Sejalan dengan pemahaman terkini di bidang genomik mengenai implikasi variasi genetik terhadap penelitian biomedis (Haus et al. 2014), maka identifikasi SNP pada gen LDLR yang terkait sensitivitas terhadap diet aterogenik merupakan terobosan dalam mengoptimalkan penggunaan hewan coba berdasarkan variasi genetik pada gen fungsional. Secara historis kebanyakan variasi skala besar pada satwa primata, sebagai hewan outbred, difokuskan pada variasi netral sebagai alat uji asal geografis, status hubungan, inbreding, atau untuk pemodelan sejarah geografis (Kimura 1968). Saat ini telah tersedia sekuen genom utuh (whole genome sequences, WGS) dari satu monyet ekor panjang Mauritian dan Malaysia (Yan et al.
2011; Ebeling et al. 2011; Higashino et al. 2012), empat monyet rhesus India dan dua monyet rhesus China (Fang et al. 2011), dan satu monyet Tibetan (Fan et al. 2014). Selain itu tersedia pula data variasi genetik dari gen-gen yang terlibat dalam sistem imun, namun digunakan untuk mempelajari asal populasi (Blancer et al. 2012; Satkoski et al. 2013; Street
et al. 2007), sejarah evolusi (Cagliani et al. 2012), dan mempelajari status
hubungan antar spesies (Adkin dan Wu 2012).
Data variasi netral juga memberikan dasar penting bagi pemahaman karakteristik fisiologi dan penyebab genetik yang mendasarinya (Harris et al. 2014). Misalnya monyet ekor panjang asal Mauritian diketahui lebih cepat mencapai kematangan seksual dibandingkan monyet ekor panjang asal daratan utama Asia (Luetjens dan Weinbauer 2012). Demikian pula pada kajian vaksin, monyet ekor panjang dari Mauritian memberikan respons yang berbeda terhadap imunisasi Shigella dibandingkan monyet ekor panjang bukan asal Mauritian (Seekatz et al. 2013). Pada penelitian simian
atau human immunodeficiency virus (SIV/HIV), variasi genomik primata dapat mempengaruhi replikasi viral serta pengendalian infeksi. Gejala mirip
acquired immunite deficiency syndrome (AIDS) lebih terlihat pada monyet
rhesus asal India dibandingkan asal China (Trichel et al. 2002).
Kajian variasi genetik pada gen-gen fungsional dan pengaruhnya terhadap fenotip tertentu juga telah dilaporkan, namun jumlahnya masih sedikit dibandingkan jumlah total penelitian biomedis yang dilakukan pada satwa primata dan umumnya muncul secara sporadis sebagai respons terhadap kebutuhan spesifik dari hewan model. Misalnya polimorfisme pada
gen tripartate motif-containing protein 5’alpha (TRIM5α) telah dilaporkan
mempengaruhi replikasi SIV. Adanya variasi genetik menjadikan monyet rhesus asal India sebagai model hewan yang cocok untuk mempelajari HIV pada manusia (Newman et al. 2006). Demikian pula dengan polimorfisme
gen tryptophan hidroxilase 2 (TPH2) dan respons stres monyet rhesus
(Chen et al. 2006), polimorfisme gen neuropeptide Y (NYP) dan adaptasi perilaku terhadap stres dan konsumsi alkohol (Lindell et al. 2010), serta polimorfisme gen necrosis factor-alpha (TNF-α) dan kerentanan monyet ekor panjang dan rhesus terhadap malaria (Flynn et al. 2009).
Identifikasi polimorfisme pada gen LDLR monyet ekor panjang yang terkait dengan sifat respons dalam penelitian ini merupakan temuan penting karena berimplikasi terhadap pemilihan hewan coba yang sesuai untuk
kajian terkait aterosklerosis berdasarkan penanda genetik dan hal ini belum pernah dilaporkan sebelumnya. Kajian polimorfisme pada gen LDLR
umumnya dilakukan pada manusia untuk mengidentifikasi keterkaitan antara SNP dan profil lipid darah normal atau kerentanan terhadap hiperkolesterolemia (Boright et al. 1998; Knoblauch et al. 2002; Knoblauch
et al. 2004; Muallem et al. 2007; Willer et al. 2008; Linsel-Nitsche et al.
2008). Hampir seluruh SNP yang diindentifikasi bersifat tidak fungsional sehingga menunjukkan bahwa mereka berada dalam disequilibrium linkage
dengan SNP lain yang bersifat fungsional. SNP fungsional pertama dalam gen LDLR manusia yang terkait profil lipid darah normal adalah alel 1773T (rs688) yang terletak pada ekson 12 (Zu et al. 2007). SNP ini bersifat fungsional karena menyebabkan transkripsi tanpa ekson 12. Transkripsi tanpa ekson 12 menyebabkan terjadinya perubahan kerangka baca dan protein terminasi dini sehingga kadar kolesterol total dan LDL-C meningkat. Pada satwa primata laporan mengenai variasi genetik yang terkait profil lipid darah adalah mutasi pada ekson 6 gen LDLR monyet rhesus. Alel 843A menghasilkan kodon stop sehingga reseptor LDL tidak terbentuk dan menyebabkan hiperkolesterolemia “spontan” (Hummel et al.
1990). Rangkuman kajian SNP pada gen LDLR pada manusia dan monyet rhesus yang terkait dengan profil lipid darah ditunjukkan pada Tabel 25.
Selain itu dalam Tabel 25 ditunjukkan pula SNP pada gen LDLR
monyet ekor panjang yang berhasil diidentifikasi pada penelitian ini. SNP yang terletak dalam daerah ekson semuanya tidak mengubah susunan asam amino karena terletak pada posisi ke-3 dari kodon. Dari 19 SNP yang ditemukan hanya 5, yaitu −571A>T dan −416C>T (pada promotor), 825C>G (dalam ekson 6), IVS5−6C>G (dalam intron 5), dan *167G>C yang terkait dengan sifat respons sehingga berpotensi digunakan sebagai penanda genetik. SNP−571A>T dan −416C>T terkait dengan sifat hipo- respons, IVS5−6C>G terkait dengan sifat hipo-respons atau ekstrem, 825C>G dan *167G>C terkait dengan sifat ekstrem. Keberadaan −571A>T yang bukan merupakan sisi pengikatan faktor transkripsi, SNP 825G yang tidak mengubah susunan asam amino, dan SNP IVS5−6G pada daerah intron menunjukkan bahwa ketiga SNP ini berada dalam disequilibrium
linkage dengan SNP lain yang bersifat fungsional dalam mempengaruhi
sifat respons monyet ekor panjang. Satu-satunya SNP fungsional putatif adalah −416C>T pada daerah promotor. Keberadaan alel −416T pada individu hipo-responder yang merupakan sisi potensial pengikatan faktor transkripsi menyebabkan peningkatan ekspresi gen LDLR sehingga mekanisme pembersihan kolesterol oleh reseptor LDL tetap terjadi walaupun kolesterol dalam sel tinggi. Hal ini menjelaskan mengapa kadar kolesterol plasma pada individu hipo-responder tetap rendah setelah mengkonsumsi diet aterogenik. Umumnya bila pool kolesterol hepatik tinggi, setelah hewan mengkonsumsi diet aterogenik, transkripsi gen LDLR
akan ditekan sehingga mekanisme pembersihan kolesterol menurun. Akibatnya kolesterol plasma semakin meningkat (Dawson et al. 1988). Letak alel −416C>T yang merupakan sisi potensial pengikatan faktor transkripsi yang jauh dari sekuen pengatur utama dan meningkatkan ekspresi gen belum dilaporkan pada manusia.
