAAAGATTCAAAAATCTGCGTGCACA CCATTCTCATAATATCATTCATACGTTAGTGTGGTGAGCCTATAGCATCTGTAAACTTTTGCAGCTGGTGA TTTTGTGAAATTCGGCTTTCCAATGGCGTACACGGCCACCGTCCTGGCTTGGGGCCTGGTGGACTATGAAG CGGGCTACTCCTCAGCAGGTACGTACATCACAGTGACGGTGCAGGTGTAGGGACAGAATATGTGATTTAGA ACACAAGGTGTCGCTTCAGGTTATGAGCGACCTGCTGATTTGTGAAGTTATGCTAATTCTGTGAACGATTT GATATAAGAATCTGTGTAATACAAGCCTCCATTAGAGACCCGAAATGCAATGTGCATCATTAACTGAAATA TAATCAAGGACACACGTGTTTAAGATTCTACAAATGCAGTTGCGAAAACTCATTGTTTAAACACTTCGGTT GCTCAGTAGTGGAGATTTCTAATTTAATACTCTATGAGAAGTTATTCAATGACAAGAAATGAAATACACTC ATTAGTACGAAATGCTTCTTCGTCTCATCTCGTAGAGTAACCTAATATCATACTCATTATCCAATCGCGAA TTCAGTGTCCATGACCAAATCCAGATAACATGTTCAATACCCAACCAATGCTTGCAGCGCTCTGGGATGAT GGTC CfF2 CfR3 CfF3 CfR2
19
b. Hasil sekuen DNA gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan