HASIL PENELITIAN
5.2 Uji Efektifitas Antibakteri
Setelah dilakukan prosedur pengujian efek antibakteri, pada bahan coba ekstrak kental lerak 25 % tidak dijumpai pertumbuhan bakteri dalam media perbenihan yang berarti bahwa semua bakteri Enterococcus faecalis mati. Sedangkan pada penentuan MIC, kekeruhan tabung tidak berubah sehingga dianggap tidak representatif untuk mengukur nilai MIC. Oleh karena itu, nilai MIC tidak dapat diketahui.
Tabel 2. HASIL PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI UNTUK BAHAN COBA EKSTRAK LERAK DALAM PELARUT ETANOL TERHADAP E. Faecalis
Bahan Uji Replikasi Kons. 100% (CFU/ml)* Kons. 50% (CFU/ml)* Kons. 25% (CFU/ml)* Kons. 12,5% (CFU/ml)* Kontrol Mc Farland (CFU/ml)* Kontrol negatif (CFU/ml)* Ekstrak buah 1 0 0 0 304.109 264. 1015 0 Lerak dalam 2 0 0 0 366.109 pelarut Etanol 3 0 0 0 283.109 4 0 0 0 358.109 5 0 0 0 278.109 6 0 0 0 284.109
Keterangan : 0 CFU/ml = Steril, tidak dijumpai pertumbuhan bakteri. CFU/ml = Colony Forming Unit per ml
* = sudah dikali dengan 20 (faktor pengali)
Tabel 2 menunjukkan bahwa pengujian efek antibakteri terhadap E.faecalis
pada bahan coba ekstrak lerak dalam pelarut etanol 25 % adalah steril (0), yang berarti bahwa setelah penanaman pada media MHA dan diinkubasi selama 24 jam tidak terlihat adanya pertumbuhan bakteri, atau semua bakteri mati. Hal ini terlihat dari zona yang bening pada petri. Pada pengujian efek antibakteri ekstrak lerak dalam pelarut etanol pada konsentrasi 12,5 % memperlihatkan pertumbuhan koloni dengan jumlah yang berbeda pada tiap replikasi (Gambar 16), dengan rata-rata (312.109 ± 36,23.109) CFU/ml yang artinya pertumbuhan bakteri masih subur.
Dari tabel di atas dapat disimpulkan bahwa MBC ekstrak lerak dalam pelarut etanol terhadap E.faecalis adalah 25 %.
b b a b a a
(i) (ii) (iii)
a a a
b b b
(iv) (v) (vi)
Gambar 16. Pertumbuhan bakteri pada media perbenihan pada ekstrak lerak dalam pelarut etanol 12,5 % (i) replikasi ke 1, (ii) replikasi ke 2, (iii) replikasi ke 3, (iv) replikasi ke 4, (v) replikasi ke 5, (vi) replikasi ke 6. Keterangan : (a) Media MHA. (b) Koloni bakteri E.faecalis.
Gambar 17. Tidak ada pertumbuhan bakteri pada media perbenihan ekstrak lerak dalam pelarut etanol Zona bening menunjukkan tidak ada pertumbuhan bakteri E.faecalis.
BAB 6 PEMBAHASAN
Penelitian ini dimulai dengan pembuatan ekstrak lerak. Daging buah lerak dipotong kecil-kecil dengan lebar ± 3 mm, dimasukkan ke dalam lemari pengering selama ± 7 hari hingga konsistensinya rapuh ketika digenggam, dihaluskan dengan blender, kemudian dilakukan maserasi dengan menggunakan pelarut etanol dan dimasukkan ke dalam perkolator. Setelah didapat ekstrak cair, masukkan ke dalam
vaccum rotavapor untuk memisahkan ekstrak dan pelarut sehingga diperoleh ekstrak kental.
Buah lerak dimasukkan ke dalam lemari pengering untuk mencegah proses pembusukkan. Proses ini tidak mempengaruhi efek antibakteri karena saponin, flavonoid, alkaloid dan fenol merupakan senyawa yang tahan terhadap pemanasan, sedangkan etanol dipilih sebagai pelarut karena tidak bersifat toksik dan merupakan pelarut yang telah memenuhi syarat kefarmasian atau “pharmaceutical grade”.24 Ekstrak lerak dalam pelarut etanol dilarutkan dalam media Mueller Hinton Broth
karena media ini memiliki pH netral yaitu 7,327 sehingga efek antibakteri yang dihasilkan pada pengujian efek antibakteri murni berasal dari ekstrak lerak itu sendiri, bukan karena penambahan pelarut yang bersifat asam yang akan meningkatkan efek antibakterinya.
Pada tahap awal, pengujian efek antibakteri dari suatu bahan dilakukan secara
in vitro.Ada dua metode untuk menentukan aktifitas antibakteri, yaitu agar diffusion test dan direct exposure test (metode dilusi). Pada metode agar diffusion test, ukuran
zona inhibisi antibakteri tergantung daripada kelarutan dan difusi bahan coba pada media, sehingga kemungkinan kurang efektif dalam menginhibisi mikroorganisme. Dalam penelitian ini dilakukan pengujian efek antibakteri dari ekstrak lerak dalam pelarut etanol terhadap E.faecalis dengan metode dilusi. Dengan metode ini bahan coba dapat berkontak langsung dengan mikroorganisme,26 sehingga hasil yang diperoleh lebih akurat dan dapat diketahui nilai MIC dan MBC dari bahan coba seperti yang direkomendasikan oleh National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, USA)dan sesuai dengan penelitian sebelumnya oleh Sanny pada tahun 2008 yang meneliti efek antibakteri berbagai sediaan dari buah Lerak terhadap
F. nucleatum (penelitian in vitro) dengan metode dilusi.11
Penelitian dilakukan dengan metode dilusi dengan cara pengenceran ganda sehingga didapat konsentrasi bahan coba yang besarnya setengah dari konsentrasi awal yaitu 100 %, 50 %, 25 % dan 12,5 %. Pada masing-masing konsentrasi dilakukan replikasi sebanyak 6 kali untuk hasil yang lebih akurat dan mengetahui berapa rata-rata jumlah bakteri yang tumbuh pada ekstrak lerak dalam berbagai konsentrasi karena pada konsentrasi yang sama belum tentu jumlah bakteri yang tumbuh juga sama.
MIC dilihat dari konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi 24 jam dan tidak menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri secara makroskopik yang dapat dilihat dari hasil biakan pada tabung yang mulai tampak jernih dengan menggunakan metode dilusi, sedangkan
MBC dilihat dari konsentrasi minimal bahan uji pada biakan padat (MHA) dimana tidak terlihat pertumbuhan bakteri atau seluruh bakteri mati pada media perbenihan.
Pada penelitian untuk mengetahui nilai MIC menunjukkan bahwa dari semua konsentrasi bahan coba yang diuji ternyata tidak dapat terlihat larutan yang mulai tampak jernih. Hal ini bisa disebabkan oleh bahan coba, pertumbuhan kuman yang cepat, atau karena tumpukan sel bakteri mati. Dalam hal ini, tidak adanya perubahan kekeruhan diduga akibat bahan coba itu sendiri berwarna coklat, sehingga ketika diuji semua konsentrasi berwarna coklat keruh dan tidak jernih sehingga dianggap tidak representatif untuk dicari nilai MIC. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui nilai MIC dengan menggunakan metode yang lain.
Pada penelitian untuk mengetahui MBC, setelah ditanam di MHA dan diinkubasi selama 24 jam, pada konsentrasi 100 % tidak terlihat adanya pertumbuhan bakteri (steril), begitu juga pada konsentrasi 50 % dan 25 %. Pada konsentrasi 12,5 % sudah terlihat pertumbuhan bakteri pada media perbenihan. Oleh karena itu, dapat diketahui bahwa nilai MBC adalah 25 %. Akan tetapi, rentang konsentrasi di mana bakteri mati seluruhnya dan konsentrasi di mana bakteri sudah mulai tumbuh masih terlalu besar sehingga diduga masih ada konsentrasi lebih kecil yang dapat membunuh seluruh E.faecalis diantara konsentrasi 12,5 % - 25 %. Untuk itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui nilai MBC yang lebih terperinci dengan menggunakan metode yang lain.
