Metode deteksi yang dilakukan untuk mengetahui keberadaan Potyvirus dan Fabavirus di pertanaman nilam yaitu dengan DAS-ELISA untuk mendeteksi Fabavirus, I-ELISA untuk mendeteksi Potyvirus dan RT-PCR untuk mendeteksi keduanya secara molekuler. Sampel tanaman yang diambil dari areal pertanaman nilam di daerah Bogor yaitu di Gunung Bunder dan di Cicurug memiliki gejala mosaik. Berdasarkan hasil ELISA pada sampel di lapangan, diketahui bahwa tanaman nilam positif terserang Potyvirus, Fabavirus dan keduanya. Tanaman yang positif terserang berdasarkan uji ELISA kemudian diekstraksi dan dilakukan uji molekuler menggunakan RT-PCR.
Penyakit mosaik tanaman nilam yang disebabkan oleh Potyvirus dan Fabavirus memiliki gejala yang tidak dapat dibedakan di lapangan (Gambar 3). Oleh karena itu deteksi dilakukan dengan menggunakan pasangan primer yang telah didesain khusus.
N
Gambar 3 Gejala mosaik pada daun nilam yang disebabkan oleh Potyvirus dan atau Fabavirus
Deteksi dengan RT-PCR memerlukan sepasang primer yang didesain khusus untuk mendeteksi virus secara terpisah. Primer-primer yang digunakan dalam metode ini yaitu CPUP(F)(5’-TGAGGATCCTGGTGYATHGARAAYGG-3’, Y = C/T, H = A/T/C, R = A/G), spesifik untuk coat protein pada Potyvirus dan CP9502(R)(5’-GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’) spesifik untuk ujung 3’ genom Potyvirus dengan prediksi ukuran produk 800 bp. Sedangkan pasangan primer yang spesifik digunakan untuk mendeteksi Fabavirus yaitu [BBWVVSSP
18
(5’- GTBTCDAGTGCTYTDGAAGG-3’, B = C, G, atau T; D = A, G, atau T; Y = C atau T) dan BBWVKMRM (5’-TDGWDCCATCVAGICKCATTTT-3’, W = A atau T; V = A, C, atau G; I = Inosine; K = G atau T)] dengan prediksi ukuran produk 322 bp mencakup wilayah dari C-terminal dari large coat protein (LCP) ke N-terminal small coat protein (SCP).
Validasi Pasangan Primer untuk Deteksi Potyvirus
Berdasarkan hasil deteksi RT-PCR menggunakan primer CPUP(F)(5’-TGAGGATCCTGGTGYATHGARAAYGG-3’) dan CP9502(R)(5’-GCGGATCC TTTTTTTTTTTTTTTTT-3’) terhadap sampel tanaman nilam yang telah diketahui terinfeksi Potyvirus dan Fabavirus secara tunggal dan ganda, dapat diketahui bahwa primer tersebut hanya memberikan sinyal positif pada sampel yang telah diketahui terserang Potyvirus. Seperti hasil yang tertera pada Gambar 4, terlihat bahwa pada sampel tanaman nilam yang terinfeksi tunggal oleh Potyvirus terbentuk pita DNA berukuran 800 bp.
Gambar 4 Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR menggunakan pasangan primer spesifik Potyvirus. Lajur 1: kontrol negatif dari tanaman sehat; lajur M: marker 100 bp DNA ladder; lajur 2: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi tunggal oleh Potyvirus; lajur 3: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi tunggal oleh Fabavirus; dan lajur 4: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi ganda oleh kedua virus Potyvirus dan Fabavirus.
800 bp
19
Pada sampel tanaman yang terinfeksi tunggal oleh Fabavirus tidak muncul pita karena Fabavirus tidak dapat dideteksi oleh primer Potyvirus. Pada sampel tanaman yang terinfeksi ganda oleh Potyvirus dan Fabavirus terlihat hanya satu pita DNA saja, yaitu pita DNA berukuran 800 bp saja yang merupakan pita DNA Potyvirus dan tidak terdapat pita yang berukuran 322 bp yang merupakan pita DNA Fabavirus. Demikian juga pada sampel tanaman yang sehat tidak terdapat pita DNA. Hasil ini menunjukkan kespesifikan pasangan primer CPUP(F) dan CP9502(R) untuk mendeteksi keberadaan Potyvirus.
Validasi Pasangan Primer untuk DeteksiFabavirus
Berdasarkan hasil deteksi RT-PCR menggunakan primer BBWVVSSP (5’- GTBTCDAGTGCTYTDGAAGG-3’, B = C, G, atau T; D = A, G, atau T; Y = C atau T) dan BBWVKMRM (5’-TDGWDCCATCVAGICKCATTTT-3’, W = A atau T; V = A, C, atau G; I = Inosine; K = G atau T) terhadap sampel tanaman nilam yang telah diketahui terinfeksi Potyvirus dan Fabavirus secara tunggal dan ganda, dapat diketahui bahwa primer tersebut hanya memberikan sinyal positif pada sampel yang telah diketahui terserang Fabavirus. Seperti hasil yang tertera pada Gambar 5, terlihat bahwa pada sampel tanaman nilam yang terinfeksi tunggal oleh Fabavirus terbentuk pita DNA berukuran 322 bp.
Gambar 5 Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR menggunakan pasangan primer spesifik Fabavirus. Lajur 1: kontrol negatif dari tanaman sehat; lajur M: marker 100 bp DNA ladder; lajur 2: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi tunggal oleh Potyvirus; lajur 3: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi tunggal oleh Fabavirus; dan lajur 4: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi ganda oleh kedua virus Potyvirus dan Fabavirus.
322 bp
20
Pada sampel tanaman yang terinfeksi tunggal oleh Potyvirus tidak muncul pita karena Potyvirus tidak dapat dideteksi oleh primer Fabavirus. Pada sampel tanaman yang terinfeksi ganda oleh Potyvirus dan Fabavirus terlihat hanya satu pita DNA saja, yaitu pita DNA berukuran 322 bp saja yang merupakan pita DNA Fabavirus dan tidak terdapat pita yang berukuran 800 bp yang merupakan pita DNA Potyvirus. Demikian juga pada sampel tanaman yang sehat tidak terdapat pita DNA. Hasil ini menunjukkan kespesifikan pasangan primer BBWVVSSP dan BBWVKMRM untuk mendeteksi Fabavirus.
Validasi Pasangan Primer untuk Deteksi Simultan Potyvirus dan Fabavirus Metode RT-PCR dengan menggunakan primer Potyvirus dan Fabavirus telah terbukti dapat mendeteksi kedua virus secara terpisah. Untuk mendeteksi secara simultan Potyvirus dan Fabavirus pada tanaman nilam yang terinfeksi ganda digunakan metode yang berbeda dimana kedua pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus digunakan secara bersamaan tercampur dengan komponen PCR yang lain. Hasil yang diperoleh jika pasangan primer tersebut digunakan secara bersamaan terlihat pada Gambar 6.
Seperti terlihat pada gambar tersebut, pada lajur 1 tidak terdapat pita DNA yang muncul karena sampel merupakan kontrol tanaman sehat. Pada lajur 2 yang merupakan sampel positif terinfeksi tunggal oleh Potyvirus terlihat hanya pita DNA Potyvirus berukuran 800 bp. Hal ini disebabkan pasangan primer Potyvirus hanya mendeteksi virus yang spesifik yaitu Potyvirus saja, sedangkan Fabavirus tidak terdeteksi. Begitu pula jika sampel yang digunakan merupakan sampel yang terinfeksi tunggal oleh Fabavirus seperti ditunjukkan pada lajur 3 maka pita DNA yang muncul yaitu pita DNA Fabavirus dengan panjang 322 bp.
21
Gambar 6 Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR menggunakan campuran primer Potyvirus dan Fabavirus. Lajur 1: kontrol negatif dari tanaman sehat; lajur M: marker 100 bp DNA ladder; lajur 2: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi tunggal oleh Potyvirus; lajur 3: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi tunggal oleh Fabavirus; dan lajur 4: sampel daun tanaman nilam yang positif terinfeksi ganda oleh kedua virus Potyvirus dan Fabavirus.
Pada lajur 4, yang merupakan sampel tanaman yang terinfeksi ganda oleh Potyvirus dan Fabavirus, terdapat 2 pita DNA yang muncul karena kedua virus tersebut terdeteksi oleh kedua pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus sehingga kedua pasangan primer akan menempel pada pasangan DNA masing-masing. Pasangan primer Potyvirus akan menempel pada DNA Potyvirus dan pasangan primer Fabavirus akan menempel pada DNA Fabavirus. Meskipun terdapat pada satu lajur, kedua pita tersebut dapat terlihat jelas karena perbedaaan ukurannya. Pita DNA Potyvirus berada di bagian atas dengan panjang 800 bp sedangkan pita DNA Fabavirus berada di bagian bawah dengan panjang 322 bp.
Dengan metode pencampuran kedua primer ini maka dapat diketahui bahwa kedua primer Potyvirus dan Fabavirus dapat digunakan untuk mendeteksi kedua virus ini, baik yang terinfeksi tunggal maupun yang terinfeksi ganda. Selain untuk mendeteksi virus, metode RT-PCR dengan kedua pasang primer ini juga dapat diterapkan untuk diagnostik sampel dari lapangan.
Penerapan Metode RT-PCR untuk Deteksi Simultan Potyvirus dan Fabavirus pada Sampel dari Lapangan
Hasil deteksi dengan menggunakan RT-PCR untuk sampel yang berasal dari lapangan dapat dilihat pada Gambar 7. Pada lajur 1,2 dan 3 berfungsi sebagai
800 bp
M 1 2 3 4
22
kontrol, yaitu untuk lajur 1 merupakan sampel tanaman sehat, lajur 2 merupakan sampel tanaman yang positif terinfeksi tunggal Potyvirus dan lajur 3 oleh Fabavirus. Lajur 4 sampai lajur 16 merupakan sampel dari lapangan, yaitu dari Gunung Bunder dan Cicurug, keduanya dari wilayah Bogor.
Gambar 7 Hasil amplifikasi DNA genom virus dengan metode RT-PCR menggunakan campuran pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus terhadap sampel dari lapangan. Daun tanaman nilam yang positif sehat (lajur 1), sampel yang positif terinfeksi tunggal oleh Potyvirus (lajur 2), sampel yang positif terinfeksi tunggal oleh Fabavirus (lajur 3), sampel yang berasal dari Cicurug (lajur 4, 7, 11, 15), Gunung Bunder (lajur 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16), dan marker 100 bp DNA ladder (lajur M).
Berdasarkan RT-PCR yang dilakukan dengan menggunakan pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus yang dicampur dapat diketahui bahwa sampel yang positif terinfeksi oleh Potyvirus ditandai adanya pita DNA dengan panjang 800 bp dan yang terinfeksi oleh Fabavirus ditandai oleh adanya pita DNA 322 bp. Terlihat juga bahwa dua sampel lajur 4 yang berasal dari Cicurug dan lajur 8 yang berasal dari Gunung Bunder tidak terdeteksi terinfeksi Potyvirus maupun Fabavirus. Namun sampel tanaman lainnya yang diuji menunjukkan hasil yang positif. Ada yang terinfeksi tunggal Potyvirus seperti pada lajur 5,9,14 dan 16 yang berasal dari sampel Gunung Bunder dan lajur 7 dan 15 yang berasal dari sampel Cicurug. Sampel yang positif terinfeksi Fabavirus dapat dilihat pada lajur 6 dan 10 yang berasal dari Gunung Bunder dan lajur 11 yang berasal dari Cicurug. Selain itu, dapat diketahui pula sampel yang terinfeksi ganda oleh Potyvirus dan
800 bp 322 bp
23
Fabavirus seperti yang ditunjukkan pada lajur 12 dan 13 yang keduanya merupakan sampel dari Gunung Bunder.
Berdasarkan gejalanya pada tanaman nilam, Potyvirus dan Fabavirus tidak dapat dibedakan. Namun dengan metode RT-PCR, infeksi Potyvirus dan Fabavirus pada tanaman nilam dapat dibedakan dari besarnya ukuran panjang pita DNA yang terbentuk setelah dilakukan amplifikasi.