PENGHAMBATAN PERKEMBANGAN SEL β PANKREAS PADA TIKUS DARI INDUK BUNTING YANG DIBERI ASAM VALPROAT
SEBAGAI HEWAN MODEL DIABETES MELLITUS
HADI SUNARYO
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Penghambatan
Perkembangan Sel β Pankreas pada Tikus dari Induk Buntingyang Diberi Asam Valproat sebagai Hewan Model Diabetes Mellitus adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus2014
Hadi Sunaryo
RINGKASAN
HADI SUNARYO. Penghambatan Perkembangan Sel β Pankreas pada Tikus dari Induk Buntingyang Diberi Asam Valproat sebagai Hewan Model Diabetes Mellitus. Dibimbing oleh BAMBANG KIRANADI, ADI WINARTO dan WASMEN MANALU.
Diabetes mellitus
merupakansuatukelompokpenyakitmetabolikdengankarakteristikhiperglikemia yang terjadikarenakelainansekresi insulin, kerja insulin ataukedua-duanya.Diabetes mellitus (DM)tipe 2 diawalidenganadanyakenaikanjumlah
insulin secaraabsolut, yang
berhubungandenganobesitasdankurangnyakegiatanfisik.Biasanyadimulaipadausia
dewasa, bisakarenaadanyafaktorgenetikatautidak.
Kondisiinidiawalidenganresistensi insulin yang
kemudianakandiikutiolehpenurunanjumlahsel β sehinggasekresi insulin
tidakdapatmemenuhikebutuhan.
Penelitian pengembangan obatdanpencegahan diabetesmemerlukan hewan model yang sesuai dengan kondisi diabetes. Hewan model diabetes ada 2 kategori, yaitu tipe model karena genetik dan tipe model karena dapatan yang diperoleh dengan induksi diabetagon, seperti aloksan atau streptozotocin.Hewanmodel yang diperoleh dari seleksi perkawinan dan rekayasa genetik, memerlukan waktu lama serta biaya yang tinggi.Untuk model yang diperoleh dengan induksi diabetagon, kondisi kerusakan sel pankreas ada yang bersifat reversibel dan ada yang kerusakannya permanen.Hewan model yang kerusakan sel pankreasnyasangat parah tidak menggambarkan kejadian diabetestipe 2 yang diinginkan, karena tidak
terjadihiperinsulinemiadanmempunyaikronologi yang
berbedadengankejadianpadaperiodewaktu DM tipe 2.
Obat yang dipakaidalampenelitianiniadalahasamvalproat yang merupakanobatantiepilepsidanantikankerdenganmekanismemenghambat histone deacetylaseberpotensi sebagai obat teratogenik.Pada masa perkembangan embrional asam valproat mempunyai dampak untuk menghambat histone deacetylase (HDAC inhibitor). Hal ini secara in vitrotelah terbukti dengan ditemukannya penekanan diferensiasi sel.
overgicus L) galur Sparague Dawley usia 3-4 bulan dikawinkan dengan program
timemating,dengan memasangkan tikus betina estrus dengan jantan pada satu kandang hingga terjadi perkawinandan dapat ditentukan umur kebuntingannya. Pada tahap ini asam valproatdosis tunggal 250 mg/kg BB tikus per oral diberikan pada induk bunting pada akhir masa kebuntingan untuk mendapatkan anakan tikus yang akan diamati perkembangan sel endokrin pankreasnya. Pengamatan dilakukan pada tikus F1 usia dewasa muda dengan mengambil pankreasnya dan diamati dengan pewarnaan Hemotoksilin Eosin.
Pendekatankedua, mengevaluasiperkembanganselβpankreasdariinduk
yang diberiasamvalproatpadaumurkebuntingan yang
berbeda.Tahapinidiawalidengantime matinguntukmendapatkantikus bunting dengantigawaktupemberianasamvalproat yang berbedapadapascatrimesterpertama, yaituhari ke-9, ke-11, dan ke-18 kebuntingan. Pengamatan yang dilakukanmeliputikadarglukosadarah, konsentrasi insulin darah,danhistologiselendokrinpankreasdenganteknikimmunohistokimiamengguna kanantibodi anti-insulin dan anti-glukagon.
Pendekatanketiga, mengevaluasipeluangtikus F1 dariinduk yang diberiasamvalproatpadaharikebuntingantertentusebagaihewan model diabetes
mellitus tipe
2.Pemberianasamvalproatdilakukandenganwaktuberdasarkanevaluasipadatahapse belumnya. Parameter yang digunakanadalahkadarglukosadarah, insulin darah, dantrigliseridadarah, sertahistologidenganpewarnaanimmunohistokimia antibodi anti-insulin.
Hasilpenelitianinidapatdisimpulkanbahwapenghambatanselendokrinpankre asdapatdilakukandenganpemberianasamvalproatpadamasakebuntinganindukpascat rimesterpertama.Penghambatanperkembanganselβdapatterjadidenganpemberianas amvalproatpadahari ke-9, 11, dan 18 masakebuntingan,
menggambarkandinamikahormon insulin yang
berbeda.Penghambatandiferensiasiselendokrinpankreasdenganmenggunakansubst anteratogenikpadamasaperkembanganembrio (organogenesis) dapatmenjadialternatifdalammendapatkantikus model diabetes mellitus tipe
2.Tikus model yang
didapatmenggambarkankejadianhiperinsulinemiasebelumadanyahiperglikemiapad ausiadewasasepertigambarandiabetus mellitus tipe 2 yang ditemukanpadamanusia. Kata kunci: penghambatandiferensiasisel β, asamvalproatpenghambatsel β,
SUMMARY
HADI SUNARYO. Inhibition of β Cells Pancreas Development in Rats Bornto Mother AdministeredValproicAcidduring Pregnancy asAnimal Models for Diabetes Mellitus.Supervised by BAMBANG KIRANADI, ADI WINARTO andWASMEN MANALU.
Diabetesmellitusisagroupof metabolic diseaseswithcharacteristicof hyperglycemiathat occursdue to abnormalinsulinsecretion, insulin actionor both.Type 2 diabetes ispreceded byan increase intheabsoluteamount of insulin, which isassociatedwithobesityandlack ofphysicalactivity. Usually diabetes mellitus beginsin adulthood, which could bedue togenetic predispositionornot. This conditionbegins withinsulin resistance,which will then befollowedbya decrease inthe number ofβcellinsulinsecretionand thelossof capability of the cells to produce insulin.
Researchon drug developmentand diabetes preventionrequiresan appropriateanimal modelwithdiabetic pathological conditions. There are two categories of diabeticanimalmodelsnamelygenetical predisposition typemodel
anddiabetagonictype model that is induced by
alloxanorstreptozotocin.Productionof
animalmodelsderivedfrommatingselectionandgeneticengineeringrequires longer times and high cost. For diabetagon induced models, the models produced may have reversible damage or total damage of pancreatic endocrine cells.Animalmodels with severe pancreatic cells damage will not show the incidenceof type 2 diabetes mellitus, but type 1 diabetes mellitus.
This study usedvalproic acid as antiepileptic and anticancer drugs. It works as histonedeacetylase inhibitor, which is also known as teratogenic drug. During the embryonic development, valproic acidinhibits histone deacetylase (HDAC inhibitors). In vitro, valproic acid inhibits HDAC activity that eventually suppresses cell differentiation.
Administration ofvalproicacidtopregnantmother ratsduringembryonic developmentperiodis expected toprovide moreinformationabout thepossibility ofinhibitingthedevelopment of thepancreas. It is expected thatthe provision ofvalproic acidina pregnantmothercanaffect the developmentof pancreaticendocrinecellsduringorganogenesis. Based on theperiod
ofembryonicpancreasformation, administration
ofvalproicacidinpregnantmotherwillresult inimpaired developmentof
pancreaticβcellsof F1rats.These F1 rats could be used as animal modelsthathave the pathophysiological condition of diabetes.
The study was conductedin three stagesapproach. The first stage was
designedto studywhether theadministration
one cage until mating occurs. When the mating was occurred, the date of mating was determined the beginning of pregnancy.Atthis stage,a single dose of250 mg/kg BW valproicacidwas given tothe pregnant experimental ratsorallyat theend of pregnancy (day 18)toobtain ratpupsthatwillbe used to observe the development ofpancreaticendocrinecells. Observations were madeonyoungadultF1ratsby takingtheir pancreasorgans andthen were observedwithHemotoksilineosinstaining. The second approach was designed to evaluatethe development
ofpancreaticβcellsofF1 rats born to mother administered valproicacidatdifferentages of gestation. This stage beganwith themating of the experimental rats. The positive pregnant experimental rats were divided into three groups of valproicacid administration based the age of pregnancy i.e., 9th, 11th, and 18thpregnancy. Observationswereconducted on theblood glucose and insulinconcentrationsandpancreaticendocrinecellhistologywithimmunohistochemi caltechniquesusinganti-insulin antibodiesandanti-glucagon.
The third approach was designed to evaluatethe opportunityto produce animalmodel oftype 2 diabetes mellitusby administration of valproicacid to the mother at day 9 of pregnancy.The parameters measured were blood glucose, insulin, and triglycerides concentrations, andhistologyof β cells of pancreas by immunohistochemicalstainingwith anti-insulin antibodies.
The results of the experiment could be concluded that inhibition of pancreatic endocrine cells can be done by administering valproic acid to pregnant mother during thepost first trimester of pregnancy. Inhibition of β cell development in F1 rats could be produced by administration of valproic acid on day 9, 11, and 18 of pregnancy as indicated by different dynamics of insulin secretions. Inhibition of pancreatic endocrine cell differentiation by using teratogenicsubstance during embryonic development (organogenesis) could be used as an alternative technique to produce type 2 diabetes mellitus rat model. The experimental model produced showed hyperinsulinemia syndrome before hyperglycemiasyndrome during adult ages as were occurred in humans.
©HakCiptaMilik IPB, Tahun 2014
HakCiptaDilindungiUndang-Undang
Dilarangmengutipsebagianatauseluruhkaryatulisinitanpamencantumkanataumeny ebutkansumbernya.Pengutipanhanyauntukkepentinganpendidikan, penelitian, penulisankaryailmiah, penyusunanlaporan, penulisankritik, atautinjauansuatumasalah; danpengutipantersebuttidakmerugikankepentingan IPB
Disertasi
sebagaisalahsatusyaratuntukmemperolehgelar Doktor
pada
Program StudiIlmu-ilmuFaaldanKhasiatObat
PENGHAMBATAN PERKEMBANGAN SEL β PANKREAS PADA TIKUS DARI INDUK BUNTING YANG DIBERI ASAM VALPROAT
PADA KEBUNTINGAN SEBAGAI HEWAN MODEL DIABETES MELLITUS
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2014
PENGUJI LUAR KOMISI :
PengujipadaUjianTertutup:
1. Dr. drh. Hera Maheswari, M.Sc., AIF.
(StafPengajarFakultasKedokteranHewan IPB) 2. Dr. drh. KetutMudite, M.Sc., PAVet.
(StafPengajarFakultasKedokteranHewan IPB) Pelaksanaan : 10 Juli 2014
PengujipadaUjian Terbuka:
1. Prof. drh. DondinSajuthi, Ph.D
(Guru BesarFakultasKedokteranHewan IPB) 2. Dr. dra. Retno Sari Andarjati, MS.,Apt
JudulDisertasi:PenghambatanPerkembanganSelβ
PankreaspadaTikusdariIndukBunting yang
DiberiAsamValproatsebagaiHewan Model Diabetes Mellitus Nama :HadiSunaryo
NIM : B161090061
Disetujuioleh KomisiPembimbing
Dr.IrBambangKiranadi, MSc Ketua
Drh. AdiWinarto, Ph.D., PAVet Anggota
Prof.Ir. WasmenManalu, Ph.D. Anggota
Diketahuioleh
Ketua Program Studi IlmuFaaldanKhasiatObat
ProfDrdrh.AgikSuprayogi,MScAgr
DekanSekolahPascasarjana
DrIrDahrulSyah, MScAgr
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian ini ialah Penghambatan Perkembangan Sel β Pankreas pada Tikusdari Induk Buntingyang Diberi Asam Valproat sebagai Hewan Model Diabetes Mellitus.
Penelitiandanpenulisandisertasiinidisusungunamemenuhipersyaratanuntukm emperolehgelardoktorpadaSekolahPascasarjana
IPB.Penelitiandanpenulisandisertasiinitidaklepasdaribimbingandandoronganberba gaipihak,
terutamaKomisiPembimbing.UntukituucapanterimakasihdanhormatsayakepadaBa pak Dr. Ir. BambangKiranadi, M.Sc (KetuaKomisiPembimbing), Bapak Prof. WasmenManalu, M.Sc., PhD.,danDrh. AdiWinarto, PhD., PAVet
(AnggotaKomisiPembimbing) atasdorongan,
arahan,dankerjakerasnyadalammembimbingpenelitiandanpenulisandisertasiini. SayajugamengucapkanterimakasihkepadaDekanSekolahPascasarjana IPB, Sekretaris Program SekolahPascasarjana IPB, Dekan FKH IPB, danKetua Program StudiIlmuFaaldanKhasiatObat IPB atasizindankesempatan yang diberikankepadasayauntukdapatmenempuhstudiPascasarjana di Program StudiIlmuFaaldanKhasiatObat IPB.
Ucapan terima kasih jugapenulis
sampaikankepadakaryawandanpimpinanlaboratorium di FKH IPB, pimpinandanstafdosensertakaryawanFakultasFarmasidanSains UHAMKA
atassegalakemudahan yang
diberikanuntukmembantujalannyapenelitiansehinggadisertasiinidapatselesai.Ungk apan terima kasihdanpenghargaanpenulispersembahkanuntukayahanda, ibunda (Alm),bapakdanibumertua sertaistritercintadananak-anakku (Azzam,Hanif,
Faras,danRizqi) atas dukungandandoa yang
tiadahentiselamapenulismenempuhpendidikan di Pascasarjana IPB. Dengansegalakerendahanhati,
penulismenyadarimasihbanyakkekurangandankelemahandalampenulisandisertasii
ni.Olehkarenaitu, kritikdan saran yang
membangunsangatdiharapkanuntukperbaikandanpenyempurnaandisertasiini.Harap anpenulis,
semogakaryailmiahinidapatbermanfaatbagipengembanganilmupengetahuandanke maslahatanumat.Amin.
Bogor, Agustus 2014
i
ii
BAB 5 PERKEMBANGAN ANAK TIKUS (F1) ASAL INDUK PENERIMA ASAM VALPROAT SEBAGAI MODEL DIABETES MELLITUS33 2.1 Penyebab Kerusakan Sel β pada Patogenesis DM Tipe 2 7 2.2 Anatomi Pankreas 9 2.3 Rumus Bangun Asam Valproat 12 2.4 Skema tahapan HDACs dalam perkembangan sel endokrin pankreas 14 3.1 Gambaran Histologi Pulau Langerhans Pankreas Tikus F1 DenganPewarnaan HE dalam Satu Lapang Pandang 18
3.2 Gambaran Histologi Sel Pankreas Tikus F1 dengan Pewarnaan HE 19 4.1 Rata-rata kadar glukosa darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg BB 24 4.2 Hasil pewarnaan immunohistokimia sel endokrin pankreas positif insulin tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg bb per oral pada umur 8 minggu. 25 4.3 Rata-rata konsentrasi insulin darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg bb per oral 26 4.4 Hasil pewarnaan immunohistokimia sel endokrin pankreas tikus umur 16 minggu dengan Ab anti insulin dan Ab anti glukagon27 5.1 Rata-rata kadar glukosa darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg bb per oral pada minggu ke-8, ke-16 and ke-24. 36 5.2 Hasil pewarnaan immunohistokimia positif insulin sel endokrin pankreas tikus F1 yang induknya diberi asam valproat 37
5.3 Rata-rata konsentrasi insulin darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada minggu ke-16 dan ke-24 38 5.4Rata-rata kadar trigliserida darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada minggu ke-16 dan ke-24 38 6. Populasi pulau Langerhans pankreas tikus F1 dari induk yang diberi
asam valproat dengan perbesaran 4x 57
iii
3.1 Rerata Jumlah Pulau Langerhans Dalam Satu Lapang Pandang 18 3.2 Rerata Jumlah Sel Endokrin Pankreas Tikus F1 yang Induknya Diberi
Asam Valproat Dosis 250 mg/kg BB
4.1 Data perkembangan sel endokrin serta kadar glukosa dan insulin darah anak tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 31
DAFTAR LAMPIRAN
1 Skema Kerja Penelitian 51
2 Kadar Glukosa Darah Tikus F1 Umur 8 Minggu 52
3 Kurva Standart Konsentrasi Insulin 53
4 Data Parameter Darah Tikus (F1) Umur 16minggu 54
5 Data Parameter Darah Tikus (F1) Umur 24minggu 55
6 Jumlah pulau Langerhans dalam lapangpandang perbesaran 4x 56 7 Populasi pulau Langerhans pankreas tikus F1 dari induk yang diberi
asam valproat 57
8 Protokol Penelitian 58
BAB 1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Peningkatan kemakmuran dan perubahan gaya hidup di suatu negara, menyebabkan peningkatan prevalensi penyakit degeneratif, seperti penyakit jantung koroner (PJK), hipertensi, hiperlipidemia, diabetes dan lain-lain. Penelitian epidemiologi di Indonesia menunjukkan dari jumlah penduduk 200 juta orang, penderita diabetes melitus berkisar 1,4% hingga 1,6%. Pada tahun 1994 sekitar 2 sampai 5 juta orang Indonesia menderita diabetes mellitus (DM), 4 juta orang pada tahun 2000 dan 5 juta orang pada tahun 2010. Berdasarkan prevalensi sekitar 1,5% tersebut, maka di tahun 2020 pada saat peningkatan penduduk sebesar 40%, jumlah pasien diabetes akan meningkat sebesar 86% hingga 138% (Soegondoet al.2002).
Kejadian diabetes mellitus pada saat ini banyak dimulai pada usia dewasa dan biasanya ada faktor genetik yang memperkuat dan kondisi ini diawali dengan resistensi insulin yang kemudian akan diikuti oleh penurunan jumlah sel sehingga sekresi insulin tidak dapat memenuhi kebutuhan. Meskipun upaya penelitian dalam satu dekadedilakukan intensif, dasar genetik dalam peristiwa patogenesisdiabetesmasih kurang dipahami.
Untuk melakukan penelitian dan pengembangan obat antidiabetes diperlukan hewan model yang sesuai dengan kondisi diabetes yang ada. Hewan model diabetes ada 2 kategori yaitu tipe diabetes karena genetik dan tipe diabetes karena dapatan yang diperoleh dengan induksi diabetagon seperti aloksan ataupun streptozotocin (Szkudelski2001; Nugroho 2006). Untuk model yang diperoleh dari seleksi perkawinan dan rekayasa genetik tingkat keberhasilan kurang dari 50% dan memerlukan waktu lama serta biaya yang sangat mahal. Sementara itu, untuk model yang diperoleh dengan induksi diabetagon, kondisi kerusakan sel pada pankreas ada yang bersifat reversibel dan ada yang kerusakannya permanen, serta menimbulkan kerusakan sel pankreas yang sangat parah sehingga tidak dapat menggambarkan kejadian diabetes yang diinginkan, karena tidak dihasilkan lagi insulin atau jumlahnya sangat kurang yang lebih identik dengan diabetes tipe 1 (Rees dan Alcolado2005).
Pemberian beberapa obat atau senyawa kimia tertentu pada induk bunting akan berpengaruhpada perkembangan embrio. Kelainan atau anomali organ pada fetus dapat ditemukan seperti jantung tidak bersekat dengan sempurna, hambatan perkembangan sistem saraf pusat, rudimenter organ dan lain-lain. Hal ini dapat terjadi karena kemungkinan faktor luar berpengaruh pada proses proliferasi atau differensiasi sel selama masa perkembangan embrio.
2
Berdasarkan kriteria keamanan obat bagi ibu hamil yang dilansir oleh FDA (Food and Drug Administration) asam valproat termasuk obat kategori C, yaitu golongan obat yang pada studi terhadap sistem reproduksi hewan percobaan menunjukkan adanya efek samping bagi janin. Sementara itu, pada wanita hamil belum ada studi terkontrol. Obat golongan ini hanya dapat dipergunakan jika manfaatnya lebih besar ketimbang risiko yang mungkin terjadi pada janin.
Asam valproat mempunyai dampak untuk menghambat histone deacetylase
(HDAC inhibitor) pada masa embrional. Pada sel kultur asam valproat menyebabkan hiperasetilasi histon. Secara in vitro asam valproat menghambat aktivitas HDAC dengan mengikat pusat katalisis dari HDACs.Akibatnya asam valproat menekan differensiasi sel (Gottlicher et al. 2001). Pada stem cell pada hari ke-9 pemberian asam valproat menyebabkan terjadinya hambatan differensiasi sel pankreas (Jorgensen
et al. 2007).
Pankreas tikus terbentuk pada masa organogenesis dari embrionik hari ke-8.5 sampai ke-14.5, pada periode ini jenis sel pankreas dapat ditentukan dan memiliki pola produk gen berdasarkan DNA dan RNA yang terbentuk untuk sel endokrin pankreas, sel eksokrin, dan faktor transkripsi. Aktivitas enzim eksokrin dan hormon endokrin selama pengembangan pankreas menyebabkan peristiwa transisi regulasi. Pada tikus embrionik hari ke-9.5 sampai ke-11.5terjadi transisi primer terkait dengan penentuan organ dan konversi sel predifferensiasi ke kondisi protodifferensiasi dilihat dari protein tingkat rendah pankreas yang muncul. Transisi sekunder pada tikus embrionik hari ke-14.5 sampai ke-19.5 adalah konversi dari jaringan protodifferensia yakni sel dibedakan dengan peningkatan ukuran dalam pankreas, khususnya sintesis protein dan hilangnya kapasitas proliferasi. Transisi ketiga terjadi setelah kelahiran, yangmenunjukkan adaptasi untuk sintesis bergantungpada penyerapan makanan dan sekresi protein pankreas yang spesifik (Jorgensen et al. 2007).
Penelitian ini dimaksudkan untuk melihat pengaruh asam valproat yang diberikan kepada induk tikus bunting pada perkembangan organ tikus F1 setelah dilahirkan. Diharapkan selama organogenesis pemberian asam valproat dapat mempengaruhi perkembangan sel endokrin. Berdasarkan periode masa pembentukan organ pankreas embrio, pemberian asam valproat pada induk kemungkinanbesardapat menyebabkan gangguan pertumbuhan pankreas, termasuk kerusakan pada sel pankreas tikus (Hogan et al.1994). Oleh karena itu, perlu diteliti kemungkinan penghambatan sel pankreas pada F1 setelah lahir.
Perumusan Masalah
3 sehingga penelitian pembuatan hewan model perlu dilakukan untuk mendapatkan hewan model diabetes yang sesuai dengan kondisi diabetes tipe 2.
Pembentukan pankreas terjadi pada masa embrional yang bila dipengaruhi akan memungkinkan terjadinya penghambatan perkembangan pankreas, sehingga pada saat setelah dilahirkan nanti akan menghasilkan hewan model yang lebih sesuai dengan kondisi diabetes tipe 2 dan tidak perlu dilakukan induksi lagi dengan diabetagon.
Kerusakan sel pankreas dapat terjadi saat dimulainya organogenesis saat fetus mengalami perkembangan di rahim, bersamaan dengan perkembangan neuronal tube sebagai awal perkembangan sel saraf (Kuwabara et al. 2011). Organogenesis pankreas bergantung pada interaksi pensignalan dengan jaringan di sekelilingnya. Inisiasi pertumbuhan organ dan akibat ekspresi marker molekuler pada tahap awal pertumbuhan pankreas selama embriogenesis tikus terjadi mulai dari embrionik hari ke-8,5 sampai hari ke-14,5. Perkembangan saluran cerna ventral, termasuk hati dan pankreas bergantung pada ekspresi endodermal dari homeobox gene Hhex yang mengarahkan proliferasi dari endoderm ventral dan kontrol transisi morfogenetik dari sel endodermal epithelial (Jorgensen et al. 2007).
Tujuan Penelitian
Tujuan Umum
Mendapatkan hewan model diabetes yang mengekspresikan gejala klinis dan patofisilogi diabetes mellitus tipe 2.
Tujuan Khusus
Tujuan khusus penelitian ini adalah :
1. Mengetahui penghambatan perkembangan sel endokrin pankreas dan pulau Langerhan tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada akhir masa kebuntingan.
2. Mengevaluasi perkembangan sel pankreas dari induk yang diberi asam valproat pada umur kebuntingan yang berbeda.
3. Mengevaluasi peluang tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada hari tertentu kebuntingan sebagai hewan model diabetes mellitus tipe 2.
Manfaat Penelitian
1. Keberhasilan pengembangan tikus model diabetus mellitus tipe 2 membuka peluang untuk melakukan penelitian dalam pencegahan kejadian diabetus mellitus tipe 2.
4
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian yang dilakukan adalah pembuatan hewan model diabetes dengan pemberian asam valproat pada induk tikus bunting waktu tertentu sehingga dihasilkan anak tikus (F1) sebagai hewan model diabetes yang lebih sesuai dengan kondisi diabetes saat ini. Pengamatan dilakukan pada anak tikus (F1) dengan parameter kadar glukosa darah, kadar insulin darah dan trigliserida darah serta pengamatan histologi jaringan pankreas untuk melihat perkembangan sel beta dan sel alfa dengan teknik immunohistokimia.
Kebaruan Penelitian (Novelty)
1. Ketersediaan Hewan model diabetes mellitus dengan patofisiologi kejadian diabetes mellitus dengan pendekatan epigenetik.
2. Metoda pengembangan tikus model dengan menggunakan teratogenic substance
Hipotesis
Pemberian Asam valproat pada induk tikus bunting akan menghambat perkembangan sel endokrin pankreas khususnya sel tikus F1, jika diberikan pada masa kebuntingan pasca-trimester pertama sehingga dapat dikembangkan menjadi hewan model diabetes.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
Diabetes Mellitus
Diabetes Mellitus adalah gangguan metabolik kompleks yang ditandai oleh hiperglikemi (peningkatan kadar glukosa darah) yang disebabkan oleh berkurangnya sekresi insulin, aksi insulin atau keduanya. Dua tipe utama diabetes adalah tipe 1 (insulin-dependent diabetes/IDDM), dan tipe 2 (noninsulin-dependent diabetes/NIDDM). Tipe 1 disebabkan oleh autoimmun yang merusak insulin yang diproduksi oleh sel pankreas, sedangkan diabetes tipe β dapat disebabkan oleh dua hal, yaitu penurunan sekresi insulin dan resistensi aksi insulin. Diabetes diasosiasikan dengan kematian prematur, yang dominan disebabkan karena penyakit aterosklerosis pembuluh darah. Komplikasi mikrovaskuler, yang dapat terlihat pada pembuluh kapiler pada mata, ginjal, dan saraf, sehingga dapat menyebabkan kematian (Holt dan Hanley2009).
bahan-5 bahan tersebut apabila terdapat dalam jumlah yang melebihi kebutuhan segera dimobilisasi, dan apabila dibutuhkan bahan-bahan tersebut disintesis. Keseimbangan antara kebutuhan dan ketersediaan disebut sebagai homeostasis metabolik. Terdapat tiga cara utama yang diperlukan untuk integrasi antarjaringan agar homeostasis metabolik dapat tercapai. Pertama, konsentrasi zat gizi atau metabolit dalam darah mempengaruhi kecepatan penggunaan dan penyimpanan zat-zat tersebut dalam jaringan yang berbeda. Kedua, hormon membawa pesan untuk masing-masing jaringan mengenai status fisiologis tubuh dan pasokan atau kebutuhan gizi. Ketiga, sistem saraf pusat menggunakan sinyal saraf untuk mengontrol metabolisme jaringan, secara langsung atau melalui pelepasan hormon (Marks et al.2000).
Insulin adalah hormon anabolik utama yang mendorong penyimpanan zat gizi, penyimpanan glukosa sebagai glikogen di hati dan otot, perubahan glukosa menjadi triasilgliserol di hati dan penyimpanan di jaringan adiposa, serta penyerapan asam amino dan sintesis protein di otot rangka. Hormon ini juga meningkatkan sintesis albumin dan protein darah lainnya oleh hati. Insulin meningkatkan penggunaan glukosa sebagai bahan bakar dengan merangsang transpor glukosa ke dalam otot dan jaringan adiposa. Insulin bekerja menghambat mobilisasi bahan bakar pada saat yang sama. Pelepasan insulin ditentukan terutama oleh kadar glukosa darah, dan kadar tertinggi insulin terjadi sekitar 30-45 menit setelah makan makanan tinggi karbohidrat. Kadar insulin kembali ke tingkat basal seiring dengan penurunan kadar glukosa darah, sekitar 120 menit setelah makan (Marks et al.2000).
Sejumlah faktor di luar konsentrasi glukosa darah dapat mengatur pelepasan insulin. Sekresi insulin ditingkatkan oleh asam amino, rangsangan saraf, dan hormon saluran cerna,sedangkan yang menurunkan sekresi insulin ialah hormon epinefrin. Pulau Langerhans pankreas diinervasi oleh sistem saraf autonom, termasuk cabang nervus vagus, yang membantu mengkoordinasikan pelepasan insulin dengan tindakan makan. Namun, sinyal dari sistem saraf pusat tidak diperlukan untuk sekresi insulin. Asam amino tertentu juga dapat merangsang sekresi insulin, walaupun jumlah insulin yang dilepaskan setelah makan makanan tinggi protein sangat jauh lebih rendah daripada setelah makan makanan tinggi karbohidrat. Polipeptida penghambat lambung, suatu hormon pada saluran pencernaan yang dilepaskan setelah masuknya makanan juga berperan menentukan awal pelepasan insulin. Epinefrin yang disekresikan sebagai respons terhadap puasa, stres, trauma, dan olahraga berat, menurunkan pelepasan insulin. ( Markset al.2000)
Klasifikasi diabetes menurut WHO adalah sebagai berikut : 1. Diabetes tipe 1 (IDDM)
Autoimun yang disebabkan karena peradangan sel insulitis, menyebabkan timbulnya antibodi terhadap sel yang disebutIslet Cell Antibody (ICA) sehingga menyebabkan hancurnya sel . Penyebabnya diantaranya virus cocksakie, rubella,CMVdan herpes.
2. Diabetes tipe 2
Disebabkan karena interaksi antara predisposisi genetik dan faktor lingkungan yang menyebabkan defisiensi insulin dan resistensi insulin atau gabungan keduanya.
3. Diabetes tipe 3 (Secondary diabetes)
6
Penderita diabetes tipe 1, sel pankreas mengalami kerusakan sehingga tidak mampu menghasilkan insulin yang diperlukan. Pada diabetes tipe 2 insulin dihasilkan, tapi tidak bekerja maksimal bisa disebabkan karena kerusakan sel pankreas sehingga tidak mampu mensintesis insulin sesuai kebutuhan atau sekresi insulinnya yang terganggu (Holt dan Hanley2009).
Menurut Holt dan Hanley (2009) diabetes mellitus dapat disebabkan oleh faktor-faktor sebagai berikut :
a. Keturunan (genetik)
Faktor genetik/keturunan biasanya memegang peranan penting pada mayoritas penderita diabetes melitus.
b. Obesitas
Kegemukan pada seseorang pada umumnya dapat menyebabkan gangguan kerja insulin, menjadi faktor risiko yang lazim bagi diabetes melitus tipe II. Obesitas berkaitan dengan resistensi insulin, menyebabkan kemungkinan gangguan toleransi glukosa dan diabetes melitus yang pada akhirnya terjadi pada pasien diabetes melitus tipe II sebagai akibat dari obesitasnya.
c. Faktor lingkungan
Faktor lingkungan yang menyebabkan tercetusnya diabetes melitus adalah gaya hidup kebarat-baratan, seperti restoran siap saji dan penghasilan per-kapita tinggi. d. Faktor demografi
Kenaikan jumlah penderita diabetes melitus, salah satunya dipengaruhi oleh faktor demografi, yaitu jumlah penduduk meningkat, penduduk berumur di atas 40 tahun meningkat, dan adanya urbanisasi.
e. Berkurangnya penyakit infeksi dan kurang gizi
Berkurangnya penyakit infeksi dan kurang gizi diduga ada hubungannya dengan cara hidup yang berubah sesuai dengan bertambahnya kemakmuran yang tercermin dalam pendapatan per-kapita Indonesia sehingga menyebabkan peningkatan penyakit menahun, antara lain diabetes mellitus.
f. Infeksi virus
Faktor ekstrinsik yang mempengaruhi fungsi sel ß pankreas termasuk kerusakan
yang disebabkan oleh virus seperti virus penyebab penyakit gondongan dan
7
Gambar 2.1 Penyebab Kerusakan Sel pada Patogenesis Dε Tipe β (Sumber : Holt dan Hanley 2009).
Hewan Model Diabetes
Diabetes mellitus tipe 2 merupakan kelompok penyakit dengan karakteristik terjadinya resistensi insulin dan gangguan sel δangerhans pankreas dalam mensekresi insulin. Hewan uji DM tipe 2 dapat dibuat dengan beberapa cara, yaitu: pemberian nutrisi yang dapat menstimulasi resistensi insulin, pankreatektomi parsial, pemberian senyawa diabetogenik, ataupun secara genetik. Perlakuan tersebut mengakibatkan terjadinya (1) penurunan respons jaringan perifer terhadap aksi insulin atau malfungsi reseptor insulin, (2) penurunan kemampuan sel δangerhans pankreas dalam mensekresikan insulin. Kedua hal tersebut mengakibatkan peningkatan kadar glukosa darah seperti pada kondisi DM tipe 2. Contoh hewan uji DM tipe 2 adalah tikus Ob/Ob (defisiensi leptin), tikus db/db (defisiensi leptin), tikus Zucker (fa/fa)
obese, tikus Diabetic Torri, tikus gurun obese, mencit tipe C57 BKs db, mencit tipe C57 BL ob, mencit tipe KK dan KKay, tikus tipe Goto-Kakizaki (GK), tikus Nagoya– Shibata–Yasuda (NSY) dan Psammomomys gerbils. Pemberian makanan kaya akan fruktosa pada tikus selama lebih dari 2 bulan akan menginduksi resistensi insulin. Dengan diabetogenik, pemberian senyawa toksik streptozotosin dosis 90 mg/kg BB secara i.p pada tikus neonatal akan menginduksi DM tipe 2 pada usia 6 minggu atau lebih(Nugroho 2006).
Kompensasi obesitas maupun resistensi insulin merupakan tanda-tanda yang dapat mengarah pada kondisi DM tipe 2. Sekresi insulin normal bahkan cenderung meningkat (hiperinsulinemia) pada kondisi tersebut. Kondisi tersebut mengakibatkan desensitisasi reseptor insulin pada tahap postreseptor lebih lanjut mengakibatkan terjadinya resistensi insulin. Tikus Ob/Ob dan tikus Zucker (fa/fa) obese merupakan contoh untuk percobaan dengan kondisi di atas.Pada tikus db/db dan tikus
8
denganhiperglikemia sehingga mengakibatkan sel pankreas dalam mensekresi insulin tidak dapat menangani kondisi hiperglikemia tersebut.
Tikus tipe Goto-Kakizaki (GK), pada kondisi tikus dewasa diperoleh hiperglikemia yang stabil karena berkurangnya sekresi insulin dan juga resistensi insulin. Pada beberapa tikus setelah lahir, mempunyai jumlah pulau Langerhans yang kurang. Beberapa komplikasi yang mirip pada manusia juga dijumpai pada tikus GK dewasa antara lain: terjadi lesi pada ginjal, perubahan struktur saraf perifer, dan abnormalitas retina mata. Mirip dengan tikus GK, tikus Otsuka Long-Evans Tokushima fatty (OLETF) juga mengalami kondisi resistensi,tetapi kondisinya lebih ringan (toleransi glukosa). Kondisi seperti ini cocok untuk percobaan uji aktivitas obat dalam mencegah kondisi diabetes pada tahap toleransi glukosa(Nugroho 2006).
Berdasarkan cara pembuatannya, hewan percobaan diabetes mellitus dibedakan menjadi dua yaitu : (1) terinduksi (induced), misalnya melalui pankreaktomi, senyawa kimia (diabetogenik), dan virus; (2) spontan (spontaneous), misalnya menggunakan tikus BB (bio breeding) atau mencit NOD (non-obese diabetic). Spontaneous animal models mempunyai karakteristik yang relatif sama dengan kondisi diabetes mellitus pada manusia meliputi gejala-gejala penyakit, imunologi, genetik maupun karakteristik klinik lainnya (Nugroho 2006).
Hewan model yang diinduksi dengan diabetogenik umumnya menggunakan aloksan atau streptozotocin untuk merusak sel pankreas. Aloksan digunakan untuk hewan model diabetes tipe 1 (IDDM) dengan dosis 65 mg/kg BB tikus secara intravena, atau 150 mg/kg BB tikus secara intraperitoneal. Streptozotocin (STZ) digunakan untuk menginduksi diabetes tipe 1 (IDDM) dengan dosis 40-60 mg/kg BB tikus secara intraperitoneal. STZ juga digunakan untuk induksi diabetes tipe 2 (NIDDM) dengan dosis 100 mg/kg BB tikus pada tikus neonatal, dan ditunggu pada minggu ke 8-10 setelah diberi STZ akan terjadi hiperglikemia, gangguan respons pada test toleransi glukosa dan hilangnya sensitivitas sel terhadap glukosa(Szkudelski 2001).
Anatomi dan Fisiologi Pankreas
Pankreas merupakan organ panjang dan besar, membentang pada dinding abdomen di belakang lambung, panjangnya 12–15 cm dan berwarna merah muda keabuan. Kepala kelenjar berada di dalam duodenum dan ekornya memanjang sejauh limpa, badan pankreas berada diantara keduanya. Pankreas terdiri atas dua jaringan utama, yaitu acini terdiri dari 98% sel-sel dengan sekresi eksteren, yang memproduksi enzim-enzim cerna yang disalurkan ke duodenum dan pulau Langerhans dengan sekresi interen, yakni hormon-hormon (insulin dan glukagon) yang disalurkan langsung ke aliran darah(Evelyn 2006).
9 Endokrin pankreas pada orang dewasa kira-kira terdiri dari 1 juta pulau Langerhans yang tersebar di seluruh kelenjar pankreas. Pulau Langerhans pankreas merupakan gabungan sel dengan diameter 75–500 µm (Katzung 2002). Walaupun pulau Langerhans mempunyai berat hanya 1–1,5 g dari jaringan pankreas tetapi sekresi endokrinnya mempunyai efek metabolik yang menonjol dan sangat diperlukan untuk kehidupan. Di dalam pulau δangerhans terdapat empat sel utama yaitu sel alfa (α) yang menghasilkan glukagon, sel beta ( ) yang menghasilkan insulin, sel delta ( ) yang menghasilkan somatostatin dan sel PP yang menghasilkan Polipeptida pankreas(Underwood 1999).
Gambar 2.2. Gambar anatomi pankreas. ( Sumber : Agur, Anne M.R. dan Arthur FD. Grant’s Atlas Anatomy 1βth
ed.Wolters Kluwer. Canada.2009. Hlm 135)
Perkembangan Pankreas pada Embrio Manusia
Pertumbuhan kraniokaudal juga berperan penting pada perkembangan saluran cerna,. Kedudukan lambung akan turun pada hari ke-41 dan pada hari ke-50 mencapai letak yang definitif. Terjadi pergeseran lekukan duodenum yang berbentuk huruf C ke arah retroperitoneal, pada saat yang sama lambung makin bergeser ke arah kiri dengan bagian pylorus pada posisi horizontal. Dari bagian duodenum yang menurun dan terletak di sebelah kanan columna vertebralis, muncul kedua kelenjar besar di perut bagian atas, yaitu hati dan pankreas.
10
secara horizontal pada dinding perut dorsal sampai ke limpa. Tidak lama setelah itu (hari ke-28), muncul lagi bakal pankreas ventral, yang menonjol dari dinding duodenum sedikit di bawah ventrikel hati dan ductus biliaris. Karena laju pertumbuhan yang tidak sama di sekeliling dinding usus, bakal ventral bergeser ke arah dorsal dan medial dengan ductus pancreaticus yang kelak bersatu menjadi ductus choledocus bersama ductus biliaris. Akhirnya kedua bakal pankreas menyatu sepenuhnya. Hanya sistem ductus pankreaticus yang masih menandakan asal-usul yang berbeda dari kedua bakal pankreas. Bakal ventral pankreas membentuk bagian belakang processus uncinatus dan bagian akhir ductus pancreaticus, sedangkan bakal dorsal membentuk bagian depan caput pancreatic, corpus dan cauda pancreatic
beserta bagian utama sistem ductus pancreaticus. Ductus pancreaticus accessorius
yang tidak selalu ada berasal dari bakal pankreas dorsal.
Sel-sel tumbuh dari epitel ductus pancreaticuspada minggu ke-9, yang mengambil alih fungsi endokrin dan berdiferensiasi lebih lanjut menjadi pulau-pulau Langerhans. Ketika jaringan pankreas eksokrin pada masa janin tidak mempunyai arti fungsional, organ pulau Langerhans sudah lebih dahulu membentuk hormon. Pada pankreas janin, massa pulau-pulau Langerhans membentuk hampir 5% dari keseluruhan jaringan pankreas (pada orang dewasa 1,5%) dan terutama terdiri atas sel penghasil insulin. Kenyataan ini menunjukkan bahwa insulin dan hormon-hormon terkait (contohnya somatomedin I dan II) memegang peranan pada proses pertumbuhan. Dengan demikian pankreas bersama-sama dengan hati merupakan organ fungsional yang penting untuk metabolisme embrio (Rohen 2003).
Perkembangan Pankreas pada Tikus
Pankreas tikus terbentuk pada tahap awal perkembangan pankreas selama embriogenesis pada masa organogenesis dari hari embrio e8.5-e14.5, di mana semua jenis sel pankreas menjadi ditentukan dan memiliki pola produk gen hormon endokrin pankreas, produk gen eksokrin, dan faktor transkripsi yang sangat penting.
A. Selendokrinpankreas dankompartemen sel eksokrin
Pankreas adalah organ bifungsional terdiri dari jaringan eksokrin dan sel endokrin.Jaringan eksokrin terorganisir dalam asinus yang mengeluarkan zymogens untuk tujuan pencernaan. Saluran sel pankreas ini mendukung fungsi eksokrin karena mengeluarkan bikarbonat untuk netralisasi asam lambung di duodenum. Pulau langerhans ditempati oleh jenis sel endokrin terdiri dari berberapa macamsel endokrin (Jorgensen et al. 2007).
11 Jaringan pankreas berkembang pesat dari struktur kompak sel padat dan tumbuh beberapa kali lipat pada e10.5, membentuk struktur bercabang yang jelas dalam beberapa hari.Secara bersamaan, pola proses epitel Pdx1 dan Nkx6-1 mulai menyimpang, dan sel muncul di pinggiran yang mengekspresikan Pdx1 tetapi tidak Nkx6-1. Pola tersebut menjadi lebih jelas pada e13.5, dan e14.5 Pdx1 membentuk asinus, sedangkan Nkx6-1 menjadi terbatas pada bagian tengah dari epitel,dan di e12.5 usus telah dirotasi dan dua bagian dasar pankreas telah menyatu menjadi satu organ yang saling berhubungan (Jorgensen et al. 2007)..
