BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2 Pembahasan
Sebelum analisis dilakukan terhadap sampel kapsul dilakukan terlebih dahulu optimasi kondisi SDS PAGE dengan menganalisis perbedaan pemisahan gelatin murni dari sapi dan babi yang telah dihidrolisis dengan enzim pepsin dengan variasi waktu 1 sampai 3 jam, variasi ini penting mengingat aktifitas pepsin tidaklah tetap (Wu et al., 2006). Dari optimasi diperoleh pemisahan protein pada SDS PAGE menunjukkan pemisahan yang baik setelah dihidrolisis selama 3 jam hasil ini berbeda dengan apa yang diperoleh Hermanto et al (2013) dimana pemisahan sudah dapat diidentifikasi setelah hidrolisis selama 1 jam. Perbedaan durasi ini terjadi akibat penyimpanan pepsin yang lama sehingga aktifitas enzimatik pepsin menurun.
31
Variasi durasi hidrolisis dilakukan untuk melihat hasil pemisahan terbaik dari hasil aktifitas pepsin terhadap protein gelatin. Karena kekuatan aktifitas enzim tidak tetap maka perlu dilakukan percobaan terhadap aktifitas enzim untuk melihat pemisahan yang dapat memunculkan pita spesifik dari pemisahan protein gelatin sapi atau babi dimana pita ini secara spesifik hanya dimiliki oleh sapi atau babi. Pada optimasi ini diperoleh 2 pita spesifik untuk gelatin babi yang timbul setelah hidrolisis selama 3 jam yaitu pita dengan bobot molekul 33 kDa dan 43 kDa.
Variasi terhadap konsentrasi akrilamid sebagai medium juga dilakukan pada proses optimasi dengan konsentrsi 10% dan 12% pada konsentrasi akrilamid 10% pemisahan protein sudah mulai terlihat hanya saja pemisahan protein pada pita dengan bobot molekul lebih besar dari 50 kDa pita-pita yang diperoleh masih sangat rapat sehingga sangat sulit untuk melihat perbedaannya maka dilakukan percobaan kembali dengan gel 12% dengan harapan didapati pola pemisahan yang lebih baik. Pada akrilamid dengan konsentrasi 12% pemisahan pita dengan bobot molekul 50 kDa sedikit lebih renggang seperti yang terlihat pada gambar 4.1 sehingga dapat lebih mudah untuk dianalisis.
Pada gambar 4.1 dapat dilihat pada kolom 2 dan 3 protein gelatin yang tidak dihidrolisis memilik bobot molekul yang sangat besar (diatas 55 kDa untuk sapi dan diatas 70 kDa untuk gelatin babi ). Perbedaan pada pemisahan protein sebelum dihidrolisis ini terjadi karena gelatin yang dianalissis bukanlah merupakan gelatin yang diperoleh dengan cara ekstraksi yang sama atau dengan tipe yang sama. Gelatin sapi merupakan gelatin tipe B dimana pada proses ekstraksi dari kolagen asalnya menggunakan hidrolisis basa dimana bobot molekul rata-rata gelatin ini lebih besar dibandingkan bobot molekul rata-rata gelatin yang dipeloleh dari proses hidrolisis asam (tipe A) sedangkan babi merupakan gelatin tipe A (Gorgieva dan Kokol, 2011), perbedaan bobot molekul rata-rata dari kedua tipe gelatin inilah yang terlihat pada SDS PAGE.
32
Walaupun secara kasat mata dapat dilihat perbedaannya namun hasil pemisahan protein gelatin tanpa dihidrolisis tidak dapat menunjukkan pola pemisahan yang spesifik sehingga masih sangat lemah daya identifikasinya, pada kolom 4 sampai 9 gambar 4.1 merupakan protein gelatin yang telah dihidrolisis oleh enzim pepsin selama selang waktu tertentu, dapat dilihat bahwa setelah proses hidrolisis hasil SDS PAGE menunjukkan pola pemisahan yang lebih spesifik khususnya pada protein gelatin babi, pada kolom 5,7, dan 9 terlihat pemisahan protein gelatin babi ada 9 pita pada pemisahan yaitu 94,6 kDa; 74 kDa; 67,6 kDa; 51,6 kDa; 43 kDa; 33 kDa; 23,7 kDa; 17.3 kDa, 12.8 kDa sedangkan pada kolom 4, 6, dan 8 merupakan protein sapi, walaupun pemisahannya belum sebaik protein babi akan tetapi sudah mulai dapat diidentifikasi seperti pita 84 kDa, 70 kDa, 58 kD, 47 kDa, 18.5 kDa, dan 15 kDa.
