HASIL PENELITIAN
5.1 Uji Efektifitas Antibakteri
Pengujian efektifitas antibakteri bahan coba dilakukan dengan mengamati perubahan kekeruhan pada tiap konsentrasi bahan coba. Dimulai dari konsentrasi 8%, 4%, 2%, 1%, 0,5% dan 0,25%. Perubahan yang terjadi ditandai dengan hasil biakan mulai tampak jernih bila dibandingkan dengan kontrol (Mc Farland) yang diinkubasi 24 jam). Selanjutnya, dilakukan penghitungan jumlah bakteri menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra yang bertujuan membuktikan bahwa perubahan tingkat kekeruhan pada setiap konsentrasi menunjukkan kemampuan bahan coba membunuh bakteri sebesar 99%-100%, yang disebut dengan MBC (Minimum Bactericidal Concentration).
Setelah dilakukan prosedur pengujian efek antibakteri, pada bahan coba minyak atsiri kayu manis 0,5% tidak dijumpai pertumbuhan bakteri dalam media perbenihan yang berarti bahwa semua bakteri Enterococcus faecalis mati. Sedangkan pada penentuan MIC, kekeruhan tabung tidak berubah sehingga dianggap tidak representatif untuk mengukur nilai MIC. Oleh karena itu, nilai MIC tidak dapat diketahui.
Tabel 2. Perhitungan jumlah bakteri untuk bahan coba minyak atsiri kayu manis Bahan Uji Replikasi Kons. 8% (CFU/ml )* Kons. 4% (CFU/ml )* Kons. 2% (CFU/ml )* Kons. 1% (CFU/ml )* Kons. 0,5% (CFU/ml )* Kons. O,25% (CFU/ml )* Kontrol Mc Farland (CFU/ml) * minyak atsiri 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1, 1. 102 1, 18. 102 1, 16. 102 9, 6. 101 1. 108 kayu manis 2 0 0 0 0 3 0 0 0 0 4 0 0 0 0
Keterangan: 0 CFU/ml = steril, tidak dijumpai pertumbuhan bakteri Setiap CFU/ml telah dikali 20 (faktor pengali)
Dari tabel, terlihat bahwa pengujian antibakteri (penghitungan jumlah koloni yang terbentuk) terhadap Enterococcus faecalis pada bahan coba minyak atsiri kayu manis pada konsentrasi 0,5% adalah steril (0 CFU/ml), yang berarti bahwa setelah penanaman pada media MHA dan diinkubasi selama 24 jam tidak terlihat adanya pertumbuhan bakteri atau koloni bakteri, sehingga dapat disimpulkan bahwa MBC dari bahan coba minyak astiri kayu manis adalah 0,5% terhadap Enterococcus faecalis. Data hasil penelitian ini tidak dapat dilakukan uji secara statistik karena nilai perhitungan koloni bakteri adalah 0 yang artinya tidak dijumpai pertumbuhan bakteri dalam media perbenihan atau bakteri yang berkontak dengan bahan coba 100% mengalami kematian.
(i) (ii)
(iii) (iv)
Gambar 14. Menunjukkan koloni yang terbentuk pada media MHA dengan konsentrasi minyak atsiri kayu manis 0,25%, (i) replikasi ke 1, (ii) replikasi ke 2, (iii) replikasi ke 3, (iv) replikasi ke 4.