Bagian endokrin pankreas terdiri dari lima jenis sel yang berbeda, masing-masing ditandai dengan proses yang khas dari salah satu hormon peptida spesifik: glukagon dalam sel α, insulin dalam sel , somatostatin dalam sel , polipeptida pankreas dalam sel PP, atau ghrelin dalam sel . Untuk mensintesis sel yang menghasilkan glukagon dan insulin pada e9.5, untuk somatostatin pada e13.5, dan untuk ghrelin dan PPy pada e10.5 (Jorgensen et al. 2007).
Sel-sel asinar dari karboksipeptidase pankreas memproduksi amilase, kimotripsin, tripsin, ribonuklease, dan lipase yaitu enzim pencernaan yang bertanggung jawab atas degradasi hidrolitik karbohidrat, asam nukleat, protein, dan asam lemak dalam saluran pencernaan. Karboksipeptidase A (CPA) dan elastase dianggap penanda eksokrin awal, sedangkan amilase adalah penandaan produk eksokrin pankreas dari e14.5 pada tikus yang merupakan dasar dalam transisi sekunder(Jorgensen et al. 2007).
B. Penentuan sel endokrin pankreas
Pembentukan sel αterjadi pada e8.75, kemampuan untuk membentuk sel α relatifmenjadi sangat berkurang setelah e14.5.Kontribusi yang signifikan terhadap jumlah akhir sel α berkembang antara e14.5 sampai e16.5 karena merupakan waktu puncak berkembangnya jumlah sel endokrin pankreas tikus (Jorgensen et al. 2007).
Faktor Pax4 dan Arx diidentifikasi sebagai pengatur sifat sel endokrin pankreas. Kehilangan salah satu dari gen atau hilangnya kedua gen tersebut pada tikus tidak berpengaruh terhadap jumlah sel endokrin melainkan mempengaruhi distribusi tipe sel endokrin. Pax4 dan Arxdapat dideteksi dalam pankreas tikus pada awal e9.5 oleh mRNA dalam hibridisasi in situ.Sebagian besar Pax4 pada e18.5 mengaktifkan hormon insulin, dan sebagian mengekspresikan glukagon.Selama embriogenesis, kekurangan Pax4 menyebabkan kehilangan dari sel dan sel .Arx menjadi terbentuk terbatas pada pulau langerhans pada e12.5.Kekurangan Arx menunjukkan peningkatan jumlah sel pada e15.5 serta peningkatan sel pada e18.5 (Jorgensen et al. 2007).
Analisis tentang sel endokrinpankreas pada tikus Pax4/Arx homozigot ganda menunjukkan bahwa kehilangan yang simultan dari kedua gen dapat menyebabkan penurunan onset awal sel α dan sel .Sel α dan sel diganti dengan sel . Pax4 mendukung pembentukan area prekursor sel dan sel dan diperlukan secara khusus untuk pengembangan dari prekursor sel .PPY mengaktifkan jumlah sel yang normal dalam embrio, tetapi setelah lahir induksi PPY terjadi pada cadangan sel sebagai respon terhadap pemberian makanan (Jorgensen et al. 2007).
12
Asam valproat (asam n-dipropilasetat) merupakan asam karboksilat sederhana yang memiliki rantai cabang, dengan rumus bangun :
Gambar 2.3Rumusbangun asam valproat (asam n-dipropilasetat) (Sumber :Gilman 2008)
Asam valproattidak berwarna sampai kuning muda, agak kental, cairan jernih dengan bau khas dan larut dalam air kristal, sangat hidroskopis dengan rasa garam, larut dalam air dan larut dalam alkohol, pKa = 4,8(Gilman 2008).
Farmakokinetik (Katzung 2008)
1. Absorpsi
Asam valproat diabsorpsi dengan cepat setelah pemberian oral dengan bioavailabilitas ≥ 80%. Kadar darah maksimal teramati dalam waktu 1-3 jam,dengan masa paruh 8-10 jam, kadar darah stabil setelah 48 jam terapi. Absorpsi asam valproat lebih lambat beberapa jam, jika obat tersebut diberikan dalam bentuk tablet salut enterik atau diberikan bersamaan waktu makan.
2. Distribusi
Volume distribusi asam valproat sekitar 0,2 liter/kg. Jumlah yang terikat pada protein plasma biasanya 90%, tetapi bagian yang terikat berkurang jika konsentrasi total asam valproat ditingkatkan di atas rentang terapeutiknya.
3. Biotransformasi–Metabolisme
Asam valproat sebagian besar (95%) mengalami metabolisme di hati. εetabolismenya di hati terjadi terutama oleh -oksidasi. Asam valproat merupakan substrat bagi CYP2C9 dan CYP2C19, tetapi metabolisme oleh enzim memberikan eliminasi yang relatif kecil. Waktu paruh asam valproat sekitar 15 jam.
4. Ekskresi
Rata-rata 20% dari obat asam valproat diekskresikan melalui urin dalam waktu 24 jam.
Farmakodinamik(Katzung 2002)
13 membantu dekarboksilase asam glutamat, suatu enzim yang berperan dalam mensintesis GABA (gamma-aminobutyric acid).
Asam valproat pada konsentrasi sangat tinggi menghambat GABA-T dalam otak, sehingga meningkatkan kadar GABA dengan menghambat konversi GABA menjadi suksinik semi aldehid.Asam valproate pada dosis yang relatif rendah untuk menghilangkan kejang pentilenatetrazol, kadar GABA dalam otak tetap tidak berubah. Asam valproat menghasilkan reduksi pada kadar aspartat di dalam otak hewan pengerat.
Asam valproat pada konsentrasi tinggi, dapat meningkatkan daya hantar kalium membran.Pada konsentrasi rendah akan menimbulkan hiperpolarisasi neuron. Penemuan ini menimbulkan spekulasi bahwa asam valproat bekerja langsung pada saluran kalium membran. Asam valproat bekerja dengan spektrum luas melalui beberapa mekanisme molekuler.
Penggunaan Terapeutik
Asam valproat efektif dalam penanganan absens epilepsi, epilepsi mioklonik, epilepsi parsial dan epilepsi tonik-klonik. Dosis awal biasanya 15 mg/kg BB, dan ditingkatkan tiap interval seminggu 5-10 mg/kg BB sehari sampai dosis maksimum 60 mg/kg BB. Dosis terbagi harus diberikan jika dosis total sehari melebihi 250 mg/kg BB (Goodman dan Gilman 2008).
