Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata
CHARACTERIZATION OF ANTIMICROBIAL COMPOUND OF Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata EXTRACT
MUHAMMAD RUSYDI P2500211003
PROGRAM STUDI FARMASI PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR 2013
Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata
Disusun dan diajukan oleh
MUHAMMAD RUSYDI Nomor Pokok P2500211003
telah dipertahankan di depan Panitia Ujian Tesis pada tanggal 19 Agustus 2013
dan dinyatakan telah memenuhi syarat
Menyetujui Komisi Penasihat,
Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA Dr. Mufidah, S.Si, M.Si.
Ketua Anggota
Ketua Program Studi Farmasi Direktur Program Pascasarjana Universitas Hasanuddin
Prof. Dr. H. M. Natsir Djide, MS Prof. Dr. Ir. Mursalim
iv
Alhamdulillah rabbil alamin, tiada kata yang paling pantas diucapkan oleh penyusun selain rasa syukur dan terima kasih kepada Allah SWT yang telah memberi banyak nikmat, kesehatan, dan petunjuk serta kesabaran sehingga penyusun dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Karakterisasi Senyawa Antimikroba Dari Ekstrak Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata” sebagai salah satu syarat
menyelesaikan Pendidikan Magister Farmasi pada Program Pascasarjana Universitas Hasanuddin. Shalawat dan salam serta shalawat kepada Nabi junjungan kita Muhammad SAW, para sahabat, serta keluarganya.
Dalam menyelesaikan tesis ini, banyak pihak yang telah memberikan arahan dan bimbingan dari berbagai pihak, baik secara moril maupun materil. Oleh karena itu patutlah kiranya jika penulis mengucapkan terimakasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA selaku ketua komisi penasehat dan Dr. Mufidah S.Si, M.Si. selaku sekretaris komisi penasehat yang banyak memberikan bantuan dan pengarahan serta meluangkan waktu, tenaga dan pikirannya dalam membimbing penulis sejak awal perencanaan penelitian sampai selesainya penyusunan tesis ini.
.
v Universitas Hasanuddin.
2. Ibu Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin Makassar atas segala bantuan, arahan dan bimbingannya.
3. Bapak Prof. Dr. H. M. Natsir Djide, M.S., Apt. Ketua Program Studi Farmasi Program Pascasarjana Universitas Hasanuddin Makassar.
4. Bapak Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Bapak Subehan, S.Si, M.Pharm.Sc, Ph.D., dan Ibu Dr. Herlina Rante, S.Si, M.Si. selaku dosen penguji atas segala bantuan dan arahannya.
5. Bapak Abdul Rahim, S.Si, M.Si. atas arahan dan keahlian yang dibagi.
6. Bapak/ Ibu dosen Program Studi Farmasi Program Pascasarjana Universitas Hasanuddin Makassar.
7. Seluruh staf Program Studi Farmasi Program Pascasarjana Universitas Hasanuddin Makassar.
8. Teman-teman Angkatan 2011 Program Studi Farmasi Pascasarjana Universitas Hasanuddin Makassar: Nielma Auliah, Muh. Ikhlas, Besse Yuliana, Faisal Mustamin, M. Arifuddin, Kak M. Alfian, Muammar Fawwaz, Kak Mukhriani, Kak Wahyuni, Kak Yustina Siama dan Kak Safaruddin atas segala bantuan dan semangatnya selama menjalani pendidikan.
vi
semangat dan senantiasa menyebut nama penulis disetiap doa-doa beliau dan tak pernah lelah dengan doa dan restunya. Terimakasih kepada adikku tercinta Muhammad Rais atas segala dukungan cinta, pertolongan, dan motivasinya. Terimakasih untuk keluarga besar yang selalu memberikan dukungan moril dan materil bagi penyusun selama menempuh pendidikan. Kak Ismail, Armisman, dan Karim atas ilmu yang telah dibagi selama penelitian di laboratorium. Teman-teman di Surandar atas semangat dan kebersamaannya selama ini, kebersamaan selama ini takkan pernah terlupakan dan akan menjadi kenangan indah di masa depan.
Penulis menyadari bahwa tesis ini tentunya masih jauh dari kesempurnaan karena kesempurnaan hanyalah milik Allah SWT. Semoga Allah SWT senantiasa melimpahkan berkat dan rahmat-Nya. Akhir kata penulis berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan, khususnya dalam bidang mikrobiologi dan bahan alam, sekarang maupun di masa akan datang.
Makassar, Agustus 2013
Penulis
vii Wahyudin dan Mufidah).
Penelitian mengenai karakterisasi senyawa antimikroba dari ekstrak Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata telah dilakukan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi senyawa antimikroba dari ekstrak Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata.
Penelitian ini berdasarkan bioassay guided isolation dan aktivitas antimikroba diamati pada setiap tahap pengerjaan terhadap beberapa mikroba uji. Karakterisasi senyawa aktif antimikroba berdasarkan data spektroskopi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak M. umbellata var. deglabrata memiliki aktivitas antimikroba dan ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antimikroba paling tinggi dibandingkan dengan ekstrak lainnya (ekstrak n-heksan dan tidak larut etil asetat). Ekstrak etil asetat difraksinasi dengan Sepacore® medium pressure liquid chromatography dan senyawa aktif antimikroba dimurnikan dengan kromatografi lapis tipis preparatif dan diperoleh satu isolat senyawa aktif antimikroba yaitu isolat FD3d. Nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) isolat FD3d terhadap Escherichia coli ATCC 25922 adalah 250 bpj dan daerah hambatan 7,41 mm pada konsentrasi 125 bpj. Isolat FD3d diduga senyawa golongan alkaloid berdasarkan karakterisasi dengan spektroskopi UV-Vis yang menunjukkan serapan pada 201,6 nm dan spektroskopi inframerah menunjukkan adanya gugus NH alifatik, CH alifatik, dan C=C alkena serta penampakan noda jingga berlatar kuning dengan reagen Dragendorf.
Kata kunci : karakterisasi, senyawa antimikroba, Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata
viii Elly Wahyudin dan Mufidah)
The research about characterization of antimicrobial compound of Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata extract have been conducted. The research was aimed to isolate and characterize the antimicrobial compound of Melochia umbellata (Houtt) Stapf var.
deglabrata extract. The research was based on bioassay guided isolation and each of the stages was monitored by antimicrobial activities against several microbial test. Characterization of antimicrobial activity compound based on the spectroscopic data. The result of research showed that the M. umbellata var. deglabrata extract have antimicrobial activity and the ethyl acetate extract have the highest antimicrobial activity compare to the other extract (n-hexane and undissolved in ethyl acetate extract). The ethyl acetate extract was fractionated with Sepacore® medium pressure liquid chromatography method and the antimicrobial active compound was purified with preparative-thin layer chromatography and resulted one active antimicrobial isolate, namely isolate FD3d. The MIC (Minimum Inhibitory Concentration) value of FD3d isolate against Escherichia coli ATCC 25922 was 250 ppm and inhibition zone was 7.41 mm at 125 ppm concentration. Isolate FD3d was predicted as alkaloid compound based on characterization with UV-Vis spetroscopy which indicate absorbance at 201.6 nm and infrared spectroscopy which indicate the presence of NH aliphatic, CH aliphatic, and C=C alkene and visualization with Dragendorf reagent appear as orange spot on a yellow background.