Walaupun nilai MIC tidak diketahui, hasil penelitian menunjukkan bahwa bahan coba ekstrak lerak dalam pelarut etanol memiliki efek antibakteri terhadap
E.faecalis dengan nilai MBC 25%. Dengan demikian hipotesis penelitian diterima. Ada perbedaan hasil penelitian efek antibakteri ekstrak lerak terhadap beberapa jenis bakteri. Penelitian membuktikan bahwa ekstrak lerak 0,01 % mempunyai efek
antibakteri terhadap Streptococcus mutans dan efek antifungal terhadap Candida albicans lebih baik daripada NaOCl 5 % 9,10 Sedangkan terhadap Fusobacterium nucleatum, ekstrak lerak mempunyai efek antibakteri dengan MIC dan MBC 0,25 % dan 0,01 % untuk saponin buah lerak.11 Nilai MIC dan MBC yang diperoleh peneliti berbeda dengan konsentrasi tiga peneliti sebelumnya, hal ini terjadi kemungkinan karena tujuan, metode, bakteri, atau bahan yang digunakan berbeda.
Tujuan dan metode yang digunakan peneliti untuk pengujian efek antibakteri ekstrak lerak terhadap E.faecalis dan F.nucleatum sama, yaitu untuk mencari nilai
MIC dan MBC. Metode yang digunakan adalah metode dilusi. Dua peneliti sebelumnya bertujuan mencari konsentrasi LD50 dan metode yang digunakan adalah
agar diffusion test. Hal ini diduga menyebabkan perbedaan hasil.
Pelarut yang digunakan untuk maserasi simplisia lerak berbeda. Peneliti menggunakan etanol sedangkan tiga peneliti sebelumnya menggunakan metanol.Asal buah lerak yang berbeda dapat menyebabkan hasil yang berbeda karena ada kemungkinan kadar senyawa aktif yang terkandung dalam buah lerak tidak sama karena geografis asal buah lerak yang berbeda. Uji efek antibakteri terhadap
E.faecalis menggunakan ekstrak lerak yang diekstraksi dari buah lerak yang berasal dari Desa Maga, Kec. Panyabungan, Tapanuli Selatan, sedangkan pada uji efek antibakteri terhadap F.nucleatum menggunakan ekstrak lerak yang diekstraksi dari buah lerak yang berasal dari Desa Muara Imat, Kab. Kerinci, Jambi. Sejauh ini belum dilakukan penelitian mengenai kandungan senyawa aktif buah lerak pada masing-masing asal geografis yang berbeda.
Bakteri yang diuji peneliti adalah E.faecalis, sedangkan tiga peneliti sebelumnya menguji bakteri F.nucleatum, S.mutans dan C.albicans. Morfologi bakteri yang berbeda menyebabkan struktur membran sel bakteri juga berbeda sehingga diduga menyebabkan perbedaan aktifitas dan besar konsentrasi bahan coba dalam membunuh sel bakteri tersebut. Perbedaan morfologi bakteri tersebut dapat dilihat pada tabel berikut.
TABEL. 3 PERBEDAAN MORFOLOGI BAKTERI.9-11,35-37
Nama bakteri E.faecalis S.mutans F.nucleatum C.albicans
Membran sel - Peptidoglikan (40%) - Polisakarida (gliserol posfat, glukosa, galaktosa) - Teichoic Acid - LTA - Peptidoglikan - Polisakarida - Protein - LTA Membran luar : - Lipopolisakari da - Lipoprotein - Protein (30 %) - Posfolipid Ruang Periplasmik - Peptidoglikan Membran dalam - Posfolipid - Protein - Glukan - Mannan - Kitin - Protein (6 % - 25 %) - Lipid (1 % - 7 %) Daya tahan - pH 4-11 - 5°C -50°C - AS (mengikat neutrofil) - Resisten terhadap antibiotik spektrum luas - Mutasi DNA pH 5-9 Dapat menetralkan lingkungan yang bersifat asam, lebih tahan terhadan suasana basa (pH=9). bertahan pada suasana asam atau basa tergantung lingkungannya.