BAB 6 PEMBAHASAN
Penelitian eksperimental laboratorium secara in vitro mengenai minyak atsiri kayu manis terhadap Enterococcus faecalis adalah untuk membuktikan bahwa minyak atsiri kayu manis memiliki efek antibakteri dalam hal menghambat pertumbuhan Enterococcus faecalis. Pada tahap awal, pengujian efek antibakteri dari suatu bahan dilakukan secara in vitro.Ada dua metode untuk menentukan aktifitas antibakteri, yaitu agar diffusion test dan direct exposure test (metode dilusi). Pada metode agar diffusion test, ukuran zona inhibisi antibakteri tergantung daripada kelarutan dan difusi bahan coba pada media, sehingga kemungkinan kurang efektif dalam menginhibisi mikroorganisme. Dalam penelitian ini dilakukan pengujian efek antibakteri dari minyak atsiri kayu manis terhadap Enterococcus faecalis dengan metode dilusi. Dengan metode ini bahan coba dapat berkontak langsung dengan mikroorganisme, sehingga hasil yang diperoleh lebih akurat dan dapat diketahui nilai MIC dan MBC dari bahan coba seperti yang direkomendasikan oleh National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, USA). 11
Penelitian dilakukan dengan metode dilusi dengan cara pengenceran ganda. Penetapan rentang konsentrasi didasarkan pada penelitian terdahulu dimana telah diketahui bahwa nilai Minimum Fungisidal Concentration (MFC) minyak atsiri kayu manis terhadap Candida albicans adalah 1%. Oleh karena itu pada penelitian ini konsentrasi dimulai dari 8%, 4%, 2%, 1%, 0,5% dan 0,25%. Pada masing-masing
konsentrasi dilakukan replikasi sebanyak 4 kali untuk hasil yang lebih akurat dan mengetahui berapa rata-rata jumlah bakteri yang tumbuh pada minyak atsiri kayu manis dalam berbagai konsentrasi karena pada konsentrasi yang sama belum tentu jumlah bakteri yang tumbuh juga sama.
MIC dilihat dari konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi 24 jam dan tidak menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri secara makroskopik yang dapat dilihat dari hasil biakan pada tabung yang mulai tampak jernih dengan menggunakan metode dilusi, sedangkan MBC dilihat dari konsentrasi minimal bahan uji pada biakan padat (MHA) dimana tidak terlihat pertumbuhan bakteri atau seluruh bakteri mati pada media perbenihan.
Pada penelitian untuk mengetahui nilai MIC menunjukkan bahwa dari semua konsentrasi bahan coba yang diuji ternyata tidak dapat terlihat larutan yang mulai tampak jernih. Dalam hal ini, bahan coba itu sendiri berwarna kuning keruh, sehingga sehingga dianggap tidak representatif untuk dicari nilai MIC. Hal ini tidak bisa dibedakan apakah terjadi pertumbuhan bakteri yang cepat, atau karena tumpukan sel bakteri mati. Oleh karena itu perlu dilakukan tindakan lebih lanjut untuk perhitungan jumlah koloni bakteri dengan metode Drop Plate Mills Mesra.
Pada penelitian untuk mengetahui MBC, setelah ditanam di MHA dan diinkubasi selama 24 jam, pada konsentrasi 8% tidak terlihat adanya pertumbuhan bakteri (steril), begitu juga pada konsentrasi 4%, 2%, 1%, 0,5%. Pada konsentrasi 0,25 % sudah terlihat pertumbuhan bakteri pada media perbenihan. Oleh karena itu, dapat diketahui bahwa nilai MBC adalah 0,5 %.
Walaupun nilai MIC tidak diketahui, hasil penelitian menunjukkan bahwa bahan coba minyak atsiri kayu manis memiliki efek antibakteri terhadap Enterococcus faecalis dengan nilai MBC 0,5%. Dengan demikian hipotesis penelitian diterima. Ada perbedaan hasil penelitian efek antibakteri minyak atsiri kayu manis terhadap berbagai jenis bakteri dan jamur. Penelitian membuktikan bahwa minyak atsiri kayu manis mempunyai efek antibakteri terhadap Candida albicans dengan nilai Minimum Fungisidal Concentration (MFC) 1%. Nilai MBC yang diperoleh peneliti berbeda dengan konsentrasi peneliti sebelumnya, hal ini terjadi kemungkinan metode, bakteri, atau bahan yang digunakan berbeda.
Tujuan dan metode yang digunakan peneliti untuk pengujian efek antibakteri minyak atsiri kayu manis terhadap Enterococcus faecalis dan Candida albicans adalah sama, yaitu untuk mencari konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh 99,9 % atau 100 % bakteri (MBC) atau jamur (MFC). Metode yang digunakan adalah metode dilusi. dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada media padat menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra. Bahan coba yang berbeda dapat menyebabkan hasil yang berbeda karena ada kemungkinan ada perbedaan kadar senyawa aktif yang terkandung dalam minyak atsiri.