Key words : characterization, antimicrobial compound, Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata
ix
HALAMAN JUDUL i
HALAMAN PENGESAHAN ii
PERNYATAAN KEASLIAN TESIS iii
PRAKATA iv
ABSTRAK vii
ABSTRACT viii
DAFTAR ISI ix
DAFTAR TABEL xii
DAFTAR GAMBAR xiii
I PENDAHULUAN 1
A. Latar Belakang Masalah 1
B. Rumusan Masalah 3
C. Tujuan Penelitian 3
D. Manfaat Penelitian 4
II TINJAUAN PUSTAKA 5
A. Uraian Tumbuhan . 5
1. Klasifikasi Tumbuhan 5
2. Nama Daerah 5
3. Morfologi Tumbuhan 5
4. Kandungan Kimia 6
5. Kegunaan 6
x
C. Antimikroba 13
1. Pengertian Antimikroba . 13
2. Sifat Antimikroba . 14 3. Prinsip Kerja Antimikroba 14
4. Mekanisme Kerja Antimikroba 15
D. Metode Uji Antimikroba 17
E. Uraian Mikroba Uji 20
1. Klasifikasi 20-27
2. Morfologi . 20-27
F. Kerangka Teori 27
G. Kerangka Konsep 28
H. Hipotesis 28
III Metode Penelitian 29
A. Alat dan Bahan 29
1. Alat 29
2. Bahan 29
B. Cara Kerja 30
1. Pengambilan dan Pengolahan Sampel 30
2. Pembuatan Ekstrak 30
3. Fraksinasi dengan Sepacore Flash Chromatography
Column 32
xi
IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 38
A. Hasil Penelitian 38
1. Hasil Ekstraksi Sampel 38
2. Hasil Pengujian Skrining Antimikroba 38
3. Hasil Sepacore dan Pengujian Antimikroba Ekstrak Larut Etil Asetat 40
4. Hasil Fraksinasi dan Pengujian Antimikroba Fraksi D 42
5. Pengujian KLT Bioautografi Fraksi D3 44
6. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 44
7. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Dua Dimensi 45
8. Hasil Pengujian Potensi Antimikroba 46
9. Hasil Karakterisasi Isolat Aktif 49
B. Pembahasan 51
V PENUTUP 60
A. Kesimpulan 60
B. Saran 60
DAFTAR PUSTAKA 61
LAMPIRAN 64
xii
1. Hasil ekstraksi dan partisi cair padat ekstrak daun
M.umbellata (Houtt) Stapf. var. deglabrata 38 2. Hasil skrining antimikroba ekstrak M.umbellata var. deglabrata 39 3. Hasil kromatografi kolom sepacore ekstrak etil asetat 40 4. Hasil pengujian antimikroba ekstrak etil asetat
M.umbellata. var. deglabrata. 41 5. Hasil kromatografi kolom sepacore fraksi D etil asetat 42 6. Hasil pengujian antimikroba fraksi D ekstrak etil asetat
M.umbellata var. deglabrata 43
7. Hasil KLT-Preparatif fraksi FD3 45
8. Hasil pengujian Kadar Hambat Minimum (KHM) 46 9. Hasil pengujian potensi antimikroba isolat FD3d 48
10. Data spektrum UV isolat FD3d 49
11. Data spektrum IR isolat FD3d 49
xiii
1. Hasil pengujian skrining antimikroba ekstrak
larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata 39 2. Profil kromatogram ekstrak larut etil asetat Melochia
umbellata var. deglabrata 40
3. Hasil pengujian antimikroba hasil sepacore ekstrak
larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata 41
4. Profil kromatogram fraksi D ekstrak larut etil asetat
M. umbellata var. deglabrata 42
5. Hasil pengujian antimikroba hasil sepacore fraksi D ekstrak larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata 43
6. Hasil pengujian KLT-Bioautografi fraksi D ekstrak
larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata 44 7. Foto hasil KLT Dua Dimensi isolat D3d. Fase gerak
n-heksan−etil Asetat 2:1 dan fase gerak
kloroform−metanol 10:1 45
8. Foto hasil pengujian Kadar Hambat Minimum isolat FD3d
M. umbellata var. Deglabrata 47
9. Foto hasil pengujian potensi isolat FD3d
M. umbellata var. deglabrata 48
10. Data spektrum UV isolat FD3d M. umbellata var. deglabrata 49 11. Data spektrum IR isolat FD3d M. umbellata var. deglabrata 50 12. Foto identifikasi komponen kimia isolat D3d
M. umbellata var. deglabrata dengan pereaksi Dragendorf. Fase diam silika gel 60 F254; fase gerak n-heksan :etil asetat (2:1) 50 13. Hasil pengujian skrining antimikroba ekstrak n-heksan
daun M. umbellata var. deglabrata 65
xiv
16. Hasil profil kolom sepacore ekstrak larut etil asetat. Fase diam Silika Gel 60 PF 254; fase gerak n-heksan−
etil asetat (2:1) 68
17. Foto pengujian antimikroba hasil sepacore ekstrak
larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata 69 18. Foto pengujian antimikroba hasil sepacore ekstrak
larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata 70 19. Foto hasil profil kolom Sepacore Fraksi D ekstrak
larut etil asetat. Fase diam Silika Gel 60 PF 254;
fase gerak n-heksan−etil asetat (2:1) 71 20. Hasil pengujian antimikroba hasil Sepacore fraksi D ekstrak
larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata 72 21. Foto hasil profil KLT-Preparatif fraksi D3 M. umbellata
var. deglabrata. Fase diam silika gel 60 PF 254; fase gerak
n-Heksan−Etil Asetat (1:1) 73
22. Hasil identifikasi komponen kimia isolat D3d Melochia umbellata var. deglabrata. Fase diam silika gel 60 F254;
fase gerak n-heksan :etil asetat (2:1) 74 23. Kromatogram lapis tipis senyawa alkaloid hasil isolasi dari
Ekstrak M. umbellata var. deglabrata 75
24. Foto Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata 76
1
A. Latar Belakang
Penyakit infeksi merupakan penyakit yang banyak diderita oleh masyarakat Indonesia sejak dahulu. Menurut WHO, satu dari beberapa penyebab penyakit dan kematian disebabkan infeksi bakteri dan jamur (Dehgani et al., 2012). Penyakit infeksi yang banyak diderita masyarakat diantaranya disebabkan karena Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Staphyolococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, dan sebagainya (Dzulkarnain dkk., 2006). Penelusuran dan pemanfaatan senyawa aktif alami yang bersifat antibakteri didasarkan pada banyaknya bakteri patogen yang dapat menimbulkan masalah serius pada manusia. Penggunaan bahan-bahan kimia dan antibiotik yang tidak rasional dapat menyebabkan resistensi bakteri (Marpaung, 2004).
Daun paliasa sudah lama digunakan oleh masyarakat Sulawesi Selatan untuk pengobatan penyakit seperti gangguan hati dan kanker.
Sebutan paliasa ditemukan pada 3 jenis tumbuhan yang berbeda yaitu Kleinhovia hospital Linn, Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata, dan Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. visenia. Glikosida stigmasterol yang diisolasi dari ekstrak kloroform akar M. umbellata var. deglabrata dilaporkan memiliki aktifitas antifungi terhadap Malazesia furfureus, Candida albicans, dan Aspergillus niger (Riday dkk., 2012). Beberapa
genus dari Melochia yang lain yang telah diketahui kandungan kimianya antara lain alkaloid chameodrone dan antidesmone yang berkhasiat antimikroba dari Melochia chamaedrys (Dias et al., 2007). Berdasarkan pendekatan kemotaksonomi yaitu kenyataan bahwa tumbuhan sejenis, sesuku atau yang mempunyai kekerabatan dekat dari segi taksonomi kemungkinan mempunyai kandungan yang sama atau hampir sama dari segi kimianya, maka M. umbellata var. deglabrata diduga memiliki aktivitas antimikroba.
Penelitian mengenai isolasi senyawa M. umbellata var. deglabrata telah dilakukan dan diperoleh senyawa MU-1; MU-2; dan MU-3. Pada pengujian antimitosis dengan menggunakan sel telur bulu babi, diperoleh nilai IC50 untuk senyawa MU-1, MU-2, dan MU-3 masing-masing berturut- turut 0,092; 18,901; dan 4,454 μg/ml. Hasil pengujian dengan menggunakan metode MTT menggunakan sel HeLa untuk senyawa MU-1, MU-2, dan MU-3 dengan waktu perlakuan 24 jam diperoleh nilai IC50
40,314; 24342,69; dan 418,621 μg/ml (Rahim, 2010).
Berdasarkan hal tersebut perlu dilakukan penelitian isolasi senyawa aktif antimikroba dan dari ekstrak M. umbellata var. deglabrata. Metode isolasi senyawa dilakukan dengan prinsip bioassay guided isolation dengan menggunakan uji aktivitas antimikroba sebagai pemandu pada setiap tahap pengerjaan.
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan di atas, maka rumusan masalah dalam penelitian ini sebagai berikut :
1. Apakah ekstrak M. umbellata var. deglabrata memiliki aktivitas sebagai antimikroba?
2. Seberapa besar aktivitas senyawa yang diisolasi dari ekstrak M. umbellata var. deglabrata sebagai antimikroba ?
3. Bagaimana karakteristik senyawa aktif antimikroba yang diisolasi dari ekstrak M. umbellata var. deglabrata ?
C. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah :
1. Mengetahui aktivitas antimikroba ekstrak M. umbellata var. deglabrata.
2. Mengetahui aktivitas antimikroba senyawa aktif yang diisolasi dari ekstrak M. umbellata var. deglabrata terhadap beberapa mikroba uji.
3. Menentukan karakterisitik senyawa aktif antimikroba dari ekstrak M. umbellata var. deglabrata terhadap beberapa mikroba uji.