Tidak seperti protein induknya yang hanya dapat dihidrolisis dengan enzim kolagenase, gelatin dapat di hidrolisis dengan enzim-enzim proteolitik salah satunya adalah pepsin (Gorgieva dan Kokol, 2011). Namun hasil hidrolisis pepsin sendiri terhadap gelatin efektifitasnya tidaklah optimal pada seluruh tipe gelatin yang ada. Hidrolisis dengan pepsin membutuhkan kondisi asam (Al Janabi et al., 1972). Menurut palashoff (2008) kerja pepsin akan sangat baik jika protein yang dihidrolisis dalam keadaan terdenaturasi. Sedangkan pada penelitian ini hidrolisis dilakukan pada pH 4,5 pada kondisi ini gelatin babi (tipe A) tepat pada titik isoelektriknya sehingga sangat memungkinkan gelatin tersebut dalam keadaan terdenaturasi namun tidak dengan gelatin sapi (tipe B). sehingga pada hasil analisis SDS PAGE pola pemisahan gelatin sapi setelah dihidrolisis tidak sebaik gelatin babi.
Selanjudnya perbedaan besar molekul kedua gelatin ini juga mempengaruhi hasil kerja pepsin terhadap gelatin. Gelatin sapi (tipe B) memiliki bobot molekur rata-rata lebih besar dari gelatin babi (tipe A) (Gorgieva dan Kokol, 2011) sehingga sebaran hasil hidrolisis gelatin babi cenderung tersebar hingga pita dengan BM < 50 kDa sehingga dapat
33
terlihat jelas polanya, sebaliknya gelatin sapi yang memiliki molekul besar walaupun setelah proses hidrolisis pita-pita pemisahan yang muncul dengan BM < 50 kDa masih sangat buram dan hanya 4 pita. Perbedaan pola pemisahan inilah yang terlihat pada hasil analisis dengan SDS PAGE.
Perbedaan profil pemisahan protein gelatin pada SDS PAGE setelah dihidrolisis dapat terjadi karena urutan asam amino penyusun protein tidak sama tergantung dari spesies asalnya (Gorgieva dan Kokol, 2011), sedangkan pepsin sebagai enzim yang di gunakan untuk memotong protein menjadi fragmen-fragmen rantai polipetida memiliki situs-situs spesifik pemotongan. Pepsin memotong rantai polipeptida dengan memutus ikatan peptida yang ada pada sisi NH2 bebas dari asam-asam amino aromatik (fenilalanin, tirosin, triptofan), hidrofobik (leusin, isoleusin, metionin), atau dikarboksilat (glutamat dan aspartat) (Al Janabi
et al., 1972). Hasil studi terhadap literature yang ada terdapat sangat banyak pemotongan rantai polipeptida setelah asam amino hodropobik seperti leusin dan fenilalanin akan tetapi pemotongan sangat jarang terjadi setelah prolin dan histidin.
Gambar 4.5 Pemotongan pepsin.keterangan : (A) susunan asam amino rantai alfa 1 kolagen babi, (B) susunan asam amino rantai alfa 1 kolagen sapi.
34
Gambar 4.5 menunjukkan bagaimana terjadinya pemotongan terhadap asam amino dengan panjang yang tidak sama. Hasil studi
literature menunjukkan kemungkinan terjadinya pemotongan rantai polipeptida antara leusin dengan glutamin pada pH 4 adalah 100% (palashoff, 2008). Jika situs ini (leusin-glutamin) kita tempatkan ada rantai polopeptida alpha 1 dari kolagen sapi dan babi sebagai prekusor gelatin maka akan terlihat bahwa jumlah asam amino hasil pemotongan tidak sama jumlahnya sehingga panjang rantai polipeptida yang dihasilkan akan berbeda antara protein gelatin sapi dan babi, hal ini secara langsung mempengaruhi bobot molekul fragmen polipeptida yang dihasilkan seperti yang terlihat di gambar 4.6.
Gambar 4.6 Analisis Pita pemisahan gelatin sapi dan babi. Keterangan : 0 protein marker, 1 pepsin, 2 gelatin sapi sebelum dihidrolisis, 3 gelatin babi sebelum di hidrolisis, 4 gelatin sapi setelah dihidrolisis selama 1 jam, 5 gelatin babi setelah dihidrolisis 1 jam, 6 gelatin sapi setelah dihidrolisis selama 2 jam, 7 gelatin babi setelah dihidrolisis 2 jam, 8 gelatin sapi setelah dihidrolisis selama 3 jam, 9 gelatin babi setelah dihidrolisis 3 jam.