64
Tabel 25 Polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) pada gen LDLR
Letak Perubahan
nukleotida
Posisi nukleotida
Pengaruh Spesies Referensi
Promotor A>T −571 - MEP (1)
C>T −416 Fungsional MEP (1)
5‟UTR A>G −169 - MEP (1)
Ekson 2 C>T rs2228671 - Manusia (2)
Ekson 4 C>T 408 - MEP (1)
Ekson 6 C>G 825 - MEP (1)
G>A 843 Fungsional Rhesus (3)
Ekson 9 C>T 1200 - MEP (1) Ekson 10 C>T 1497 - MEP (1) G>A rs5930 - Manusia (4) Ekson 11 T>C 1644 - MEP (1) Ekson 12 C>T 1791 - MEP (1) C>T sr688 Fungsional Manusia (5)
Intron 13 A>G rs5925 - Manusia (6)
Ekson 14 C>T 2088 - MEP (1)
C>T rs5927 Manusia (4)
Ekson 15 C>T rs5927 - Manusia (4)
Intron 1 G>T rs6511720 - Manusia (7)
Intron 4 A>C rs885765 - Manusia (4)
Intron 5 T>C IVS5+99 - MEP (1)
G>T IVS5+173 - MEP (1)
A>G IVS5+327 - MEP (1)
C>T IVS5−96 - MEP (1)
C>G IVS5−6 - MEP (1)
3‟UTR G>A *42 - MEP (1)
G>C *167 - MEP (1) G>A *210 - MEP (1) C>T *290 - MEP (1) G>A rs14158 - Manusia (8) G>A rs3826810 - Manusia (8) C>G rs2738464 - Manusia (8) G>A rs2738465 - Manusia (8) C>T rs1433099 - Manusia (8) A>G rs2738466 - Manusia (8)
Ket, MEP = monyet ekor panjang, (1) = Taher et al. 2016, (2) = Linsel- Nitschke et al. 2008, (3) = Hummel et al. 1990, (4) = Knoblauch et al. 2002, (5) = Zhu et al. (2007), (6) = Knoblauch et al. 2004, (7) = Willer et al. 2002, (8) = Muallem et al. 2007
Pada daerah promotor gen LDLR manusia kebanyakan sekuen pengatur terletak berkelompok dalam daerah 280 pb upstream dari kodon inisiasi (Sudhof et al. 1987). Transkripsi LDLR terutama diatur oleh sterol melalui SREBP dan sisi pengikatannya SRE-1 dalam R2 (Briggs et al.
1993; Dawson et al. 1998; Yokohama et al. 1993). R1 dan R3 berfungsi mengikat Sp1 dan berkontribusi terhadap ekspresi dasar gen LDLR. R1 dan R3 juga bekerja sama dengan R2 dalam mengatur ekspresi gen LDLR oleh sterol (Smith et al. 1990). Selain itu terdapat SIRE yang meliputi nukleotida
−94 hingga 110 dan termasuk boks TATA kedua. Daerah ini tidak terlibat dalam pengaturan balik klasik oleh kolesterol, tetapi berperan dalam regulasi yang termediasi oleh onkostatin, cAMP, dan C/EBP. Ada pula protein transaktivator yang disebut hnRNP yang mengenali untai tunggal elemen kaya CT pada R3 yang tidak bergantung pada elemen pengatur kolesterol SRE-1/SREBP (Liu et al. 2000).
SNP lain yang kemungkinan juga fungsional adalah *167G>C pada 3‟UTR. Sifat SNP *167G>C yang singleton diduga merupakan sisi potensial target microRNAs (miRNA). miRNA merupakan RNA kecil
endogenous bukan penyandi yang ditranskripsi dari sekuen genomik,
dipecah menjadi prekursor miRNA (pre-miRNA) dan selanjutnya diproses menjadi miRNAs matang yang memiliki sekitar 22 nukleotida (Bartel 2004). Pada hewan miRNA berhibridisasi pada 3‟UTR dan memediasi pemecahan mRNA atau penghambatan translasi (Ambros 2004; Jin dan Li 2013). miRNA termasuk kelompok pengatur ekspresi gen pasca transkripsi untuk hampir seluruh jalur dan jaringan biologis (Ke et al. 2003). Hasil penelitian terkini, menunjukkan bahwa terdapat miRNA, yaitu miR-128-1, miR-148a, miR-130b, dan miR-301b menunjukkan peran signifikan dalam mengontrol ekspresi protein utama yang terlibat metabolisme lipoprotein, seperti reseptor LDL dan pengangkut kolesterol ATP-binding cassette A1
(ABCA1) (Wagschal et al. 2015). Keberadaan alel *167C pada individu ekstrem yang diduga merupakan sisi potensial target miRNA kemungkinan menekan ekspresi gen LDLR sehingga mekanisme pembersihan kolesterol oleh reseptor LDL semakin menurun. Hal ini menjelaskan mengapa kadar kolesterol plasma pada individu ekstrem sangat tinggi.
