Asam valproat merupakan obat anti-epilepsi dan mulai digunakan sebagai obat antikanker berdasarkan aktivitasnya sebagai penghambat histone deacetylase yang dapat menghambat proliferasi sel.
Berdasarkan analisis secara statistik menunjukkan bahwa pemberian asam valproat pada dosis 250 mg/kg BB dapat menyebabkan penurunan jumlah sel endokrin pankreas anakan tikus (F1). Hubungan struktur-aktivitas menunjukkan bahwa induksi asam valproat menyebabkan gangguan perkembanganembriosecara in vivo.Sifat teratogenikasam valproat mungkin melibatkanprogramselularyang kompleks danregulasiberbagaikegiatangen.PPAR memainkan peranan utamadalam mekanisme aksi respons seluleruntukasam valproat. PPAR diaktifkan secara selektif oleh asam valproat dimana PPAR merupakan faktor pembatas dalam pengendalian diferensiasi sel (Werling et al. 2001).Ada kemungkinanperubahan aktivitasHDACdapat mempengaruhifaktor transkripsiatau modifikasihistonekspresi genyang menginduksi(pre) proinsulindalam sekresiinsulin (Larsen et al. 2007).
Pemberian Asam Valproat pada Kebuntingan Hari ke-9 (embrionik ke-9)
Masa kebuntingan pada tikus umumnya 20 hari, umumnya dikelompokkan menjadi 4 periode, yaitu : hari ke 0-5 adalah masa cleavage danblastulasi; hari ke 5-10 adalah masa implantasi, gastrulasidanorganogenesis awal (early organogenesis); hari ke 10-14 adalah masa organogenesis; hari ke 14-19 adalah masa pertumbuhan fetus dan perkembangan (Fetal growthandDevelopment). Hari kebuntingan ke-9 (embrionik ke-9) dipilih sebagai salah satu waktu pemberian asam valproat karena masa tersebut adalah tahap perkembangan awal organ yang akan mempunyai fungsi sesuai kebutuhan tubuh.
Berdasarkan penelitian pada stem cell diketahui bahwa pemberian asam valproat pada hari ke-9 pertumbuhan sel akan menghambat perkembangan sel endokrin pankreas (Jorgensen et al. 2007). Dengan demikian, diharapkan secara in vivo dapat memberikanpengaruh yang sama pada penghambatan perkembangan sel endokrin pankreas dari anak tikus (F1) yang induknya diberi asam valproat pada hari kebuntingan ke-9 (embrionik ke-9).
Hasil pengamatan kadar glukosa darah tikus F1 umur 8 minggu dari induk yang diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-9 belum menunjukkan adanya peningkatan kadar glukosa dibandingkan kontrol normal. Tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada umur 8 minggu dilihat dari parameter kadar glukosa dan histologi pankreas belum menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna jika dibandingkan dengan kontrol normal. Kondisi fisiologi antara tikus F1 yang induknya diberi asam valproat pada masa kehamilan dengan tikus kontrol normal juga menunjukkan tidak adanya perbedaan yang bermakna jika dilihat kadar glukosa darah. Kondisi ini menunjukkan sel pankreas masih cukup secara jumlah dan kemampuan menghasilkan insulin sehingga kadar glukosa darah masih dapat terkontrol
43 Pada tikus F1 umur 16 dan 24 minggu ada peningkatan kadar glukosa darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Hasil pengukuran kadar insulin darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada minggu ke-16 dan 24 menunjukkan adanya peningkatankonsentrasi insulin dalam darah dibanding kontrol normal. Kondisi ini menunjukkan adanya hiperinsulinemia yang terjadi karena adanya usaha mengontrol kenaikan kadar glukosa darah. Hasil ini sejalan dengan perubahan histomorfologi sel yang menunjukkan penurunan immuno reaktivitas sel terhadap antibodi anti-insulin. Kondisi demikian menggambarkan bahwa sel berusaha melepas hormon insulin ke sirkulasi darah sehingga kadar insulin yang tertinggal dalam sel menurun. Peningkatan kadar insulin dalam darah sangat mungkin terkait dengan upaya menjaga nilai kadar glukosa.