Morfologi dan sifat bakteri dan jamur yang berbeda diduga menyebabkan perbedaan aktifitas dan besar konsentrasi bahan coba dalam membunuh sel bakteri tersebut. Perbedaan morfologi bakteri tersebut dapat dilihat pada tabel berikut.
Tabel 3. Perbedaan morfologi Enterococcus faecalis dan Candida albicans14,27,28
Nama bakteri E.faecalis C.albicans
Membran sel - Peptidoglikan (40%)
- Polisakarida (gliserol posfat, glukosa, galaktosa) - Teichoic Acid - LTA - Glukan - Mannan - Kitin - Protein (6 % - 25 %) - Lipid (1 % - 7 %) Daya tahan - pH 4-11 - 5°C -50°C - AS (mengikat neutrofil)
- Resisten terhadap antibiotik spektrum luas
- Mutasi DNA
bertahan pada suasana asam atau basa tergantung lingkungannya. Pada suasana anaerob, tumbuh lebih baik suasana asam daripada netral ataupun basa
Pada ekologi yang keras & defisiensi nutrisi.
- VBNC (+) (LTA ↑ sehingga
lebih resisten terhadap kerusakan mekanis, PBP ↑ sehingga
resisten terhadap penisilin) - Katabolisasi energy dari
karbohidrat, gliserol, malat, sitrat, laktat.
- Sekresi protease (tetap hidup pada lingkungan yang minim nutrisi) - Perubahan fenotip (adaptasi pada
lingkungan yang keras)
Pada dasarnya, dinding sel Enterococcus faecalis terdiri dari peptidoglikan sebanyak 40 %, sisanya merupakan teichoic acid dan polisakarida (Gambar 16).25 Keseimbangan antara enzim polimerisasi dan hidrolitik menghasilkan sintesis peptidoglikan.26
Sedangkan dinding sel Candida albicans berperan penting dalam aspek biologis dan patogenesitas. Sekitar 80-90% dari dinding sel Candida albicans merupakan karbohidrat, yang terdiri dari tiga unsur pokok polisakarida yakni glukan, kitin, dan mannan yang dihubungkan dengan strukturnya yang kaku, dan mannoprotein (gambar 2). Selain itu dinding sel juga mengandung protein (6-20%) dan sejumlah kecil lipid (1-7%).30
Saluran akar yang terinfeksi merupakan salah satu kondisi di mana nutrisi kurang memadai, ada toksin dari bakteri lain dan invasi medikamen endodontik. Kondisi yang keras ini dapat menyebabkan perubahan fisiologi yang spesifik sebagai respon terhadap lingkungan tersebut dan bertindak sebagai mekanisme pertahanan. Pada kondisi ini bakteri kehilangan kemampuan untuk tumbuh dan berkembang tapi tetap hidup dan bersifat patogen. Kondisi ini dinamakan dengan fase Viable but Nonculturable (VBNC). Biasanya hal ini hanya ditemukan pada bakteri gram negatif saja, namun belakangan diketahui bahwa E.faecalis sebagai bakteri gram positif juga memiliki kemampuan ini.23
Pada kondisi ini, E.faecalis dapat memanjang, berbentuk cocobacillary dengan permukaan yang tidak rata. Diantara enzim polimer yang terlibat dalam pembentukan peptidoglikan, beberapa diantaranya dapat berikatan dengan penisilin yang disebut dengan Penicillin Binding Protein (PBP). Pada fase VBNC, terjadi peningkatan produksi PBP yang bila diproduksi dalam jumlah banyak dapat menyebabkan resistensi terhadap penisilin.23
Efek antibakteri yang ditimbulkan minyak atsiri kayu manis diduga karena minyak atsiri kayu manis mengandung banyak senyawa aktif. Minyak atsiri kayu
manis memiliki kandungan berupa sinamaldehid dan eugenol yang bersifat antibakteri. Kematian bakteri Enterococcus faecalis mungkin karena sinnamaldehid dan eugenol yang diduga menghambat sintesis dinding sel menghambat metabolise energi pada sel bakteri, sehingga menyebabkan ketidakmampuan sel untuk melakukan metabolisme atau beradaptasi terhadap bahan antimikroba.