Kesamaan pengelompokkan hewan T3707 dan K30 berdasarkan status kolesterol plasma setelah 3 bulan diet aterosklerosis dan jenis haplotipe yang dimiliki pada intron 5 dan ekson 6 gen LDLR menunjukkan bahwa individu hipo-responder dapat dipisahkan dari hiper-responder berdasarkan keberadaan SNP. Alel yang merupakan penanda spesifik bagi individu dengan sifat hiper-respons adalah alel C pada intron 5 (posisi IVS5−6), sedangkan alel G adalah penanda bagi monyet yang tidak bersifat hiper- respons. Selain itu alel G pada ekson 6 (posisi 825) merupakan penanda genetik bagi individu dengan sifat ekstrem.
Pemisahan hewan T3707 dalam kelompok tersendiri berdasarkan jenis haplotipe pada daerah promotor menunjukkan bahwa alel T pada posisi −416 juga berpotensi sebagai penanda genetik sifat hipo-respons. Keberadaan alel T pada posisi −416 menguatkan hasil pengelompokkan hewan hipo-responder berdasarkan alel pada intron 5. Data kelimpahan mRNA individu T3707 yang lebih tinggi dibanding individu lain mendukung dugaan sebelumnya bahwa polimorfisme yang terjadi pada posisi −416 bersifat fungsional, yaitu meningkatkan ekspresi gen LDLR. Sifat fungsional alel T pada posisi −416 menunjukkan bahwa individu T3707 adalah hipo-responder ekstrem, sementara hewan K30 adalah hipo- responder dan bagaimana mekanismenya dalam mempertahankan kolesterol plasma masih belum jelas. Data konsumsi diet selama tiga bulan juga menguatkan bahwa individu T3707 adalah hipo-responder ekstrem karena merupakan individu dengan konsumsi tinggi namun status kolesterol
66 Individu hiper- responder Individu hipo- responder Individu ekstrem
plasmanya paling rendah. Selain itu pemisahan hewan C0613 dalam kelompok tersendiri dengan alel C pada posisi *167 dalam 3‟UTR menunjukkan bahwa alel ini juga berpotensi sebagai penanda genetik sifat ekstrem. Kelimpahan mRNA individu C0613 yang lebih rendah dibandingkan individu lainnya mendukung dugaan sebelumnya bahwa alel C pada posisi *167 merupakan sisi potensial target miRNA yang menekan ekspresi gen LDLR dan menunjukkan bahwa individu ini adalah sangat ekstrem. Data konsumsi diet dan status kolesterol selama tiga bulan juga menguatkan bahwa individu C0613 adalah sangat ekstrem karena merupakan individu dengan konsumsi paling paling rendah namun status kolesterol plasmanya paling tinggi.