Penurunan populasi sel endokrin yang menghasilkan insulin pada tikus F1 umur 16 minggu dapat terjadi karena adanya dua kemungkinan, pertama karena sel-sel beta pulau langerhans pankreas tikus sudah tidak mampu menghasilkan insulin atau karena adanya peningkatan sekresi insulin ke darah untuk mengontrol kadar gula darah yang meningkat. Kedua hal ini bisa terjadi bersamaan sehingga kerusakan sel beta pankreas akan semakin parah. Hal ini mengindikasikan bahwa tikus F1 mengalami perubahan yang mendekati kondisi kejadian diabetes. Hasil evaluasi parameter glukosa darah, kadar insulin, dan gambaran histologis sel endokrin pada umur 16 dan 24 minggu mengindikasikan bahwa metabolisme glukosa tikus F1 mulai terganggu pada umur 16 minggu (dewasa).
Pengamatan kadar trigliserida darah tikus F1pada umur 16 minggudari induk yang diberi asam valproat menunjukkan adanya peningkatan. Tetapi pada umur 24 minggu tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna dibanding kelompok kontrol normal (Gambar 5.4).Peningkatan kadar trigliserida darah pada tikus F1 umur 16 minggu dapat terjadi karena tidak efektifnya kerja insulin. Salah satu efek insulin adalah untuk merangsang pembentukan lipoprotein lipase (LPL), suatu enzim yang melekat ke sel endotel kapiler di otot dan jaringan adiposa. Insulin seharusnya merangsang sel adiposa untuk mensintesis dan menyekresikan LPL, yang menghidrolisis trigliserida dalam kilomikron VLDL. Pada kondisi hewan percobaan ini, kadar insulin darah tinggi tetapi kadar glukosa darah tetap meningkat. Hal ini menunjukkan kemungkinan terjadinya resistensi inisulin. Dengan demikian, efek insulin dalam merangsang pembentukan LPL juga menurun, yang menyebabkan hidrolisis trigliserida dalam kilomikron dan VLDL berkurang dan menimbulkan hipertrigliseridemia (Marks et al.2000).Hipertrigliseridemia merupakan salah satu faktor risiko terjadinya sindrom metabolik (Holt dan Hanley 2007; Kahn et al.2006). Pemberian Asam Valproat pada Kebuntingan Hari ke-11 (embrionik ke-11)
Hari kebuntingan ke-11 (embrionik ke-11) dipilih sebagai salah satu waktu pemberian asam valproat karena masa tersebut adalah masa organogenesis dimana selama periode ini fetus mengalami pertumbuhan dan perkembangan organ sesuai dengan fungsinya.
Hasil pengukuran kadar glukosa darah tikus F1 umur 8 minggu dari induk T11 menunjukkan adanya peningkatan kadar glukosa darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Hasil pengamatan gula darah F1 pada umur 16 minggu dan 24 mingguterlihat ada peningkatan kadar glukosa darah pada kelompokT11 dibandingkan
44
kelompok kontrol normal. Pada kelompok T11, peningkatan kadar glukosa relatif stabil dari umur 8, 16, dan 24 minggu.
Pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T11 pada umur 8 minggu belum menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan dibanding kontrol normal dilihat dari hasil immunohistokimia (Gambar 4.2). Sel-sel yang positif insulin dengan persentase warna cokelat yang hampir sama menunjukkan gambaran sel beta yang masih mampu menghasilkan insulin pada usia tikus F1 umur 8 minggu dengan kemampuan yang sama. Tikus F1 dari induk T11 pada umur 8 minggu dilihat dari parameter kadar glukosa dan histologi pankreas belum menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna jika dibandingkan dengan kontrol normal. Kondisi fisiologi antara tikus F1 yang induknya diberi asam valproat pada masa kebuntingan dengan tikus kontrol normal juga menunjukkan tidak adanya perbedaan yang bermakna jika dilihat kadar glukosa darah. Kondisi ini menunjukkan sel beta pankreas masih cukup secara jumlah dan kemampuan menghasilkan insulin sehingga kadar glukosa darah masih dapat terkontrol.
