HASIL PENELITIAN
5.2 Uji Efektifitas Antibakteri
Pada penentuan KHM yang dilihat adalah tabung perlakuan yang mulai tampak jernih bila dibandingkan dengan kontrol. Dari hasil pengujian antibakteri ekstrak pegagan terhadap F.nucleatum setelah dicampur menggunakan vorteks dan diinkubasi selama 24 jam, didapat bahwa tidak ada larutan yang mulai tampak jernih, semua kelompok perlakuan memiliki kekeruhan yang sama (Gambar 15b) bila
dibandingkan dengan kontrol Mc Farland, sehingga nilai KHM dalam penelitian ini tidak dapat ditentukan.
Pada penentuan KBM, yang dicari adalah konsentrasi minimal yang dapat membunuh bakteri pada media MHA (steril). Hasil pada uji antibakteri juga didapat pada konsentrasi 100% - 6,25% (Gambar 16a) memperlihatkan zona bening yang tidak dijumpai pertumbuhan koloni bakteri atau senilai 0 CFU/ml yang menunjukkan bahwa pada konsentrasi ini sudah mampu memberikan efek antibakteri, sedangkan pada konsentrasi 3,125% dijumpai adanya pertumbuhan bakteri (Gambar 16b-e) dengan rata-rata pertumbuhan bakteri sebesar 110 CFU/ml (Tabel 3).
Gambar 16. Koloni bakteri pada media MHA dengan konsentrasi (a) 100%-6,25%. Konsentrasi 3,125% (b) replikasi I (c) replikasi II (d) replikasi III (e) replikasi IV
Gambar 15. (a) Media MHB sebelum diberi perlakuan (b) Suspensi bakteri setelah diberi perlakuan b a b e d a c
Tabel 3 menunjukkan pada pengujian antibakteri dengan menghitung jumlah koloni F.nucleatum, konsentrasi terkecil yang mampu membunuh bakteri 99,9% adalah pada konsentrasi 6,25% dengan jumlah bakteri 0 CFU/ml (steril).
Tabel 3. HASIL PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI FUSOBACTERIUM NUCLEATUM SETELAH PERLAKUAN
Dapat disimpulkan bahwa KBM dari bahan coba ekstrak pegagan terhadap
F.nucleatum adalah 6,25%. Data hasil pengujian antibakteri tidak dapat dilakukan uji statistik ANOVA dan LSD karena nilai perhitungan koloni bakteri adalah 0 CFU/ml yang artinya tidak dijumpai pertumbuhan bakteri dalam media perbenihan atau bakteri yang berkontak dengan bahan coba 100% mengalami kematian.
Bahan Uji Repli
kasi
Jumlah koloni Bakteri (CFU/ml) Konsentrasi 100% Konsentrasi 50% Konsentrasi 25% Konsentrasi 12,5% Konsentrasi 6,25% Konsentrasi 3,125% Ekstrak pegagan 1 0 0 0 0 0 6.101 2 0 0 0 0 0 4.101 3 0 0 0 0 0 2,4.102 4 0 0 0 0 0 1.102 X 0 0 0 0 0 1,1.102 Kontrol negatif (bakteri) 2,9.1011 Kontrol negatif (bahan uji) 0
Keterangan : Jumlah koloni yang tumbuh pada konsentrasi ekstrak pegagan 3,125 % telah dikalikan dengan faktor pengenceran 20x.
BAB 6 PEMBAHASAN
Penelitian ini menggunakan pegagan 3 kg karena setiap bahan alam yang telah dikeringkan akan didapat berat kering 10% - 12% dari berat awal sebelum dikeringkan. Pegagan 3 kg setelah pengeringan menjadi 300 – 400 gram, berat ini cukup untuk ditampung oleh perkolator dan juga untuk mendapatkan ekstrak yang cukup untuk dilakukan pengujian aktivitas antibakteri. Pelarut etanol 96% digunakan karena relatif lebih aman (tidak bersifat toksik) dan sifatnya yang universal, dapat melarutkan hampir seluruh bahan aktif yang terkandung dalam suatu bahan alami.22
Pada pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol pegagan terhadap
F.nucleatum, ada dua metode untuk menentukan aktivitas antibakteri, yaitu diffusion test dan dilution test. Pada metode difusi, digunakan paper disk yang diberi antibiotik dan diletakkan diatas agar media yang telah ditanam bakteri, agen antimikroba tersebut akan berdifusi sehingga zona hambat akan terbentuk disekitar disk dan diukur zona hambatnya. Metode ini tergantung pada kelarutan dan difusi bahan coba sehingga kurang efektif untuk menghambat mikroorganisme. Disamping itu, metode ini tidak mampu memberikan data yang tepat mengenai tingkat resisten atau kerentanan dari mikroorganisme.20
Metode dilusi dilakukan dengan pengenceran ganda dari konsentrasi awal, sehingga konsentrasi yang didapat adalah setengah dari konsentrasi awal sebelumnya. Metode ini lebih efektif karena bahan uji langsung berkontak dengan mikroorganisme sehingga hasil penelitian akan lebih representatif.20 Atas dasar inilah peneliti memilih