D. Manfaat Penelitian
Secara umum hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah khasanah pengembangan ilmu pengetahuan terutama dibidang mikrobiologi dan eksplorasi bahan obat alami dan diperoleh senyawa penuntun (lead compound) dalam penemuan obat-obat di masa yang akan datang. Secara khusus penelitian ini diharapkan diperoleh senyawa yang memiliki aktivitas antimikroba yang dapat dikembangkan sebagai antimikroba baru di masa yang akan datang.
5
A. Uraian Tumbuhan 1. Klasifikasi Tumbuhan (Backer and Brink, 1965)
Divisi : Spermatophyta Anak divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Anak Kelas : Simpetalae Bangsa : Sterculiales Suku : Sterculiaceae Marga : Melochia
Jenis : Melochia umbellata (Houtt) Stapf
Varietas : M. umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata 2. Nama Daerah
Paliasa (Makassar)- Aju pali, pali (Bugis)- Aju Pali (Mandar)- Daun monto (Toraja) Katimahar, kinar (Ambon)- Ngaru (Ternate)- Katimaha (Jawa)- Tangkolo, tangkele, timoko (Sunda)- Katimaha, Katimahu (Bali)- Noton (Papua)- Wonolita (Muna) (Windadri dkk., 2006).
3. Morfologi Tumbuhan
Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata K. merupakan pohon yang tingginya 1-15 meter, berakar tunggang. Batang bulat, keras, berkayu, berwarna coklat sampai coklat keputihan. Daun bertangkai
panjang, berbentuk jantung lebar, ukuran 5-26 kali 3,5-26 cm, pada pangkal tulang daun bercabang sehingga bertulang menjari, berwarna hujau tua, berbulu kurang rapat, kasar, pangkal daun bertoreh atau berlekuk, tepi daun bergigi, ujung daun runcing. Bunga berwarna putih sampai putih kehijauan, berbentuk malai. Buah beruang lima, berambut, memanjang dan bersekat (Backer and Brink, 1965).
4. Kandungan Kimia
Daun Paliasa mengandung senyawa triterpenoid, asam prusid, minyak atsiri, alkaloid, asam lemak, skopoletin, kempferol, quersetin, furano- isoflavon, glikosida stigmasterol. Beberapa genus dari melochia yang lain yang telah diketahui kandungannya antara lain alkaloid chamaedrone dan antidesmone yang berkhasiat antimikroba dari Melochia chamaedrys.
Alkaloid melochinone, melonovine-A dan melonovine-cutianine dari Melochia tomentosa (Dias et.al., 2007; Ridhay dkk., 2012 ). Alkaloid frangulanine dan waltherione-A, yang berkhasiat antifungi dari Melochia odorata, alkaloid myrianthine-B dan lotusanine-A, frangufoline, frangunine dan melofoline dari Melochia Corchorifolia, serta adouetine dan integerrenine dari Melochia pyramidata (Tan and Zhou, 2006).
5. Kegunaan
Daun Melochia umbellata secara empiris digunakan untuk mengobati penyakit kanker khususnya kanker hati (Tayeb dkk, 2008). Daun Melochia umbellata digunakan dan dipercaya berkhasiat sebagai obat yang mampu mengobati penyakit liver, hipertensi, diabetes, kolesterol
tinggi dan hepatitis dengan cara meminum air rebusannya (Erwin dkk, 2009). Daunnya juga digunakan sebagai obat gatal-gatal dan kudis.
Beberapa kandungan kimia dari genus melochia diketahui berkhasiat sebagai antimikroba dan antifungi (Rahim, 2010).
B. Ekstraksi dan Isolasi Komponen Kimia 1. Ekstraksi
Proses untuk mendapatkan ekstrak disebut ekstraksi, yaitu penyarian zat berkhasiat atau zat aktif dari bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut (Dirjen POM, 1986).
Ragam ekstraksi yang tepat sudah tentu bergantung pada tekstur dan kandungan air bahan tumbuhan yang diekstraksi dan pada jenis senyawa yang diisolasi. Umumnya kita perlu ‘membunuh’ jaringan tumbuhan untuk mencegah terjadinya oksidasi enzim atau hidrolisis. Bila ampas jaringan, pada ekstraksi ulang, sama sekali tak berwarna hijau lagi, dapat dianggap semua senyawa berbobot molekul rendah telah terekstraksi (Harborne, 1987).
a. Tujuan Ekstraksi
Tujuan ekstraksi adalah untuk menarik komponen kimia dari tanaman.
Ekstrak adalah senyawa aktif dari tanaman atau jaringan hewan, dengan menggunakan pelarut yang selektif. Proses ekstraksi ini berdasarkan pada kemampuan pelarut organik untuk menembus dinding sel dean masuk dalam rongga sel yang mengandung zat aktif (Dirjen POM, 1986).
b. Jenis-Jenis Ekstraksi
Proses ekstraksi dapat dilakukan secara panas dan secara kering.
Ekstraksi secara panas yaitu dengan metode refluks dan destilasi uap air, sedangkan ekstraksi dingin yaitu dengan maserasi, perkolasi dan soxhletasi (Sudjadi, 1988).
c. Ekstraksi Secara Maserasi
Umumnya zat aktif yang terkandung dalam tanaman maupun hewan lebih larut dalam pelarut organik. Proses terekstraksinya zat aktif dalam tanaman adalah sebagai berikut, pelarut organik akan menembus dinding sel dan masuk kedalam rongga sel tanaman atau hewan yang mengandung zat-zat aktif. Zat –zat aktif tersebut akan terlarut sehingga akan terjadi perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan pelarut organik diluar sel. Maka larutan terpekat akan berdifusi keluar sel, dan proses ini berulang terus sampai terjadi kesetimbangan antara konsentrasi zat aktif di dalam dan di luar sel (Dirjen POM, 1986).
Maserasi merupakan jenis ekstraksi yang sangat sederhana yang dilakukan dengan cara merendam bahan simplisia dalam cairan penyari.
Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan terlarut dan adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan di luar sel, maka zat aktif (zat terlarut) ditarik keluar. Peristiwa tersebut terjadi berulang kali hingga terjadi kesetimbangan konsentrasi antara larutan diluar dan di dalam sel.
Maserasi dilakukan dengan cara memasukkan 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan cairan penyari 75 bagian, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk (Dirjen POM, 1986).
2. Metode Isolasi
Prosedur kromatografi merupakan teknik yang paling beragam dan banyak digunakan pada fraksinasi ekstrak. Semua kromatografi didasarkan pada perbedaan distribusi senyawa diantara dua fase, yaitu fase gerak dan fase diam. Fase gerak adalah fluida yang dapat berupa cairan, gas atau cairan superkritis. Fase diam yang digunakan berupa padatan yang terdiri dari partikel-partikel halus (Houghtin and Raman, 1998).
Kromatografi adalah suatu metode fisik, dimana komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan diantara 2 fasa, salah satu fasa tersebut adalah fasa stasioner dangan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut di sepanjang landasan stasioner. Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom, dan tentu saja dasar pemisahan terletak dalam laju perpindahan sebuah zat terlarut sebagai hasil dua faktor, yang satu cenderung menggerakkan zat terlarut itu, dan yang lain menahannya (Day dan Underwood, 2002)
Solut akan terelusi menurut perbandingan distribusinya. Jika perbedaan perbandingan distribusi solut cukup besar maka campuran-
campuran solut akan mudah dan cepat dipisahkan. Solut yang tidak tertahan akan bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak, karena perbandingan distribusi dan faktor retensinya sama dengan fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan pada posisi titik awal di permukaan fase diam (Rahman, 2007).
a. Flash Chromatography Column
Bahan alam terus menerus dievaluasi sebagai alternatif obat klasik dan oleh karena itu kebutuhan untuk separasi dari campuran kompleks menjadi berkembang. Flash kromatografi adalah sebuah teknik yang sangat berharga dalam bidang penelitian bahan alam karena memberikan kecepatan dan cara yang ekonomis untuk memisahkan komponen utama dari ekstraksi kompleks tumbuhan.
Sepacore memberikan kemudahan dalam penggunaan flash kromatografi dengan tekanan yang dapat diperpanjang sampai dengan 10bar/145psi atau 50bar/725psi. Keuntungan utama dari sistem sepacore:
a. Kemampuan tekanan tinggi untuk pemisahan fase terbalik bahkan pada kolom MPLC.
b. Pemantauan yang mudah secara visual dengan kolom gelas.
c. Presisi dan reprodusibel untuk pemisahan kompleks (Buchi, 2011).
Pada kromatografi flash, pelarut pengembang didorong dengan cepat (dengan tekanan gas) melalui kolom bergaris tengah besar, tetapi pendek, yang berisi penjerap basah yang ukuran partikelnya dikendalikan dengan agak ketat. Daerah linarut dielusi menjadi beberapa fraksi
(biasanya menggunakan tangan bukan pengumpul fraksi) dan semua fraksi dianalisis dengan KLT. Penjerap harus berukuran 40-60 µm (230- 400 mesh). Kolom dilengkapi dengan sistem katup jarum dan pengendali aliran. Tekanan dapat diperoleh dari pipa udara bersih atau tangki gas nitrogen yang disambungkan dengan pengatur aliran. Jika sistem dirakit, udara atau nitrogen keluar dari katup jarum yang terbuka. Jika katup ditutup atau ditutup sebagian, tekanan akan meningkat, menyebabkan pengembangan kromatogram secara cepat. Sistem pelarut yang menghasilkan Rf sekitar 0,35 untuk komponen utama biasanya akan menghasilkan pemisahan yang dapat diterima. Satu-satunya masalah yang timbul ialah jika memakai pelarut yang lebih polar di dalam campuran dengan perbandingan yang sangat kecil. Hal ini menempatkan sistem dalam suatu daerah jangkauan yang dapat sangat mengubah kepolaran hanya akibat perubahan yang kecil saja dalam susunan linarut (Gritter, 1991).
b. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
KLT preparatif merupakan salah satu metode yang paling sederhana dan murah untuk mengisolasi komponen dari suatu campuran, meskipun pengerjaannya intensif dan hanya sedikit isolat yang diperoleh dari setiap prosedur fraksinasi. Metode kerjanya meliputi penotolan ekstrak tanaman dalam bentuk pita pada lempeng KLT. Lempeng yang digunakan pada KLT preparatif biasanya mempunyai ketebalan 0,5-1 mm. Hal ini memungkinkan sampel dalam jumlah lebih besar dapat dimuat pada
lempeng KLT. Lempeng dikembangkan dalam pelarut yang telah diketahui mampu memisahkan komponen (Houghtin and Raman, 1998).
Metode deteksi yang paling sering digunakan adalah menggunakan lapisan fluoresensi dan diamati di bawah sinar UV, karena metode ini akan mendeteksi semua senyawa yang mengalami quenching. Sama halnya, senyawa yang dapat berfluoresensi dapat dideteksi di bawah sinar UV jika lapisan non-fluoresensi digunakan. Jika zone tidak dapat dideteksi dengan sinar UV, dapat digunakan semprotan kromatogenik disepanjang tepi lempeng, paling kurang 90 % dari lempeng harus ditutup saat lempeng disemprot. Posisi pita-pita ini selanjutnya digunakan untuk memperkirakan posisi pita yang telah dihindarkan dari semprotan. Hanya pita-pita ini, dan bukan bagian yang disemprot yang diberi tanda (Hostetmann, K., M.
Hostettmann dan A. Marston, 1985). Pita-pita yang telah diberi tanda kemudian dikeruk dari lempeng atau digunting dari kertas foil dan dilarutkan dengan pelarut yang sesuai. Paling baik menggunakan pelarut yang kepolarannya paling rendah yang mampu mengelusi sempurna senyawa yang diinginkan. Suspensi fase diam kemudian disaring atau disentrifus dan filtrat atau supernatan yang mengandung senyawa dari pita dalam larutan diuapkan untuk memperoleh senyawa yang dibutuhkan.
Metode ini dapat mengisolasi senyawa sekitar 40 mg. Identifikasi dan kemurnian senyawa selanjutnya dapat diperiksa menggunakan teknik spektroskopi. Tahap pemurnian selanjutnya, yaitu rekristalisasi dapat
dilakukan jika perlu (Houghtin and Raman, 1998 dan Hostetmann, K., M.
Hostettmann dan A. Marston, 1985).
3. Metode Identifikasi
Pada identifkasi suatu kandungan bahan alam, setelah kandungan itu diisolasi dan dimurnikan, pertama-tama harus kita tentukan dahulu golongannya kemudian barulah ditentukan jenis senyawa dalam golongan tersebut. Golongan senyawa biasanya dapat ditentukan dengan uji warna, penentuan kelarutan, bilangan Rf, dan ciri spektrum UV.
Identifikasi lengkap dalam golongan senyawa bergantung pada pengukuran sifat atau ciri lain, yang kemudian dibandingkan dengan data dalam pustaka (Harborne, 1987).
C. Antimikroba 1. Pengertian Antimikroba
Bahan-bahan atau obat-obatan yang digunakan untuk memberantas infeksi mikroba pada manusia termasuk diantaranya antibiotika, antiseptika, disenfektansia, dan preservatif.
Obat-obat yang digunakan untuk membasmi mikroorganisme yang menyebabkan infeksi pada manusia, hewan ataupun tumbuhan harus bersifat toksisitas selektif artinya obat atau zat tersebut harus bersifat toksik terhadap mikroorganisme penyebab penyakit tetapi relatif tidak toksit terhadap jasad inang atau hospes. (Djide dan Sartini, 2008).
2. Sifat Antimikroba a. Bakteriostatik
Zat atau bahan yang dapat menghambat atau menghentikan pertumbuhan mikroorganisme (bakteri). Dalam keadaan seperti ini jumlah mikroorganisme menjadi stasioner, tidak dapat lagi bermultiplikasi dan berkembang biak. Contoh sulfonamida, tetrasiklin, kloramfenikol, dan eritromisin.
b. Bakteriosida
Zat atau bahan yang dapat membunuh mikroorganisme (bakteri).
Dalam hal ini jumlah mikroorganisme (bakteri) akan berkurang atau bahkan habis, tidak dapat lagi melakukan multiplikasi atau berkembang biak. Contoh penisilin, sefalosporin, dan neomisin (Djide dan Sartini, 2008).
3. Prinsip Kerja Antimikroba
Suatu antimikroba memperlihatkan toksisitas yang selektif, dimana obatnya lebih toksik terhadap mikroorganismenya dibandingkan pada sel hospes. Hal ini dapat terjadi karena pengaruh obat yang selektif terhadap mikroorganisme atau karena obat pada reaksi-reaksi biokimia yang penting dalam sel parasit lebih unggul dari pada pengaruhnya terhadap hospes. Disamping itu struktur sel mikroorganisme berbeda dengan struktur sel manusia (hospes, inang) (Djide dan Sartini, 2008).
4. Mekanisme Antimikroba
a. Mengganggu metabolisme sel mikroba
Pada umumnya bakteri memerlukan para amino benzoic acid (PABA) untuk mensintesis purin dan pirimidin (prekursor DNA dan RNA), bila asam folat tidak ada, sel-sel tidak dapat tumbuh atau membelah (Mycek, 2001).
Antimikroba bekerja memblok terhadap metabolit spesifik mikroba, seperti Sulfonamida. Sulfonamida menghambat pertumbuhan sel dengan menghambat sintesis asam folat oleh bakteri. Sulfanamida secara struktur mirip dengan asam folat, para amino benzoic acid (PABA), dan bekeja secara kompetitif untuk enzim-enzim yang langsung mempersatukan PABA dan sebagian pteridin menjadi asam dihidraptroat (Djide dan Sartini, 2008).
b. Penghambatan sintesis dinding sel
Dinding sel mikroba secara kimia adalah peptidoglikan yaitu suatu kompleks polimer mukopeptida (glikopeptida). Struktur dinding sel dapat dirusak dengan cara menghambat reaksi pembentukannya atau mengubahnya setelah dinding sel tersebut selesai dibentuk.
Antimikroba ini dapat menghambat sintesis atau menghambat aktivitas enzim seperti enzim transpeptidase yang dapat menimbulkan kerusakan dinding sel yang berakibat sel mengalami lisis. Contohnya : Basitrasin Sefalosporin, Sikloserin, Penisilin, Vankomisin (Ganiswarna, 1995 dan Jawetz dkk., 2008).
c. Penghambatan tehadap fungsi membran sel
Membran sitoplasma mempertahankan bahan-bahan tertentu didalam sel dan mengatur aliran keluar masuknya bahan-bahan lain. Membran sel memelihara integritas komponen-komponen seluler. Kerusakan pada membran ini akan mengakibatkan menghambatnya pertumbuhan sel atau matinya sel, akibatnya mikroba akan mati. Jika fungsi integritas membran sitoplasma dirusak, makromolekull dan ion keluar dari sel, kemudian sel akan rusak. Dalam hal inii antimikroba dapat berinteraksi dengan sterol sitoplasma pada jamur, dan merusak membran sel bakteri Gram negatif. Contohnya : Amfoterisin , kolistin, Imidasol, Polien, Polimiksin (Ganiswarna, 1995 dan Jawetz dkk., 2008).
d. Penghambatan terhadap sintesis protein
Hidupnya suatu sel tergantung pada terpeliharanya molekul-molekul dalam keadaan alamiah. Suatu kondisi atau substansi mengubah keadaan ini yaitu mendenaturasi protein dengan merusak sel tanpa dapat diperbaiki kembali. Suhu tinggi atau konsentrasi beberapa zat dapat mengakibatkan koagulasi irreversible komponen-komponen seluler yang vital ini.