Selanjutnya analisis terhadap gelatin dari kapsul sampel dilakukan bersamaan dengan kapsul simulasi dari gelatin murni dan gelatin murni tanpa diproses sebagai kapsul. Kondisi analisis disesuaikan dengan hasil optimasi dan dihidrolisis dengan pepsin selama 3 jam. Pada tahap ini penentuan pita spesifik dari gelatin kapsul simulasi penting untuk
35
dilakukan karena pita spesifik ini akan digunakan sebagai acuan pembanding gelatin kapsul sampel untuk penentuan sumber gelatin sampel tersebut. Pita spesifik ditentukan dengan melihat perbedaan pola pemisahan dari kedua gelatin kemudian dilihat pita pemisahan yang timbul di salah satu gelatin namun pita tersebut tidak timbul pada pemisahan gelatin jenis lainnya. Pita-pita pemisahan yang muncul di kedua jenis gelatin bukanlah pita spesifik. Pada penelitian ini diperoleh keberadaan pita yang hanya timbul pada gelatin sapi pada bobot molekul 11,4 kDa; 34 kDa; dan 47 kDa (gambar 4.6 kolom 3) dan pita yang hanya timbul pada gelatin babi pada bobot molekul 28 kDa; 24,7 kDa; dan 60 kDa (gambar .4.6 kolom 4) sedangkan pita-pita hasil pemisahan yang lain didapati pada kedua jenis gelatin. Maka pita spesifik untuk gelatin sapi adalah 11,4 kDa, 34 kDa, 47 kDa dan pita spesifik untuk gelatin babi adalah pita 28 kDa, 24,7 kDa dan 60 kDa.
Gambar 4.7 Analisis Pita Pemisahan Protein Gelatin kapsul. Keterangan : 0 protein marker,1 gelatin sapi murni, 2 gelatin babi murni, 3 kapsul simulasi gelatin sapi , 4 kapsul simulasi gelatin babi, 5 kapsul simulasi campuran gelatin sapi dan babi, 6 kapsul sampel A, 7 kapsul sampel B, 8 kapsul sampel C. Pada kolom 5 gambar 4.7 adalah kapsul simulasi yang dibuat dari campuran gelatin sapi dan gelatin babi, kapsul ini dibuat dan disertakan dalam analisa untuk melihat bagaimana pemisahan yang terjadi jika sampel yang dianalisis merupakan gelatin campuran atau gelatin yang
36
terkontaminasi oleh gelatin jenis lain. Pada penelitian ini diperoleh pemisahan gelatin campuran ini tidak benar-benar identik dengan salah satu pemisahan dari gelatin sapi maupun gelatin babi. Pada pemisahan gelatin campuran ini pita-pita yang menjadi pita spesifik gelatin sapi sama sekali tidak muncul akan tetapi ada 2 pita dari gelatin babi yang muncul pada pemisahannya yaitu pita dengan bobot molekul 14 kDa dan 10 kDa hal ini terjadi diasumsikan karena dalam proses hidrolisis yang terhidrolisis terlebih dahulu oleh pepsin pada campuran gelatin tersebut adalah gelatin babi seperti yang dijelaskan pada paragraf diatas. Sehingga diasumsikan pada metode ini pemisahan dari gelatin kapsul yang merupakan campuran gelatin sapi dan babi tidak akan memunculkan pita spesifik gelatin sapi tetapi akan memunculkan pita gelatin babi (14 kDa dan 10 kDa) sebagai penanda adanya kontaminasi gelatin babi pada gelatin campuran tersebut.
Selanjutnya dilakukan analisis terhadap pita-pita pemisahan kapsul sampel dengan membandingkan keberadaan pita-pita spesifik dari pemisahan gelatin sapi ataupun babi dengan pemisahan protein gelatin kapsul sampel. Dari hasil pembandingan didapati bahwa pada pemisahan protein gelatin dari kapsul sampel 1, 2, dan 3 terdapat pita yang jelas pada Bm 11,4 kDa; 34 kDa; dan 47 kDa yang merupakan pita spesifik pada pemisahan protein gelatin sapi dan tidak didapati keberadaan pita spesifik pemisahan gelatin babi sehingga dapat disimpulkan bahwa kapsul sampel merupakan kapsul yang dibuat dari gelatin yang berasal dari sapi.
Dari hasil penelitian ini dapat dilihat bahwa SDS PAGE dapat digunakan sebagai metode untuk membedakan gelatin sapi dan babi melalui pola pemisahan proteinnya. SDS PAGE selanjutnya juga mampu untuk membedakan gelatin yang telah diolah menjadi produk lain seperti kapsul. Hanya saja SDS PAGE hanya dapat melakukan pembedaan secara kualitatif.