Kadar insulin tikus F1 dari induk T11 tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna pada umur 16 minggu, tetapi pada tikus F1 umur 24 minggu menunjukkan peningkatan kadar insulin darah dibandingkan kelompok kontrol normal.
Pada pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T11 pada umur 16 minggu menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan dilihat dari hasil immuno reaktivitas sebaran sel beta yang menghasilkan insulin dengan berkurangnya warna cokelat hasil immunohistokimia dibanding kontrol normal (Gambar 4.4.E). Pada pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T11 pada umur 16 minggu menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan dilihat dari hasil immuno reaktivitas sebaran sel alfa yang menghasilkan glukagon dengan tidak berkurangnya warna cokelat pada bagian tepi pulau langerhans hasil immunohistokimia dibanding kontrol normal (Gambar 4.4.F). Gambaran sel kelompok ini sangat mungkin merupakan gambaran yang sangat jelas dari pengaruh penghambatan asam valproat yang sangat berpengaruh pada fungsi sel yangdimasa dewasa.
Gambaran immunohistokimia sel pankreas yang menghasilkan glukagon menunjukkan bahwa pada kelompok T11, sel yang menghasilkan glukagon hanya terdapat pada bagian tepi saja sama dengan kontrol normal (N). Hal ini menunjukkan bahwa pada kelompok T11 kerusakan sel pulau langerhans pankreas terjadi pada sel beta penghasil insulin. Ada kemungkinanperubahan aktivitasHDACdapat mempengaruhifaktor transkripsiatau modifikasihistonekspresi genyang menginduksi(pre) proinsulindalam sekresiinsulin (Larsen et al. 2007).Asam valproat mempengaruhiekspresi genCYP3A4dangen MDR1 (Cervenyet al. 2007).
Pengamatan kadar trigliserida darah tikus F1pada umur 16 minggudari induk yang diberi asam valproat menunjukkan adanya peningkatan. Tetapi pada umur 24 minggu tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna dibanding kelompok kontrol normal (Gambar 5.4).Peningkatan kadar trigliserida darah pada tikus F1 umur 16 minggu dapat terjadi karena tidak efektifnya kerja insulin.Salah satu efek insulin adalah untuk merangsang pembentukan lipoprotein lipase (LPL), suatu enzim yang melekat ke sel endotel kapiler di otot dan jaringan adiposa. Insulin seharusnya merangsang sel adiposa untuk mensintesis dan menyekresikan LPL, yang menghidrolisis trigliserida dalam kilomikron VLDL. Pada kondisi hewan percobaan ini, kadar insulin darah tinggi tetapi kadar glukosa darah tetap meningkat. Hal ini
45 menunjukkan kemungkinan terjadinya resistensi inisulin. Dengan demikian, efek insulin dalam merangsang pembentukan LPL juga menurun, yang menyebabkan hidrolisis trigliserida dalam kilomikron dan VLDL berkurang dan menimbulkan hipertrigliseridemia (Marks et al.2000).
Pemberian Asam Valproat pada Kebuntingan Hari ke-18 (embrionik ke-18) Hari kebuntingan ke-18 (embrionik ke-18) dipilih sebagai salah satu waktu pemberian asam valproat karena masa tersebut adalah periode pertumbuhan dan perkembangan fetus (Fetal growthandDevelopment). Pada periode ini, organ-organ yang telah terbentuk mengalami perkembangan sesuai dengan fungsinya, termasuk perkembangan sel endokrin pankreas.