Antimikroba mempunyai fungsi ribosom pada mikroorgenisme yang menyebabkan sintesis protein terlambat. Dimana dapat berikatan dengan ribosom 30S yang dapat menyebabkan akumulasi sintesis protein awal yang kompleks, sehingga salah dalam menerjemahkan tanda m-RNA dan menghasilkan polipeptida yang abnormal. Selain itu juga dapat
berikatan dengan ribosom 50S yang dapat menghambat ikatan asam amino baru pada rantai peptida yang memanjang. Contonya aminoglikosida, kloranfnikol, tetrasiklin, eritromisin dan linkomisin (Ganiswarna, 1995).
e. Penghambatan terhadap sintesis asam nukleat.
Begitu pentingnya DNA dan RNA dalam proses kehidupan sel. Hal ini berarti bahwa gangguan apapun yang terjadi pada pembentukan atau pada fungsi zat-zat tersebut dapat mengakibatkan kerusakan total pada sel. Dalam hal ini mempengaruhi metabolisme asam nukleat, seperti berikatan dengan enzim DNA dependen RNA-polymerase bakteri, memblokir helix DNA. Contoh quinolon, pyrimethamin, sulfonamida, trimethoprim, dan trimetrexat (Pelczar et al., 2008).
D. Metode Uji Antimikroba a. Metode Dilusi (Pengenceran)
Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair dan dilusi padat yang digunakan untuk mengukur Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh minimum (KBM). Prinsip dari metode ini adalah sama yaitu dengan membuat seri pengenceran antimikroba pada medium cair yang telah ditambahkan mikroba uji. Ekstrak dikatakan aktif jika pada konsentrasi 1000 µg/ml mampu membunuh/menghambat pertumbuhan mikroba uji dengan tidak adanya pertumbuhan mikroba pada permukaan media pertumbuhan (Hoffmann et al., 1993).
b. Metode Difusi Agar Padat
Difusi adalah proses perpindahan molekul secara acak dari satu posisi ke posisi lain. Pada pengujian potensi suatu antibiotik dengan difusi agar menggunakan media padat yang pada permukaannya telah diinokulasikan mikroorganisme uji yang sensitif terhadap antibiotik yang secara merata.
Paper disk diletakkan pada permukaan media tersebut yang sebelumnya telah direndam dalam larutan antibiotika atau sampel yang akan diuji (Djide dan Sartini, 2008).
c. Metode Turbidimetri
Prinsip pengujian dengan metode ini adalah membandingkan akan derajat hambatan pertumbuhan mikroorganisme uji oleh dosis antibiotika yang diuji terhadap hambatan yang sama oleh dosis antibiotika baku pembanding dalam media cair. Yang mempengaruhi keberhasilan metode ini adalah lama waktu inkubasi dan keseragaman suhu selama waktu inkubasi (Djide dan Sartini, 2008).
d. Metode KLT-Bioautografi
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan teknik pemisahan yang banyak digunakan dalam proses pemurnian dan identifikasi senyawa kimia dalam tumbuhan. Salah satu aplikasi penting dari KLT adalah untuk mendeteksi senyawa antimikroba baru atau yang belum teridentifikasi yang biasa disebut sebagai teknik bioautografi. Metode ini merupakan metode yang cepat, sensitif, dan dapat melokalisir senyawa yang aktif sebagai antimikroba. Metode KLT-bioautografi dapat digunakan untuk
mengisolasi senyawa aktif yang telah diuji. KLT bioautografi memiliki keuntungan antara lain cepat, mudah disiapkan, relatif murah, tidak memerlukan peralatan yang rumit, hanya diperlukan beberapa mikrogram senyawa uji, dan hasilnya mudah untuk diinterpretasikan. Pemisahan senyawa dalam ekstrak tanaman dengan KLT yang dipadukan dengan bioautografi dapat digunakan sebagai metode isolasi yang mengacu pada pengujian hayati (bioassay-guided isolation method) untuk mengamati dan mengidentifikasi senyawa dengan memanfaatkan aktivitas biologis pada ekstrak sampel yang diuji. Pada bioautografi ini didasarkan atas efek biologi berupa antibakteri, anti protozoa, antitumor dan lain-lain dari substansi yang diteliti. Ciri khas dari prosedur boautografi adalah didasarkan atas teknik difusi agar, dimana senyawa antimikrobanya dipindahkan dari lapisan KLT ke medium agar yang telah diinokulasikan dengan merata bakteri uji yang peka. Dari hasil inkubasi pada suhu dan waktu tertentu akan terlihat zona hambatan di sekeliling dari spot dari KLT yang telah ditempelkan pada media agar. Zona hambatan ditampakkan oleh aktivitas senyawa aktif yang terdapat di dalam bahan yang diperiksa terhadap pertumbahan mikrooganisme uji (Hamburger, 1987 ; Djide dan Sartini, 2008).
.
E. Uraian Mikroba Uji 1. Escherichia coli
a. Klasifikasi (Garrity et al., 2004) Domain : Bacteria
Phylum : Proteobacteria
Class : Gammaproteobacteria Ordo : Enterobacteriales Familia : Enterobacteriaceae Genus : Escherichia
Spesies : Escherichia coli
b. Sifat dan morfologi. Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang lurus, 1,1 – 1,5 µm x 2,0 – 6,0 µm, motil dengan flagellum peritrikum atau non motil. Tumbuh dengan mudah pada medium nutrien sederhana. Laktosa difermentasi oleh sebagaian besar galur dengan produksi asam dan gas (Pelczar et al., 2008).
2. Bacillus subtilis
a. Klasifikasi (Garrity et al., 2004) Domain : Bacteria
Phylum : Firmicutes Class : Bacilli Ordo : Bacillales Familia : Bacillaceae Genus : Bacillus
Spesies : Bacillus sublitis
b. Sifat dan morfologi. Bacillus sublitis merupakan bakteri Gram positif memiliki sel batang 0,3 – 2,2 µm x 1,27-7,0 µm. Sebagian besar motil;
flagelum khas lateral. Membentuk endospora tidak lebih dari satu dalam sel spongarium. Kemoorganotrof. Metabolisme dengan respirasi sejati, fermentasi sejati, atau kedua-duanya, yaitu respirasi dan fermentasi.
Aerobik sejati atau anerobik fakultatif (Pelczar et al., 2008).
3. Pseudomonas aeruginosa a. Klasifikasi (Garrity et al., 2004) Domain : Bacteria
Phylum : Proteobacteria
Class : Gammaproteobacteria Ordo : Pseudomonadales Familia : Pseudomonadaceae Genus : Pseudomonas
Spesies : Pseudomonas aeruginosa
b. Sifat dan morfologi. Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri Gram negatif dengan berbentuk sel tunggal., batang lurus atau melengkung, namun tidak berbentuk heliks. Pada umumnya berukuran 0,5 – 1,0 µm. Motil dengan flagelum polar; monotrikus atau multitrikus. Tidak menghasilkan selongsong prosteka. Tidak dikenal adanya stadium istirahat. Kemoorganotrof. Metabolisme dengan respirasi, tidak pernah fermentatif. Beberapa merupakan kemolitotrof fakultatif, dapat
menggunakan H2 atau CO sebagai sumber energi. Oksigen molekuler merupakan penerima elektron universal., beberapa dapat melakukan denitrifikasi dengan menggunakan nitrat sebagai penerima pilihan (Pelczar et al., 2008).
4. Staphylococcus aureus (Garrity et al., 2004) a. Klasifikasi
Domain : Bacteria Phylum : Firmicutes Class : Bacilli Ordo : Bacillales
Familia : Staphylococcaceae Genus : Staphylococcus
Spesies : Staphylococcus aureus
b. Sifat dan morfologi. Staphylococcus aureus adalah bakteri Gram positif. Sel-sel berbentuk bola, berdiameter 0,5 – 1,5 µm, terdapat dalam tunggal dan berpasangan dan secara khas membelah diri pada lebih dari satu bidang sehingga membentuk gerombolan yang tak teratur. Non motil.