Keterkaitan polimorfisme dalam gen LDLR dengan sensitivitas monyet ekor panjang terhadap diet aterogenik menjadikan SNP berpotensi dijadikan sebagai dasar seleksi sifat respons hewan jika mereka menuruti pola ini. Implementasi SNP yang diperoleh dalam penelitian ini untuk menyeleksi sifat respons ditunjukkan pada Gambar 15 dan 16. Pada Gambar 15 ditunjukkan penggunaan sekuen ekson 6 sebagai seleksi awal individu hiper-responder dari individu bukan hiper-responder (hipo-responder dan ekstrem). Ekson 6 dipilih karena hanya memiliki dua situs polimorfik dan letaknya hanya berbeda belasan nukleotida sehingga haplotipenya lebih mudah diidentifikasi. Hewan dengan haplotipe CC merupakan individu hiper-reponder, sedangkan hewan dengan haplotipe CG dan GG masing- masing adalah individu hipo-responder dan ekstrem.Seleksi lanjut untuk lebih menguatkan pengelompokkan individu hipo-responder atau ektrem ditunjukkan pada Gambar 16. Alel T pada posisi -416 dalam daerah promotor menunjukkan individu hipo-responder ekstrem, sedangkan alel C menunjukkan hiper-responder. Selain itu alel C pada posisi *167 dalam 3‟UTR menunjukkan individu sangat ekstrem, sedangkan alel G menunjukkan hiper-responder.
Gambar 15 Seleksi awal untuk memisahkan hewan hiper-responder dari hipo-responder dan ekstrem berdasarkan haplotipe pada ekson 6 Populasi monyet ekor panjang Individu dengan haplotipe CC Sekuensing ekson 6 Individu dengan haplotipe GC Individu dengan haplotipe GG
Gambar 16 Seleksi lanjut untuk mendapatkan individu hipo-responder ekstrem dan individu sangat ekstrem berdasarkan SNP pada promotor dan 3‟UTR
Identifikasi variasi genetik dalam daerah gen LDLR sebagai penanda genetik menjadikan seleksi hewan berdasarkan sensitivitasnya menjadi lebih cepat dan efisien. Penggunaan penanda genetik sebagai dasar seleksi monyet hipo-responder dan ekstrem dari hiper-responder tidak membutuhkan perlakuan dan pengontrolan yang ketat terhadap diet. Hal ini menyebabkan waktu yang dibutuhkan lebih cepat sehingga sangat mengurangi biaya pemeliharaan dan diet hewan selama periode seleksi di pusat-pusat pemeliharaan satwa primata. Selain itu pengambilan volume darah hewan dengan jumlah kecil dan hanya dilakukan satu kali turut mendukung prinsip 3R (reduction, refinement dan replecement). Tabel 26 menunjukkan efisiensi metode penanda genetik dalam seleksi sensitivitas hewan sehingga dapat menekan biaya penelitian yang menggunakan monyet ekor panjang sebagai hewan model.
Sekuensing 3‟UTR Individu sangat ekstrem Sekuensing promotor Individu hipo- responder ekstrem Individu hiper- responder Individu dengan alel IVS5−6 G Individu dengan alel *167 C Individu dengan alel *167 G Individu dengan alel −416 T Individu dengan alel −416 C Individu hiper- responder
68
Tabel 26 Perbandingan metode seleksi sensitivitas monyet ekor panjang berdasarkan status kolesterol plasma dan penanda genetik
Metode seleksi
Uraian Status kolesterol plasma Penanda genetik
Perlakuan Diet aterogenik -
Pengontrolan Konsumsi diet -
Waktu seleksi 2-3 bulan 1-2 minggu
Volume darah Banyak Sedikit
Seleksi hewan coba sebelum digunakan dalam penelitian terkait aterosklerosis adalah hal yang sangat penting karena dapat meningkatkan akurasi dan efisiensi kajian keilmuan sehingga sangat mendukung keberhasilan penelitian. Seleksi awal juga akan mengurangi jumlah hewan coba yang digunakan sehingga mendukung prinsip 3R. Selain itu seleksi hewan berdasarkan variasi genetik dapat mengurangi keterbatasaan penggunaan satwa primata sebagai model dalam kajian genetik terhadap penyakit kompleks (VandeBerg & Williams-Blangero 1997). Penggunaan hewan yang seragam secara genetik tertentu akan lebih memberikan kekuatan analisis statistik yang lebih besar terhadap variabel yang diuji, terutama pada sampel yang jumlahnya kecil (Vallender & Miller 2013). Bagi PSSP IPB, temuan yang diperoleh pada penelitian ini merupakan langkah awal untuk mengembangkan metode seleksi hewan berdasarkan variasi genetik.