Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi senyawa aktif antimikroba dan karakterisasi isolat dari ekstrak Melochia umbellata (Houtt) Stapf. var.
deglabrata. Aktivitas terhadap mikroba uji digunakan sebagai bioassay guided isolation untuk memperoleh senyawa antimikroba. Setiap tahap pemisahan senyawa dimonitor menggunakan KLT dan aktivitas antimikrobanya diamati terhadap beberapa mikroba uji hingga diperoleh isolat aktif. Isolasi senyawa aktif dilakukan menggunakan kromatografi flash sepacore dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis preparatif.
Karakterisasi senyawa antimikroba ditentukan berdasarkan sifat fisikokimia dan data spektroskopi isolat aktif.
Daun M. umbellata var. deglabrata segar terlebih dahulu diangin-anginkan hingga kadar air berkurang dengan tujuan menghentikan proses enzimatis yang dapat merusak zat aktif. Selain itu untuk mencegah pertumbuhan mikroorganisme pada simplisia. Sampel yang telah kering selanjutnya diekstraksi dengan metode maserasi yang merupakan metode dingin (proses ekstraksi tanpa pemanasan), dimana metode ini cocok untuk bahan yang tidak keras seperti daun memiliki tekstur yang lunak selain itu tidak perlu pemanasan yang diperkirakan dapat merusak senyawa kimia yang terdapat dalam sampel. Daun yang telah kering kemudian dihaluskan agar luas permukaan simplisia terhadap pelarut pada proses maserasi menjadi lebih besar, semua sampel dapat kontak
dengan larutan penyari sehingga penarikan metabolit-metabolit dapat lebih maksimal.
Sampel daun M. umbellata var. deglabrata awalnya diekstraksi dengan n-heksan kemudian ampasnya diekstraksi kembali dengan menggunakan pelarut metanol. Penggunaan dua pelarut dengan kepolaran yang berbeda dilakukan agar komponen kimia yang diperoleh terpisah sesuai dengan tingkat kepolarannya. Senyawa kimia yang memiliki kepolaran rendah diharapkan akan terekstraksi dengan pelarut n-heksan sedangkan komponen kimia dengan kepolaran yang tinggi akan terekstraksi dengan metanol. Ekstrak metanol kemudian dipartisi cair padat dengan menggunakan pelarut etil asetat. Digunakan metode partisi padat cair karena jumlah ekstrak yang diperoleh banyak dan menghindari reaksi hidrolisis sehingga komponen kimia tidak rusak oleh adanya air.
Pemisahan ini dimaksudkan untuk memudahkan dalam penentuan senyawa aktif. Senyawa kimia dengan tingkat kepolaran rendah akan larut dalam etil asetat (ekstrak larut etil asetat) sedangkan yang memiliki tingkat kepolaran yang tinggi akan tidak larut dalam etil asetat (ekstrak tidak larut etil asetat).
Ekstrak n-heksan, etil asetat dan tidak larut etil asetat selanjutnya dilakukan pengujian skrining aktivitas antimikroba dengan metode dilusi padat dengan konsentrasi 1000 bpj. Menurut Hoffman dkk (1993) ekstrak yang menunjukkan hambatan pertumbuhan mikroba uji pada kadar tersebut potensial untuk diteliti lebih lanjut daya antimikrobanya. Metode
dilusi padat memiliki keunggulan yaitu tidak memperhitungkan kemampuan senyawa atau ekstrak untuk berdifusi ke dalam medium dan tidak dipengaruhi oleh tebal tipisnya medium. Selain itu metode ini relatif lebih praktis, mudah, dan menghemat medium yang digunakan. Aktivitas antimikroba pada pengujian skrining ditandai dengan terbentuknya zona hambatan yang bersifat radikal atau iradikal. Zona radikal tampak berupa daerah yang jernih tanpa terlihat pertumbuhan mikroba uji, sedangkan zona iradikal masih ada pertumbuhan mikroba tetapi dihambat atau pertumbuhan itu lebih kecil dibanding pertumbuhan yang tidak dihambat, oleh karena itu zona iradikal berupa zona yang keruh tetapi masih lebih jernih dibandingkan pertumbuhan disekitarnya (Ibrahim, 2011).
Mikroba uji yang digunakan untuk skrining aktivitas antimikroba ekstrak daun M. umbellata var. deglabrata adalah Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Salmonella typhi NCTC 786, Streptococcus mutans, Vibrio cholera, Shigella dysentriae, dan Candida albicans ATCC 10231.
Pemilihan mikroba uji tersebut karena sifat-sifatnya yang patogenik.
Bacillus subtilis merupakan bakteri Gram positif dan menyebabkan infeksi kulit (luka, bisul, borok). Escherichia coli dan Salmonella thyposa merupakan bakteri Gram negatif, sebagai penyebab utama diare kronik, tifoid, dan infeksi saluran kemih. Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri Gram negatif, menyebabkan infeksi pada mata dan enterik akut.