Tidak diketahui adanya stadium istirahat. Dinding sel mengandung dua komponen utama yaitu peptidoglikan dan asam teikoat yang berkaitan dengannya. Kemoorganotrof. Metabolisme dengan respirasi dan fermentatif. Anaerob fakultatif, tumbuh lebih cepat dan lebih banyak dalam keadaan aerobik. Suhu optimum 35 – 400C. Terutama berasosiasi dengan
kulit, dan selaput lendir hewan berdarah panas. Kisaran inangnya luas, dan banyak galur merupakan patogen potensial (Pelczar et al., 2008).
5. Staphylococcus epidermis (Garrity et al., 2004) a. Klasifikasi
Domain : Bacteria Phylum : Firmicutes Class : Bacilli Ordo : Bacillales
Familia : Staphylococcaceae Genus : Staphylococcus
Spesies : Staphylococcus epidermis
b. Sifat dan morfologi. Staphylococcus epidermis adalah bakteri Gram positif. Sel-sel berbentuk bola, berdiameter 0,5 – 1,5 µm, terdapat dalam tunggal dan berpasangan dan secara khas membelah diri pada lebih dari satu bidang sehingga membentuk gerombolan yang tak teratur. Anaerob fakultatif, tumbuh lebih cepat dan lebih banyak dalam keadaan aerobik.
Suhu optimum 35 – 400C. Terutama berosiasi dengan kulit, dan selaput lendir hewan berdarah panas (Pelczar et al., 2008).
6. Streptococcus mutans (Garrity et al., 2004) a. Klasifikasi
Domain : Bacteria Phylum : Firmicutes Class : Bacilli
Ordo : Lactobacillales Familia : Streptococccaceae Genus : Streptococcus
Spesies : Streptococcus mutans
b. Sifat dan morfologi. Streptococcus mutans termasuk bakteri Gram positif berbentuk bola sampai lonjong, berdiameter 0,5-1,5 µm, koloni bulat cembung dengan permukaan licin atau sedikit kasar dan tepi seluruhnya atau sebagian tidak beraturan. Koloni buram berwarna biru terang, bersifat fakultatif aerob, dapat tumbuh pada suhu 45 0C dan suhu optimumnya. Dinding sel terdiri dari 4 komponen antigenik yaitu peptidoglikan, polisakarida, proten dan asam lipokoat (Pelczar. et al., 2008).
7. Salmonella typhi (Garrity et al., 2004) a. Klasifikasi
Domain : Bacteria
Class : Gammaproteobacteria Ordo : Enterobacteriales Familia : Enterobacteriaceae Genus : Salmonella
Spesies : Salmonella typhi
b. Sifat dan morfologi. Salmonella typhi adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang lurus dengan ukuran 0,7-1,5 µm, biasanya tunggal dan kadang-kadang membentuk rantai pendek, jenis yang bergerak berflagel
peritrik, hidup secara aerobik atau anaerobik fakultatif, meragikan glukosa dengan menghasilkan asam kadang-kadang gas. Tumbuh optimal pada suhu 37 0C dan berkembang baik pada suhu kamar, bakteri ini dapat ditemukan di saluran pencernaan manusia dan hewan. Bakteri ini merupakan penyebab demam tifoid karena adanya infeksi akut pada usus halus manusia dan hewan (Pelczar et al., 2008).
8. Vibrio sp (Garrity et al., 2004) a. Klasifikasi
Domain : Bacteria Phylum : Proteobacteria
Class : Gammaproteobacteria Ordo : Vibrioanales
Familia : Vibrionaceae Genus : Vibrio
Spesies : Vibrio sp
b. Sifat dan morfologi. Vibrio sp adalah bakteri Gram negatif. Batang pendek, tidak membentuk spora, sumbuhnya melengkung atau lurus, 0,5 µm x 1,5-3,0 µm, terdapat tunggal atau kadang-kadang bersatu dalam bentuk S atau spiral. Motil dengan satu flagelum polar, atau pada beberapa spesies dengan dua atau lebih flagelum dalam satu berkas polar; hanya sesekali non motil. Seringkali mempunyai sferoplas, biasanya dibentuk dalam keadaan lingkungan yang kurang menguntungkan. Tidak tahan asam. Tidak membentuk kapsul. Tumbuh baik dan cepat pada
medium nutrien baku. Kemoorganotrof. Metabolisme dengan respirasi (menggunakan oksigen) dan fermentatif. Anaerobik fakultatif. Suhu optiumum berkisar dari 18-370C (Pelczar et al., 2008).
9. Shigella dysentriae (Garrity et al., 2004) a. Klasifikasi
Domain : Bacteria
Phylum : Proteobacteria
Class : Gammaproteobacteria Ordo : Enterobacteriales Family : Enterobacteriaceae Genus : Shigella
Spesies : Shigella dysentriae
b. Sifat dan morfologi. Batang nonmotil. Gram negatif. Tidak berkapsul.
Tumbuh baik pada media nutrien dan tidak memerlukan faktor tumbuh khusus. Tidak dapat menggunakan sitrat atau malonat sebagai sumber karbon satu-satunya. Pertumbuhan dihambat oleh KCN. Tidak menghasilkan H2S. Glukosa dan karbohidrat lain difermentasi dengan produksi asam, tetapi tanpa gas (Pelczar et al., 2008).
10. Candida albicans a. Klasifikasi
Domain : Fungi
Phylum : Ascomycota
Subphylum : Saccharomycotina
Class : Saccharomycetes Ordo : Saccharomycetales Family : Saccharomycetaceae Genus : Candida
Spesies : Candida albicans
b. Sifat dan morfologi. Pada sediaan apus eksudat, Candida tampak sebagai ragi lonjong, kecil, berdinding tipis, bertunas, gram positif, berukuran 2-3 x 4-6 μm, yang memanjang menyerupai hifa (pseudohifa).
Candida membentuk pseudohifa ketika tunas-tunas terus tumbuh tetapi gagal melepaskan diri, menghasilkan rantai sel-sel yang memanjang yang terjepit atau tertarik pada septasi-septasi diantara sel. Candida albicans bersifat dimorfik, selain ragi-ragi dan pseudohifa, ia juga bisa menghasilkan hifa sejati.
F. Kerangka Teori
Pendekatan kemotaksonomi
- Alkaloid chamaedrone dan antidesmone yang berkhasiat antimikroba dari Melochia chamaedrys.
- Glikosida stigmasterol dari ekstrak kloroform akar M. umbellata var. deglebrata memiliki aktifitas antifungi.
Melochia umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata
Metabolit primer Metabolit sekunder
-Alkaloid -Triterpenoid -Quersetin -Stigmasterol
Senyawa antimikroba dari M. umbellata (Houtt) Stapf var. deglabrata
G. Kerangka Konsep
H. Hipotesis
1. Ekstrak M. umbellata var. deglabrata memiliki aktivitas sebagai antimikroba.
2. Isolat aktif M. umbellata var. deglabrata memiliki aktivitas antimikroba terhadap beberapa mikroba uji.
Isolat senyawa M. umbellata var. deglabrata Aktivitas antimikroba
29
A. Alat dan Bahan 1. Alat
Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, autoklaf (Hirayama), laminar air flow (Esco), mikropipet (Socorex), oven (Memmert), rotary evaporator (IKA), sepacore flash chromatography (Buchi), seperangkat alat KLT dan KLT preparatif, seperangkat alat maserasi, spektrofotometer FT-IR (Bruker), spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu), sentrifus (Hettich), dan timbangan analitik (Sartorius).
2. Bahan
Bahan yang digunakan adalah dau n M. umbellata var.deglabrata, aluminium klorida, aquadest, besi (III) klorida, biakan murni (Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans ATCC 10231, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhi NCTC 786, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Streptococcus mutans, Vibrio cholerae, dan Shigella dysentriae), cakram kertas berdiameter 6 mm (Oxoid), DMSO (Dimetil Sulfoksida), pereaksi Dragendorf, etanol 70%, etil asetat, H2SO4
10%, kloramfenikol, kloroform, larutan fisiologis NaCl 0,9 %, lempeng silika gel 60 PF 254 (E.Merck), , pereaksi Lieberman-Burchard, metanol, medium Nutrient Agar (NA), medium Glukosa Nutrient Broth (GNB),
medium Potato Dekstrosa Agar (PDA), n-heksan, dan silika gel 60 (0,040- 0,063 mm) (E.Merck).
B. Cara Kerja 1. Pengambilan dan Pengolahan Sampel
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun tumbuhan M.umbellata var.deglabrata dikumpulkan dari kota Makassar, Sulawesi Selatan pada koordinat 119°27’59,59” BT dan 5°09’00,51” LS. Daun dibersihkan dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di tempat yang tidak terkena sinar matahari. Setelah kering diserbukkan dan siap digunakan sebagai bahan penelitian.