Mekanisme antibakteri sinamaldehid diduga adanya interaksi sinamaldehid dengan dinding sel menyebabkan gangguan yang cukup berarti pada pergerakan ion proton yang dimulai karena adanya kebocoran beberapa ion tanpa adanya kerusakan yang luas pada komponen sel. Selain itu, sinnamaldehid juga menghambat transport glukosa sehingga mengahambat proses glikolisis pada sel bakteri. Mekanisme antibakteri eugenol diperkirakan berkaitan dengan interaksi pada membran sel, dimana menyebabkan kehancuran pada membran sel. Eugenol berpotensi mengakibatkan perubahan permeabilitas dinding sel sampai pada batas tertentu dimana terjadi peningkatan permeabilitas membran, sehingga mengakibatkan kebocoran ion potasium. Kebocoran ion potasium merupakan indikator awal terjadinya kerusakan membran sel. Selain itu, eugenol berpotensi menghambat
peningkatan level ATP, sehingga mengganggu fungsi sel diikuti kematian sel.
Enterococcus faecalis merupakan bakteri yang bisa bertahan pada kondisi di bawah tekanan. Saluran akar yang terinfeksi merupakan suatu kondisi di mana nutrisi kurang memadai, adanya toksin dari bakteri lain dan invasi dari medikamen endodonti. Hal ini menyebabkan perubahan fisiologi yang spesifik sebagai suatu respon yang bertindak sebagai mekanisme pertahanan dari tekanan lingkungan. Pada fase ini lipoteichoic acid yang kuantitasnya menjadi 2 kali lipat sehingga dinding sel
lebih kuat dan lebih tahan terhadap kerusakan mekanis.30 Membran sel merupakan membran selektif terhadap zat-zat yang berada di sekitarnya, memiliki saluran khusus yang memudahkan difusi pasif senyawa hidrofilik dengan berat molekul rendah seperti ion dan molekul yang besar menembusnya secara relatif lambat.29 Selain itu, bakteri ini juga dapat bertahan dari detergen, logam berat dan bahkan etanol.4 Hal ini membuat bahan coba minyak atsiri kayu manis butuh konsentrasi tertentu untuk menghambat pertumbuhan dan membunuh bakteri Enterococcus faecalis.
Selain daya antibakteri, minyak atsiri kayu manis memiliki sifat-sifat yang mendukung untuk dikembangkan menjadi bahan medikamen saluran akar yang baik. Penelitian menunjukkan bahwa kandungan eugenol dan sinnamaldehide dalam minyak atsiri kayu manis memiliki efek analgetik dan antiinflamasi.15 Meskipun demikian, uji antibakteri minyak atsiri kayu manis yang dilakukan masih merupakan hasil penelitian in vitro. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian secara in vivo sebagai lanjutan penelitian ini sehingga bahan ini dapat digunakan secara klinis.
Dari hasil penelitian terbukti bahwa bahan coba minyak atsiri kayu manis memiliki efek antibakteri terhadap bakteri Enterococcus faecalis dilihat dari konsentrasi MBC bahan tersebut yaitu pada konsentrasi 0,5%. Bahkan hal ini juga dibuktikan dengan melihat perbandingan jumlah koloni yang terbentuk pada konsentrasi 0,25% jauh lebih kecil jika dibandingkan dengan jumlah koloni pada kontrol Mc Farland yang diinkubasi 24 jam yaitu 1.108 CFU/ml. Pada akhir penelitian, tidak dilakukan uji statistik terhadap hasil yang didapat, karena nilai yang didapat pada konsentrasi 8%, 4%, 2%, 1%, 0,5% dan 0,25%
BAB 7