Vibrio cholera merupakan bakteri Gram negatif, yang merupakan penyebab kolera. Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif, penyebab infeksi pada kulit (osteomielitis) (Djide dan Sartini 2008).
Streptococcus mutans merupakan bakteri Gram positif yang dapat menyebabkan karies gigi dan infeksi pada mulut. Shigella dysentri merupakan bakteri Gram negatif yang dapat menyebabkan penyakit dysentri basiler dengan gejala demam akut, sakit perut bagian bawah, diare, feses cair, berlendir dan bercampur darah. Staphylococcus epidermis merupakan bakteri Gram positif yang dapat menyebabkan penyakit septicemia dan endokarditis (Entjang, 2003). Candida albicans merupakan jamur yang bersifat patogenik, biasanya terdapat pada mukosa mulut, saluran pencernaan, kulit dan kelamin wanita, penyebab candidiasis atau vaginitis (Strohl et al., 2001).
Hasil pengujian skrining menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat M. umbellata var. deglabrata memiliki aktivitas penghambatan terhadap 5 mikroba uji yaitu Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Vibrio cholera, dan jamur Candida albicans ATCC 1023, sedangkan ekstrak n-heksan menghambat Escherichia coli ATCC 25922, Shigella dysentriae, Vibrio cholera, dan jamur Candida albicans ATCC 1023 dan ekstrak tidak larut etil asetat hanya menghambat Escherichia coli ATCC 25922 dan Candida albicans ATCC 1023 (gambar 1). Berdasarkan hal tersebut diduga
bahwa senyawa yang aktif sebagai antimikroba dalam ekstrak M. umbellata var. deglabrata adalah senyawa yang semipolar.
Ekstrak larut etil asetat yang memiliki aktivitas antibakteri yang tinggi selanjutnya difraksinasi dengan metode sepacore flash cromatography.
Teknik kromatografi kolom ini merupakan modifikasi dengan memanfaatkan keunggulan-keunggulan flash chromatography column yaitu pemisahan yang cepat dengan tekanan nitrogen. Sepacore memberikan kemudahan pemisahan senyawa kompleks pada kolom MPLC dengan pemantauan peak yang muncul secara visual pada detektor (Buchi, 2011).
Hasil fraksinasi ekstrak larut etil asetat dengan menggunakan fase gerak n-heksan dan etil asetat dengan kepolaran yang semakin meningkat adalah 6 fraksi gabungan. Hasil pengujian aktivitas antimikroba menunjukkan bahwa fraksi D merupakan fraksi teraktif sebagai antimikroba terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (gambar 3).
Sehingga fraksi ini yang difraksinasi kembali dengan sepacore flash cromatography.
Hasil fraksinasi lebih lanjut terhadap fraksi D dengan metode sepacore flash cromatography menggunakan fase gerak n-heksan dan etil asetat dengan kepolaran yang semakin meningkat diperoleh 5 fraksi gabungan.
Pada tahap ini tidak dilakukan pengujian pada fraksi D1 karena jumlahnya yang sangat sedikit. Hasil pengujian aktivitas antimikroba menunjukkan
bahwa fraksi D3 merupakan fraksi teraktif sebagai antimikroba terhadap Escherichia coli ATCC 25922 dengan hambatan 11,2 mm, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dengan hambatan 8,8 mm, dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 dengan hambatan 7,2 mm (gambar 5).
Fraksi D3 diuji aktivitas antibakteri dengan metode KLT-bioautografi, pengujian ini dilakukan untuk memudahkan dalam penentuan senyawa yang akan diisolasi selanjutnya. Hasil pengujian KLT-bioautografi menunjukkan bahwa fraksi FD3d memiliki satu spot senyawa dengan aktivitas terbesar terhadap bakteri yang diujikan, yaitu spot dengan Rf 0,45 menunjukkan zona hambatan (gambar 6).
Fraksi D3 selanjutnya di KLT-Preparatif dengan perbandingan eluen n-heksan−etil asetat (1:1) dengan fase diam silika gel 60 PF 254 dan menghasilkan 5 pita (FD3a, FD3b, FD3c, FD3d, dan FD3e) yang tampak kemudian dikeruk dengan spatula dan dikumpulkan (gambar 21). Hasil pengujian KLT-dua dimensi menunjukkan satu noda tunggal sehingga isolat senyawa antimikroba yang didapatkan adalah komponen kimia yang tunggal (gambar 7).