Pada suasana anaerob, tumbuh lebih baik suasana asam daripada netral ataupun basa Pada ekologi
yang keras & defisiensi nutrisi. - VBNC (+) (LTA sehingga lebih resisten terhadap kerusakan mekanis, PBP sehingga resisten terhadap penisilin) - Katabolisasi energy dari karbohidrat, gliserol, malat, - VBNC (-) Mengkatabolisasi energy dari as. Amino, glukosa, fruktosa, N-acetylglucosamine , sitrat, gliserol. - Sekresi protease (tetap hidup pada lingkungan yang minim nutrisi) - Perubahan fenotip (adaptasi pada lingkungan yang keras)
Pada dasarnya, dinding sel bakteri ini terdiri dari peptidoglikan sebanyak 40 %, sisanya merupakan teichoic acid dan polisakarida (Gambar 17).30 Keseimbangan antara enzim polimerisasi dan hidrolitik menghasilkan sintesis peptidoglikan.31
Gambar 18. Struktur membran sel bakteri gram positif. 28
Efek antibakteri yang ditimbulkan ekstrak lerak diduga karena ekstrak lerak punya banyak senyawa aktif. Ekstrak lerak memiliki kandungan berupa saponin, flavonoida, alkaloida dan polifenol yang bersifat antibakteri. Kematian bakteri
E.faecalis mungkin disebabkan saponin yang berperan sebagai surfaktan / sabun atau deterjen (bahan aktif permukaan) akan menyerang lapisan batas sel bakteri melalui ikatan gugus polar saponin dengan polisakarida dan peptidoglikan serta gugus non polar saponin dengan LTA sehingga menyebabkan terjadinya gangguan permeabilitas sel, fungsi sel, sel lisis dan kemudian mati.
Mekanisme kerja senyawa flavonoid diduga dengan merusak membran sel karena sifatnya yang lipofilik dan kemampuannya membentuk kompleks dengan
protein ekstraseluler. Seyawa fenol bersifat toksik terhadap mikroorganisme karena dapat menginhibisi enzim penting mikroorganisme sehingga mengganggu fungsi sel serta perusakan senyawa protein yang dapat menganggu semipermeabilitas membran sel.Alkaloid bersifat toksik sehingga dapat melawan sel yang berasal dari organisme asing. Mekanisme kerja antimikroba dari alkaloid dapat berikatan dengan DNA sel sehingga mengganggu fungsi sel diikuti kematian sel.11 Uji coba efek antibakteri terhadap E.faecalis menggunakan keseluruhan ekstrak lerak dalam pelarut etanol tanpa memisah-misah senyawa yang terkandung di dalamnya sehingga tidak diketahui zat aktif mana yang memiliki efek antibakteri paling besar pada lerak.
E.faecalis merupakan bakteri yang bisa bertahan pada kondisi di bawah tekanan. Saluran akar yang terinfeksi merupakan suatu kondisi di mana nutrisi kurang memadai, adanya toksin dari bakteri lain dan invasi dari medikamen endodontik. Hal ini menyebabkan perubahan fisiologi yang spesifik sebagai suatu respon yang bertindak sebagai mekanisme pertahanan dari tekanan lingkungan. Pada fase ini
lipoteichoic acid yang kuantitasnya menjadi 2 kali lipat sehingga dinding sel lebih kuat dan lebih tahan terhadap kerusakan mekanis. 31,30 Membran sel merupakan membran selektif terhadap zat-zat yang berada di sekitarnya, memiliki saluran khusus yang memudahkan difusi pasif senyawa hidrofilik dengan berat molekul rendah seperti ion dan molekul yang besar menembusnya secara relatif lambat.29Selain itu, bakteri ini juga dapat bertahan dari detergen, logam berat dan bahkan etanol.4 Hal ini membuat bahan coba ekstrak lerak dalam pelarut etanolbutuh konsentrasi yang besar untuk menghambat pertumbuhan dan membunuh bakteri E,faecalis.
Selain daya antibakteri, lerak memiliki sifat-sifat yang mendukung untuk dikembangkan menjadi bahan irigan yang baik. Penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan bermakna antara celah mikro dan kekuatan tarik resin komposit dengan dentin yang dihasilkan ekstrak lerak dalam pelarut etanol 0,01 % dengan kombinasi NaOCl 5 % dan EDTA 18 %.12,13 Meskipun demikian, uji antibakteri ekstrak lerak yang dilakukan masih merupakan hasil penelitian in vitro. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian secara in vivo sebagai lanjutan penelitian ini sehingga bahan ini dapat digunakan secara klinis.
BAB 7