2. Pembuatan Ekstrak
Serbuk sampel sebanyak 2500 g dimasukkan ke dalam wadah
maserasi kemudian ditambahkan 10 (sepuluh) liter pelarut n-heksan dan dibiarkan selama 24 jam sambil sekali-kali diaduk.
Filtrat disaring dan ampas direndam lagi dengan pelarut yang sama. Hal ini dilakukan selama 3 x 24 jam. Filtrat dikumpulkan dan diuapkan pada rotavapor hingga diperoleh ekstrak n-heksan kental.
Ampas dikeringkan kemudian dengan cara yang sama diekstraksi kembali dengan pelarut metanol hingga diperoleh ekstrak metanol.
Ekstrak metanol yang diperoleh dipartisi dengan menggunakan pelarut etil asetat hingga diperoleh ekstrak metanol larut etil asetat dan tidak larut etil asetat.
3. Fraksinasi dengan Sepacore Flash Chromatography Column (Buchi, 2011)
Ekstrak metanol larut etil asetat yang memiliki aktivitas antimikroba yang paling besar difraksinasi menggunakan sepacore dengan campuran eluen n-heksan−etil asetat dengan gradien yang meningkat selama 30 menit. Fraksi-fraksi yang terkumpul pada tabung digabung berdasarkan peak yang tampak pada detektor. Diperoleh 6 fraksi gabungan selanjutnya diuji aktivitas antimikrobanya dengan metode difusi agar. Refraksinasi dilakukan dengan cara yang sama untuk hasil fraksi yang memiliki aktivitas antimikroba terbesar. Masing-masing fraksi dimonitor komponen kimianya dengan KLT menggunakan fase diam silika 60 gel PF 254dan fase gerak n-heksan−etil asetat (2:1).
4. Isolasi dan Pemurnian Senyawa Aktif
a. KLT Preparatif (Houghtin and Raman, 1998)
Fraksi D3 dari sepacore yang memiliki aktivitas aktimikroba dilarutkan dengan metanol. Sampel ditotolkan secara berderet sehingga membentuk seperti pita dengan pipa kapiler pada lempeng kaca KLTP dan dielusi lalu dielusi dengan n-heksan–etil asetat (1:1). Setelah terelusi, lempeng dilihat pada UV 254 nm, 366 nm, dan penampak noda H2SO4 10%. Pita yang sama dengan noda yang memberikan efek antimikroba ditandai dan dikeruk. Senyawa yang diperoleh dipisahkan dari silika gel dengan cara disaring. Senyawa dimurnikan dan diuji kemurniannya dengan KLT dua dimensi.
b. Kromatografi Lapis Tipis Dua Dimensi
Isolat murni yang telah diperoleh kemudian ditotolkan pada lempeng KLT dengan ukuran 20 x 20 cm. Lalu dielusi dengan menggunakan dua cairan pengelusi, untuk proses elusi yang pertama dilakukan dengan cara menotolkan filtrat yang telah dilarutkan dengan pelarut yang cocok pada lempeng kemudian dielusi dengan n-heksan–etil asetat (2:1). Proses elusi yang kedua dengan cara memutar lempeng berlawanan arah jarum jam sehingga hasil elusi yang pertama menjadi titik awal pengelusian untuk yang kedua dengan menggunakan eluen kloroform–metanol (10:1).
Apabila pada dua kali proses elusi ini hanya menunjukkan satu bercak tunggal maka dapat dikatakan bahwa isolat senyawa antimikroba yang diperoleh adalah komponen kimia yang tunggal.
5. Karakterisasi Senyawa Antimikroba (Harborne, 1987) a. Identifikasi dengan Beberapa Penampakan Bercak
Kromatogram disemprot dengan menggunakan pereaksi semprot sebagai berikut:
1) Penampak bercak H2SO4 10%
Kromatogram dipanaskan pada 105OC selama 5 menit dan diamati.
Kebanyakan senyawa organik memberikan warna kuning, coklat, ungu, hitam.
2) Alkaloid
Pereaksi yang digunakan Dragendorf akan dihasilkan warna jingga dengan latar belakang kuning untuk senyawa golongan alkaloid.
3) Steroid
Pereaksi yang digunakan Liebermann-Burchard. Kromatogram terlebih dahulu dipanaskan, kemudian diamati di lampu UV. Munculnya noda berflouresensi coklat atau biru menunjukkan adanya triterpen, sedangkan munculnya warna hijau kebiruan menunjukkan adanya steroid.
4) Flavanoid
Pereaksi yang digunakan Aluminium klorida 5% diamati di lampu UV, akan dihasilkan noda berfluoresensi kuning untuk senyawa golongan flavonoid.
5) Fenol
Pereaksi yang digunakan Besi (III) Klorida 5% akan dihasilkan warna biru atau hijau untuk senyawa golongan fenol.
b. Identifikasi Spektrofotometri
1) Identifikasi Spektrofotometri Ultra Violet (UV) -Visibel 2) Identifikasi Spektrofotometri Infra Merah (IR)
6. Uji Aktivitas Antimikroba a. Sterilisasi Alat
Alat-alat yang diperlukan dicuci dengan deterjen, wadah mulut lebar dibersihkan dengan direndam dengan larutan deterjen panas selama 15- 30 menit diikuti dengan pembilasan pertama dengan HCl 0,1% dan terakhir dengan air suling. Alat-alat dikeringkan dengan posisi terbalik di udara terbuka setelah kering dibungkus dengan kertas perkamen. Tabung reaksi dan gelas erlenmeyer terlebih dahulu disumbat dengan kapas
bersih. Alat-alat dari kaca disterilkan di oven pada suhu 1800C selama 2 jam. Alat-alat suntik dan alat-alat plastik lainnya (tidak tahan pemanasan tinggi) disterilkan dalam otoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit dengan tekanan 2 atm. Jarum ose disterilkan dengan pemanasan langsung hingga memijar.
b. Penyiapan Mikroba Uji
Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhi NCTC 786, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Streptococcus mutans, Vibrio cholerae, Shigella dysentriae dan jamur uji yang digunakan Candida albicans ATCC 10231. Diremajakan dalam medium Nutrein Agar (NA) miring dan diinkubasi selama 1x 24 jam pada suhu 370C untuk bakteri dan untuk jamur 3x 24 jam pada suhu kamar.
Kultur mikroba yang telah diremajakan dalam medium Glukosa Natrient Agar (GNA) miring disuspensikan dengan NaCl fisiologis (NaCl 0,9%) kemudian diukur kekeruhannya 25% T untuk bakteri dan 75% T untuk jamur pada spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 580 nm.
c. Skrining Aktivitas Antimikroba dengan Metode Dilusi Padat
Skrining aktivitas antimikroba dilakukan dengan cara sebanyak 10 mg ekstrak metanol larut etil asetat, ekstrak metanol tidak larut etil asetat, dan ekstrak heksan dilarutkan dalam 0,2 ml DMSO, kemudian dicampurkan
dengan 9,8 ml media Glukosa Natrient Agar (GNA) yang telah dicairkan hingga diperoleh konsentrasi 1000 bpj. Campuran tersebut dituangkan ke dalam cawan petri dan digoyang-goyangkan agar rata dan dibiarkan memadat. Biakan mikroba uji yang telah diencerkan diambil 1 ose bulat dan digoreskan diatas permukaan medium, kemudian cawan petri diinkubasi pada suhu 370C selama 1x 24 jam untuk bakteri dan untuk jamur 3x 24 jam pada suhu kamar. Diamati aktivitas antimikroba dari ekstrak yang ditandai dengan tidak adanya atau sedikitnya pertumbuhan mikroba.
d. Uji Aktivitas Antimikroba Metode Difusi Agar Padat (Djide dan Sartini, 2008)
Uji aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode difusi agar dengan menggunakan cakram kertas (paper disc) berdiameter 6 mm. Sampel terlebih dahulu dibuat dengan konsentrasi 1000 bpj. Cakram kertas ditetesi 20 µl larutan sampel kemudian diuapkan dan diletakkan pada permukaan medium GNA yang telah diinokulasikan bakteri yang sensitif terhadap isolat, kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam, lalu diukur daerah hambatan. Pelarut metanol digunakan sebagai kontrol negatif. Pengujian dengan cara yang sama dilakukan pula untuk hasil refraksinasi sampel yang memiliki aktivitas antimikroba terbesar.