metode dilusi untuk menguji daya antibakteri ekstrak etanol pegagan. Pada metode dilusi ini, digunakan media Mueller Hinton karena merupakan media standar yang digunakan untuk menguji bakteri secara dilusi.20 Kandungan dari Mueller Hinton
adalah pepton (6 g), kasein (17,5 g), pati (1,5 g) dan agar (10 g). Kandungan ini diperlukan oleh F.nucleatum untuk tumbuh karena biasanya F.nucleatum tumbuh pada media yang mengandung pepton atau ekstrak ragi, trypticase.8
Hasil pengujian antibakteri dalam berbagai konsentrasi, bahwa nilai KHM tidak dapat ditentukan karena masih terjadi kekeruhan atau tidak ada tabung hasil biakan yang mulai tampak jernih. Kekeruhan ini kemungkinan terjadi karena ekstrak pegagan yang memiliki warna hijau kehitaman dan setelah disuspensikan dengan bakteri akan menjadi hijau keruh karena terdapatnya bakteri sehingga sulit untuk menentukan konsentrasi yang mulai tampak jernih. Selain itu, pegagan mengandung senyawa zat aktif steroid yang tidak larut dalam pelarut polar (bersifat non polar) yang bila diencerkan dengan Mueller Hinton Broth (bersifat polar) maka akan terjadi kekeruhan yang dikarenakan adanya pemisahan dari zat aktif steroid dengan MHB.40 Dengan adanya kekeruhan ini maka nilai KHM tidak dapat diketahui, sehingga diperlukan penelitian dengan metode lain untuk mendapatkan nilai KHM yaitu metode difusi dengan mengukur zona hambat.
Konsentrasi 100% (sangat kental) akan secara langsung membunuh bakteri
F.nucleatum karena tingginya konsentrasi antibakteri yang terkandung didalamnya. Begitu juga yang terjadi pada konsentrasi 50%, 25%, 12,5%, 6,25% tidak dijumpai pertumbuhan bakteri (steril atau 0 CFU/ml) yang artinya pada konsentrasi 100% hingga 6,25% bersifat bakterisid, sedangkan pada konsentrasi 3,125% pengenceran
yang dilakukan akhirnya mampu mengurangi daya hambat bahan uji terhadap pertumbuhan bakteri sehingga terlihat adanya pembentukan koloni bakteri 6.101 CFU/ml pada replikasi 1. Maka hipotesa pertama yaitu ada efek antibakteri ekstrak etanol pegagan terhadap F.nucleatum diterima, hal ini terbukti dengan diperolehnya nilai KBM yaitu pada konsentrasi 6,25%. Dari data hasil penelitian tidak dapat dilakukan uji statistik dengan ANOVA dan LSD karena nilai perhitungan koloni bakteri pada konsentrasi 100% - 6,25% adalah 0 CFU/ml, yang artinya tidak dijumpai pertumbuhan bakteri dalam media perbenihan atau bakteri yang berkontak dengan bahan coba 100% mengalami kematian.
Efek antibakteri dari ekstrak pegagan dikarenakan banyaknya senyawa aktif yang terkandung didalamnya yaitu alkaloid, saponin, tanin dan flavonoid yang berperan dengan mengganggu fungsi membran atau dinding sel bakteri F.nucleatum. Alkaloid mengganggu komponen penyusun peptidoglikan pada sel bakteri, sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan menyebabkan kematian sel.38 Asiatikosida dan asam asiatat termasuk ke dalam golongan saponin.17 Mekanisme saponin ini yaitu dengan membentuk senyawa kompleks dengan membran sel melalui ikatan hidrogen sehingga mengganggu integritas membran sel dan akhirnya bakteri akan mengalami kematian.39 Mekanisme tanin diperkirakan adalah sebagai berikut: toksisitas tanin dapat merusak membran sel bakteri, senyawa astringent tanin dapat menginduksi pembentukan kompleks senyawa ikatan terhadap enzim atau substrat mikroba dan pembentukan suatu kompleks ikatan tanin terhadap ion logam yang dapat menambah daya toksisitas tanin itu sendiri. Mekanisme tanin diduga dengan mengkerutkan dinding sel atau membran sel sehingga mengganggu permeabilitas sel
itu sendiri. Akibatnya sel tidak dapat melakukan aktivitas hidup sehingga pertumbuhannya terhambat atau bahkan mati. Flavonoid akan mengganggu integritas membran sel bakteri dengan membentuk senyawa kompleks terhadap protein ekstraseluler.38
Bahan alam yang juga diteliti sebagai bahan medikamen diantaranya adalah
Aloe vera dan buah mahkota dewa.11,12 Penelitian yang dilakukan oleh Rahma (2009) mengenai ekstrak etanol Aloe vera didapat nilai KBM untuk F.nucleatum yaitu pada konsentrasi 50%.11 Penelitian yang dilakukan oleh Kere CM (2011) mengenai ekstrak etanol buah mahkota dewa terhadap F.nucleatum dengan nilai KBM 3,125%.12 Nilai KBM yang diperoleh berbeda, hal ini dikarenakan setiap bahan alam memiliki kandungan senyawa aktif yang berbeda (Tabel 4).