Uji potensi isolat antimikroba dilakukan dengan metode dilusi cair untuk mengetahui harga KHM pada konsentrasi 1000 bpj, 500 bpj, 250 bpj, 125 bpj, dan 62,5 bpj yang kemudian diuji lagi dengan metode difusi agar dengan menggunakan cakram kertas (paper disc). Selama masa inkubasi, isolat antimikroba akan berdifusi ke dalam medium yang sebelumnya telah diinokulasikan bakteri yang sensitif dan membentuk
daerah hambatan. Bakteri yang digunakan adalah Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923. Dari hasil pengujian ini, dapat diketahui bahwa Nilai KHM isolat terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922 250 bpj, sedangkan terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 adalah 1000 bpj (tabel 8 dan gambar 8). Hasil pengujian ini yang menjadi landasan untuk pengujian potensi antimikroba.
Hasil pengujian dengan metode difusi agar menggunakan cakram kertas yaitu bakteri Escherichia coli ATCC 25922 memberikan penghambatan hingga konsentrasi 125 bpj dengan daerah hambatan 7,41 mm, bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 memberikan penghambatan hingga konsentrasi 250 bpj dengan daerah hambatan 7,30 mm dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 memberikan penghambatan hingga konsentrasi 1000 bpj dengan daerah hambatan 7,14 mm (tabel 9 dan gambar 9). Hasil penelitian ini menunjukkan aktivitas yang lebih rendah dibandingkan dengan penelitian Jamil et.al (2012), isolat AM3b Quercus dilatata L. yang merupakan senyawa alkaloid memiliki diameter penghambatan 9,3 mm dengan nilai KHM sebesar 100 bpj pada Staphylococcus aureus dan daerah penghambatan sebesar 9,0 mm dengan nilai KHM sebesar 90 bpj pada Escherichia coli. Ibtissam et.al (2009) menentukan kriteria kekuatan daya antibakteri sebagai berikut:
daerah hambatan 20 mm atau lebih termasuk aktivitas sangat tinggi
(sangat aktif), daerah hambatan 16-19 mm termasuk aktivitas tinggi (aktif), daerah hambatan 10-15 mm termasuk kategori sedang, dan daerah kurang 10 mm termasuk kategori rendah. Berdasarkan hal tersebut isolat FD3d pada konsentrasi pengujian memiliki daya antibakteri yang rendah.
Hasil dari pengujian aktivitas isolat aktif dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu : konsentrasi sampel uji, konsentrasi bakteri uji, dan viskositas medium. Bakteri Gram negatif memiliki susunan dinding sel yang lebih rumit yaitu lapisan luar yang tersusun atas lipopolisakarida dan protein, dan lapisan dalam tersusun atas lapisan peptidoglikan. Sedangkan dinding sel bakteri Gram positif tersusun atas satu lapisan saja yaitu peptidoglikan (Djide dan Sartini, 2008). Lipopolisakarida yang berfungsi sebagai penghalang masuknya senyawa-senyawa yang tidak diperlukan sel, sehingga bakteri Gram negatif lebih tahan terhadap penambahan antibiotik. pada kontrol negatif kloramfenikol menunjukkan potensi lebih besar pada bakteri Gram positif 16,11 mm dan Gram negatif 15,62 mm.
Kloramfenikol merupakan antibiotik berspektrum luas yang aktif dalam menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Pelczar dan Chan, 1988).
Hasil identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis, senyawa FD3d menunjukkan serapan pada panjang gelombang 201,6 nm. Serapan dengan panjang gelombang maksimum 201,6 nm menunjukkan bahwa senyawa isolat FD3d mengalami transisi elektronik ππ* (tingkat tereksitasi polar), yaitu transisi elektron-elektron berikatan rangkap yang
diduga mengalami subtitusi oleh gugus alkil sehingga akan menggeser ke arah pergeseran hipsokromik (pergeseran biru) (Sastrohamidjojo, 2001).
Identifikasi dengan spektrofotometer FTIR menunjukkan adanya pita serapan pada gelombang 3284 cm-1 yang merupakan gugus NH. Hal ini didukung oleh pita pada daerah 1320 cm-1 yang merupakan serapan amin alifatik. Pita serapan pada gelombang 2920 cm-1 dan 2850 cm-1 menunjukkan CH alifatik. Adanya gugus C=C alkena ditunjukkan oleh adanya serapan dengan intensitas kecil di daerah 1645 cm-1 dan pita tunggal pada 847 cm-1 . Dengan demikian isolat FD3d mengandung gugus NH alifatik, CH alifatik, dan C=C alkena.
Hasil karakterisasi dengan menggunakan reagen kimia dragendorf pada lempeng kromatogram menunjukkan jingga latar kuning. Hal ini menunjukkan isolat FD3d diduga positif terhadap reagen semprot golongan senyawa alkaloid (gambar 12). Isolat FD3d memiliki karakteristik yang berbeda dengan isolat MU-1, MU-2, dan MU-3 hasil penelitian Rahim (2010). Isolat FD3d tidak nampak pada UV 254 nm dan 366 nm sedangkan isolat MU-1 nampak pada UV 254 nm dan 366 nm, isolat MU-2 dan MU-3 hanya nampak pada UV 254 nm (gambar 23).
60