e. KLT-Bioautografi Metode Kontak (Djide dan Sartini, 2008)
Metode ini didasarkan atas difusi dari senyawa yang telah dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Fraksi D3 ditotolkan pada lempeng
kromatografi lapis tipis, kemudian dielusi dengan n-heksan–etil asetat (2:1). Lempeng kromatografi tersebut ditempatkan di atas permukaan medium Glucosa Nutrien Agar (GNA) yang telah diinokulasi dengan mikroorganisme selama 15-30 menit, lempeng kromatografi tersebut dipindahkan dan diangkat dari permukaan medium. Senyawa antimikroba yang telah berdifusi dari lempeng kromatogram ke dalam media agar akan menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi 1x 24 jam pada suhu 370C dan. Noda yang menghambat pertumbuhan mikroba uji nampak pada permukaan membentuk zona bening.
f. Uji Potensi Antimikroba (Hoffmann et.al., 1993) 1) Uji Kadar Hambat Minimum (KHM)
Penentuan harga Kadar Hambat Minimum isolat aktif untuk masing- masing bakteri uji dilakukan dengan cara membuat beberapa seri konsentrasi sampel 1000 bpj, 500 bpj, 250 bpj, 125 bpj, dan 62,5 bpj di dalam tabung reaksi pada medium Glucosa Nutrient Broth (GNB), kemudian ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan mikroba uji sebanyak 20 l dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Larutan kloramfenikol 30 bpj digunakan sebagai kontrol positif yang ditambahkan medium Glucosa Nutrient Broth (GNB) steril. Kontrol negatif terdiri dari, medium GNB steril dan suspensi mikroba uji dan kontrol medium hanya
digunakan medium GNB steril. Konsentrasi terendah isolat murni M. umbellata var. deglabrata yang masih tampak jernih setelah inkubasi
menunjukkan harga kadar hambat minimumnya.
2) Uji Potensi Dengan Metode Difusi Agar
Uji potensi isolat antimikroba dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan cakram kertas (paper disc) berdiameter 6 mm. Terlebih dahulu dibuat beberapa konsentrasi dari isolat, yaitu 1000 bpj, 500 bpj, 250 bpj, dan 125 bpj. Konsentrasi ditentukan berdasarkan KHM dari isolat.
Cakram kertas ditetesi 20 µl larutan isolat kemudian diuapkan, dengan bantuan pinset steril, cakram kertas diletakkan pada permukaan medium GNA yang telah diinokulasikan bakteri yang sensitif terhadap isolat.
Diinkubasi pada suhu 37oC selama ± 24 jam, lalu diukur daerah (zona) hambatan. Untuk kontrol positif, digunakan larutan baku kloramfenikol 30 bpj.
38
A. Hasil Penelitian 1. Hasil Ekstraksi Sampel
Hasil ekstraksi 2500 g serbuk kering daun Melochia umbellata (Houtt) Stapf. var. deglabrata adalah sebagai berikut.
Tabel 1. Hasil ekstraksi dan partisi cair padat ekstrak M. umbellata (Houtt) Stapf. var. deglabrata
Ekstrak Bobot (g)
n-heksan 35,640
Metanol 210,291
Ekstrak larut etil asetat 27,486 Ekstrak tidak larut etil asetat 168,415
2. Hasil Pengujian Skrining Antimikroba
Pengujian skrining antimikroba pada masing-masing ekstrak daun M. umbellata var. deglabrata (n-heksan, larut etil asetat, dan tidak larut etil asetat) pada konsentrasi 1000 bpj terhadap beberapa mikroba uji menunjukkan bahwa ekstrak larut etil asetat menunjukkan aktivitas antimikroba pada Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Vibrio cholera, dan Candida albicans ATCC 10231. Hasil skrining dapat dilihat pada tabel 2 dan gambar 1.
Tabel 2. Hasil skrining antimikroba ekstrak M. umbellata var. deglabrata.
Ekstrak Mikroba Uji
Bs Sa Se Sm Ec St Pa Vc Sd Ca
Ekstrak n-heksan - - - - + - - + + +
Ekstrak larut etil asetat - + - - + - + + - + Ekstrak tidak larut etil asetat - - - - + - - - - + Keterangan :
+ : menghambat pertumbuhan mikroba
- : tidak menghambat pertumbuhan mikroba
Gambar 1. Hasil pengujian skrining antimikroba ekstrak larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata.
Keterangan :
Ec : Escherichia coli Vsp : Vibrio cholera Sa : Staphylococcus aureus Bs : Bacillus subtilis Pa : Pseudomonas aeruginosa St : Salmonella typhi Sm : Streptococcus mutans Sd : Shigella dysentriae Se : Staphylococcus epidermidis Ca : Candida albicans
3. Hasil Sepacore dan Pengujian Antimikroba Ekstrak Larut Etil Asetat
a. Hasil Sepacore
Pemisahan komponen kimia dari ekstrak larut etil asetat dengan kolom sepacore flash chromatography menghasilkan 6 fraksi gabungan yaitu fraksi A (1-3), fraksi B (4-5), fraksi C (6-7), fraksi D (8-10), fraksi E (11-12), dan fraksi F (13-18). Data selengkapnya dapat dilihat pada tabel 3 dan gambar 2.
Tabel 3. Hasil kromatografi kolom sepacore 25 g ekstrak ekstrak larut etil asetat Melochia umbellata var. deglabrata
Fraksi Bobot fraksi (gram)
FA 1,586
FB 4,376
FC 3,952
FD 3,418
FE 2,813
FF 7,751
Gambar 2. Profil kromatogram ekstrak larut etil asetat Melochia umbellata var. deglabrata.
b. Hasil Pengujian Antimikroba Ekstrak Larut Etil Asetat
Pengujian aktivitas antimikroba fraksi dengan metode difusi agar terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Vibrio cholera, dan jamur Candida albicans ATCC 1023. Hasil yang diperoleh dapat dilihat pada tabel 4; serta gambar 3.
Tabel 4. Hasil pengujian antimikroba ekstrak larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata
Fraksi
Diameter Penghambatan (mm) Terhadap Mikroba Uji
Ec Pa Sa Vc Ca
Fraksi A - - - - -
Fraksi B - - - - -
Fraksi C - - - 7,20 -
Fraksi D 14,38 7,86 9,10 - -
Fraksi E 8,50 - - - -
Fraksi F - - - - 8,40
Kontrol negatif - - - - -
Gambar 3. Hasil pengujian antimikroba fraksi hasil sepacore ekstrak larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata.
Keterangan :
- : tidak menghambat pertumbuhan mikroba
Ec : Escherichia coli Pa : Pseudomonas aeruginosa Sa : Staphylococcus aureus 4 : Fraksi D
5 : Fraksi E 6 : Fraksi F
4. Hasil Fraksinasi dan Pengujian Antimikroba Fraksi D a. Hasil Fraksinasi Fraksi D dengan Sepacore
Pemisahan komponen kimia dari fraksi D ekstrak larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata dengan kolom sepacore flash chromatography menghasilkan 5 fraksi gabungan yaitu fraksi D1 (1-2), fraksi D2 (3-4), fraksi D3 (5-6), fraksi D4 (7-8), dan fraksi D5 (9-14). Data selengkapnya dapat dilihat pada tabel 5 dan gambar 4.
Tabel 5. Hasil kromatografi kolom sepacore 3,3 g fraksi D ekstrak larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata
Fraksi Bobot fraksi (gram)
FD1 -
FD2 0,362
FD3 0,415
FD4 0,861
FD5 1,374
Gambar 4. Profil kromatogram fraksi D ekstrak larut etil asetat Melochia umbellata var. deglabrata.
b. Hasil Pengujian Antimikroba Fraksi D
Pengujian aktivitas antimikroba subfraksi dengan metode difusi agar terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Hasil yang diperoleh dapat dilihat pada tabel 6 dan gambar 5.
Tabel 6. Hasil pengujian antimikroba fraksi D ekstrak larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata
Fraksi
Diameter Penghambatan (mm) Terhadap Mikroba Uji
Ec Pa Sa
Fraksi D2 - - -
Fraksi D3 11,20 8,80 7,20
Fraksi D4 7,32 - -
Fraksi D5 - - -
Kontrol negatif - - -
Keterangan :
Ec : Escherichia coli Pa : Pseudomonas aeruginosa Sa : Staphylococcus aureus
K(-) : Kontrol pelarut metanol
- : tidak menghambat pertumbuhan mikroba
Gambar 5. Hasil pengujian antimikroba hasil Sepacore fraksi D ekstrak larut etil asetat M. umbellata var. deglabrata.
Keterangan :
Ec : Escherichia coli Pa : Pseudomonas aeruginosa Sa : Staphylococcus aureus D2 : Subfraksi D2
D3 : Subfraksi D3 K : Kontrol pelarut metanol