Tabel 4. KANDUNGAN SENYAWA DARI BAHAN ALAM SEBAGAI ALTERNATIF MEDIKAMEN SALURAN AKAR11,12
Bahan alam sebagai alternatif medikamen saluran akar
Aloe vera Buah mahkota dewa Pegagan
KBM
terhadap F.nucleatum 50 % 3,125 % 6,25 %
Kandungan senyawa Tanin, antrakuinon
dan saponin
Polifenol, saponin, alkaloid, tanin
alkaloid, saponin, tanin dan flavonoid
Ekstrak pegagan memiliki aktifitas antimikroba yang juga dibuktikan oleh Jagtap et al (2009) dengan menggunakan metode difusi yaitu pengukuran zona hambat, dengan nilai KHM 125 µg/ml terhadap bakteri P.vulgaris, S.aureus, E.coli;
dan pada bakteri B.subtilis dengan nilai KHM 62,5 µg/ml. Pada penelitian Jagtap, bakteri B.subtilis mempunyai efek antibakteri paling besar dengan zona hambat 10
mm, sedangkan E.coli mempunyai efek antibakteri paling lemah dengan zona hambat 6 mm.18
Nilai yang diperoleh peneliti berbeda dengan Jagtap, hal ini terjadi karena metode yang digunakan berbeda, Jagtap menggunakan metode difusi, yaitu dengan mengukur zona hambat yang terbentuk disekitar disk dan didapat nilai KHM, sedangkan pada penelitian ini menggunakan metode dilusi dengan mencari nilai KHM dan KBM. Metode ini dianggap lebih baik daripada metode difusi karena pada metode dilusi bahan coba langsung berinteraksi dengan bakteri tanpa dipengaruhi oleh media padat (disk). Pada metode difusi, bahan uji tidak mudah berdifusi melewati disk oleh karena kekentalannya sehingga akan berpengaruh pada daya hambat bakteri.
Perbedaan daerah dan keadaan geografis tanah juga berpengaruh, pada penelitian Jagtap tanaman pegagan berasal dari Amravati (India), sedangkan pada penelitian ini pegagan yang digunakan berasal dari Desa Durian, Kec. Pantai Labu, Deli Serdang (Indonesia). Adanya perbedaan daerah dan keadaan geografis tanah akan memberikan pengaruh pada kandungan senyawa aktif yang terdapat dalam
Centella asiatica.35
Bakteri yang diuji berbeda, Jagtap meneliti bakteri lain, sedangkan pada penelitian ini meneliti bakteri F.nucleatum yang tidak diteliti oleh Jagtap. Bakteri
B.subtilis adalah bakteri gram positif sedangkan bakteri F.nucleatum dan E.coli
merupakan bakteri gram negatif. Adanya perbedaan struktur dinding sel bakteri yaitu bakteri gram negatif memiliki struktur dinding yang lebih kompleks bila
dibandingkan dengan bakteri gram positif (Gambar 17) sehingga kemungkinan kandungan senyawa pegagan akan sulit untuk menghambat bakteri gram negatif.
Bakteri gram positif, memiliki selubung sel yang lebih sederhana yaitu lapisan membran sitoplasma, peptidoglikan, dan lapisan S atau kapsul. Komponen dinding sel gram positif terdiri dari teichoic, teichuronic acid dan polisakarida. Pada bakteri gram negatif memiliki selubung sel yang lebih kompleks yaitu lapisan membran sitoplasma, ruang periplasma, membran luar dan lapisan S atau kapsul. Komponen dinding sel gram negatif terdiri dari ruang periplasma, membran luar, lipoprotein dan lipopolisakarida (LPS). 19,41
Penelitian ini membuktikan bahwa ekstrak etanol pegagan memiliki efek antibakteri secara in-vitro. Hal ini kemungkinan akan berbeda hasilnya dalam saluran akar karena bakteri yang terdapat dalam infeksi saluran akar ialah polimikrobial maka kedepannya perlu dilakukan penelitian lebih lanjut sehingga pegagan dapat digunakan sebagai bahan medikamen saluran akar secara klinis.
Gambar 17. Struktur sel bakteri: (A) gram positif dan (B) gram negatif 41 B
BAB 7
KESIMPULAN DAN SARAN