Hasil pengukuran kadar glukosa darah tikus F1 umur 8 minggu dari induk T18menunjukkan adanya peningkatan kadar glukosa darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Haasil pengamatan gula darah F1 pada umur 16 minggu dan 24 mingguterlihat ada peningkatan kadar glukosa darah pada T18 dibandingkan kelompok kontrol normal.
Pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T18 pada umur 8 minggu belum menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan dibanding kontrol normal dilihat dari hasil immunohistokimia (Gambar 4.2). Sel-sel yang positif insulin dengan persentase warna cokelat yang hampir sama menunjukkan gambaran sel beta yang masih mampu menghasilkan insulin pada usia tikus F1 umur 8 minggu dengan kemampuan yang sama.
Pada tikus F1 umur 16 dan 24 minggu dari induk T18 terjadi penurunan kadar insulin yang signifikan dibandingkan kelompok kontrol normal (gambar 4.3). Penurunan kadar insulin darah yang terjadi signifikan sehingga diprediksi sudah terjadi penurunan sekresi insulin dari sel pankreas.
Pada pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T18 pada umur 16 minggu menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan ditandai dengan berkurangnya sebaran sel beta yang menghasilkan insulin dilihat dari berkurangnya warna cokelat hasil immunohistokimia dibanding kontrol normal (Gambar 4.4.G). Pada pulau langerhans pankreas tikus F1dari induk T18 umur 16 minggu menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan dilihat dari hasil immuno reaktivitas sebaran sel alfa yang menghasilkan glukagon dengan terdapatnya warna cokelat yang menyebar dari tepi sampai bagian tengah pulau langerhans hasil immunohistokimia (Gambar 4.4.H). Perubahan imunoreaktivitas pada sel dan alfa sangat kuat mengindikasikan bahwa pemberian asam valproat pada kebuntingan hari ke-18 berdampak pada kedua sel endokrin pankreas dari F1. Hal ini dapat dipahami mengingat pada hari ke-18 kebuntingan, sel endokrin pankreas sudah berkembang jauh lebih banyak perkembangannya yang dimulai dari hari ke-8,5 kebuntingan (Jorgensen et al. 2007). Kedua sel endokrin pankreas baik sel maupun alfa yang sedang berkembang dan mengalami deferensiasi terpengaruh oleh adanya asam valproat yang mampu bekerja pada histone deacetylase. Pada kondisi ini terjadi penurunan fungsi sel pankreas pulau langerhans pankreas yang menghasilkan insulin.Hasil immunohistokimia sel pankreas yang positif glukagon menyebar dari tepi sampai ke tengah.Hal ini dapat terjadi karena adanya peningkatan jumlah dan penyebaran sel alfa pada pulau langerhans pankreas.Ada kemungkinanperubahan aktivitasHDACdapat
46
mempengaruhifaktor transkripsiatau modifikasihistonekspresi genyang menginduksi(pre) proinsulindalam sekresiinsulin (Larsen et al. 2007).
Hubungan struktur-aktivitas menunjukkan bahwa induksi asam valproat menyebabkan gangguan perkembanganembriosecara in vivo.Sifat teratogenikasam valproat mungkin melibatkanprogramselularyang kompleks danregulasiberbagaikegiatangen.PPAR memainkan peranan utamadalam mekanisme aksi respons seluleruntukasam valproat. PPAR diaktifkan secara selektif oleh asam valproat dimana PPAR merupakan faktor pembatas dalam pengendalian diferensiasi sel (Werling et al. 2001).
Hasil penelitian ini secara keseluruhan menunjukkan pemberian asam valproat di hari ke-9, ke-11 maupun ke-18 pada masa kebuntingan (pasca-trimester pertama) akan mengarah kemunculan diabetes dari tikus F1 yang dihasilkan. Tikus F1 umur 16 dan 24 minggu yang induknya diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-9, ke-11, dan ke-18 (pasca-trimester pertama) terjadi penurunan jumlah sel pankreas.
47 BAB 7