Inhibitor Histone Deacetylase
14
15
BAB 3
EFEK PEMBERIAN ASAM VALPROAT PADA INDUK TIKUS BUNTING (Rattus norvegicus L.) PADA SEL ENDOKRIN PANKREAS ANAKAN TIKUS
Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian asam valproat pada sel endokrin pankreas anakan tikus. Induk tikus bunting dikelompokkan menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol normal (A) dan kelompok B yang diberi asam valproat dosis tunggal 250 mg/kg BB secara oral pada hari kebuntingan ke-18. Anakan tikus (F1) diamati perkembangannya dan dievaluasi pankreasnya diambil dalam keadaan teranestesi untuk dilakukan pengamatan histologi dengan pewarnaan hemotoksilin eosin. Hasilnya pada tikus F1umur 8 dan 16 minggu histologi pankreas menunjukkan anak tikus (F1) dari kelompok yang induknya diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-18 jumlah populasi pulau Langerhans tidak ada perbedaan yang bermakna dibanding kontrol normal (p>0,05). Sedangkan jumlah sel endokrin pankreas terjadi perbedaan yang bermakna dibanding kontrol normal (p<0,05). Dapat disimpulkan bahwa pemberian asam valproat pada masa induk tikus bunting mengindikasikan adanya penghambatan perkembangan sel endokrin pankreas dari tikus F1.
Kata kunci :asam valproat, sel endokrin pankreas, penghambatan sel endokrin
The Effectof Valproic Acid Administration of The Pregnant Rat (Rattus norvegicus L.) onPancreatic Endocrine Cells Developmentof Tillers Rat
Abstract
The aim of this research was to inhibit the growth and development of pancreatic endokrin cells of the offspring (F1) of rat treated with valproic acid doing the pregnancy. The pregnant females were divided into 2 groups, control normal (A) andB were treated with a single dose of valproic acid 250 mg/kg BW oraly at day 18th of pregnancy. The delivered litters (F1) at the same time, pancreatic tissues were collected under deep anastetion for histological study. The histologicalresult at the age of 8 and 16 weeks finding of litters (F1) of B showed nochange of islet langerhans population (p>0.05), of the endocrine cells pancreasshowed change (p<0.05). It can be concluded that treating valproic acid at pregnancy periode strongly indicate the inhibition of pancreatic endocrine cells function of its offspring (F1).
16
Pendahuluan
Teratogenik adalah sifat bahan yang dapat menghasilkan kecacatan tubuh pada kelahiran.Dalam istilah medis,teratogenik berarti terjadinya perkembangan tidak normal dari sel selama kehamilan yang menyebabkan kerusakan pada embrio sehinggapembentukanorgan-organberlangsung tidak sempurna atau terjadi cacat lahir(Loomis 1989).
Aksi suatu zat yang berakibat pada kecacatan selama kebuntingan berhubungan erat dengan perkembangan fetus. Perkembangan fetus dibagi menjadi blastogenesis, organogenesis, histogenesis,dan pematangan fungsional. Pada organogenesis, terjadi proses pembentukan organ sehingga zat teratogen akan menyebabkan malformasi organ, jenis malformasi bergantung pada jenis teratogen. Histogenesis dan pematangan fungsionalbergantung pada suplai nutrisi dan diatur berbagai sistem hormon.Kerusakan sel pankreas dapat terjadi sejak dimulai organogenesis di rahim, bersamaan dengan perkembangan neuronal tube sebagai awal perkembangan sel saraf (Kuwabara et al. 2011).
Tahapan permulaan organogenesis pankreas bergantung pada interaksi pensignalan dengan jaringan di sekelilingnya. Inisiasi pertumbuhan organ dan akibat ekspresi marker molekuler pada tahap awal pertumbuhan pankreas terjadi selama embriogenesis tikus dari hari ke-8,5embrioniksampai hari ke-14,5. Perkembangan saluran cerna ventral, termasuk liver dan pankreas ventral, bergantung pada ekspresi endodermal homeobox gene Hhex yang mengarahkan proliferasi endoderm ventral dan kontrol transisi morfogenetik sel endodermal epithelial (Jorgensen et al. 2007).
Wanita yang sedang hamil tidak selalu bebas dari penyakit, sehingga penggunaan obat tertentu terkadang menjadi suatu keharusan. Seperti pada wanita hamil yang mengalami gangguan atau penyakit susunan saraf pusat, seperti epilepsi.Penelitian retrospektifpada wanita hamil pengidap epilepsi yang mengkonsumsi obat asam valproat dapat menyebabkan cacat tuba neuralis dan jantung, cacat kraniofasial, dan tungkai (Sadler 2000). Berdasarkan kriteria keamanan obat bagi ibu hamil yang dilansir oleh FDA (Food and Drug Administration) asam valproat termasuk obat kategori C, yaitu golongan obat yang pada studi terhadap sistem reproduksi hewan percobaan menunjukkan adanya efek samping bagi janin. Pada wanita hamil belum ada studi terkontrol. Obat golongan ini hanya dapat dipergunakan jika manfaatnya lebih besar ketimbang risiko yang mungkin terjadi pada janin.
Pada masa embrional, asam valproat mempunyai kemampuan untuk menghambat histone deacetylase (HDAC inhibitor). Asam valproat menyebabkan hiperasetilasi histon pada sel kultur. Secara in vitro asam valproat menghambat aktivitas HDAC dengan mengikat pusat katalisis dari HDACs dan akibatnya asam valproat menekan differensiasi sel (Christensenet al.2011). Pada stem cell pemberian asam valproat di hari ke-9 terjadi hambatan pada pengarahan differensiasi sel pankreas (Gottlicher et al. 2001).
Secara umum, target kerja sifat teratogenik derivat asam valproatialah
17 sementara spesies lain mungkin tahan terhadap efek ini.Mekanismenya melibatkan reseptor-dependent, dengan pendekatan gen silencing(Peraza et al. 2006).
Dalam penelitian ini asam valproat diberikan pada pasca-trimester pertama tikus bunting, karena pada masa ini merupakan masa perkembanganpematangan dan pertumbuhan penyempurnaanfetus. Pengaruh buruk senyawa asing padafetus pada fase ini tidak berupamalformasi anatomik lagi, tetapi dapat berupa gangguan pertumbuhan terhadap fungsi-fungsi fisiologik atau biokimiawi organ. Apabila padapasca-trimester pertama atau masa Fetal Growth and Development tikus diberikan asam valproat maka pada prinsipnyaefeknyadismorfogenesis (Sadler 2000).
Bahan dan Metode
Bahan yang digunakan: asam valproat, etanol 70%, larutan NaCl, aqua dest, formalin 10%, ketamin, pewarnaHemotoksilin Eosin (HE), dan tikus putih (Rattus norvegicus L.) galur Sprague dawley.
Hewan yang digunakan adalah tikus putih betina. Sebelum melakukan pengujian hewan diaklimatisasi selama 2 minggu dan diberi makan, minum ad libitum. Penetapan dosis didasarkan padaperhitungan kesetaraan antara manusia (70 kg) ke tikus (200 g) maka diperoleh dosis pemberian untuk tikus adalah dosis 250 mg/kg BB.Dosis ini didapat berdasarkan orientasi dosis yang dilakukan sebelumnya.
Pengawinan hewan dilakukan pada masa estrus dengan memasukkan seekor tikus jantan ke kandang yang berisi seekor tikus betina pada sore hari. Keesokan paginya dilakukan pengamatan di daerah vagina, jika ditemukan sumbat vagina
(vagina plug)maka tikus dinyatakan kawin, dilanjutkan dengan membuat apusan vagina.Apusan vagina dibuat dengan cara mengusapkan cottun bat dibagian vagina tikus betina, kemudian ditoreskan pada kaca objek dan diberikan cairan NaCl fisiologi. Sediaan diamatidenganmikroskop dengan pembesaran 40 x. Tikus dinyatakan kawin apabila ditemukan sperma dalam apusan vaginanya. Tikus yang terbukti kawin dinyatakan sebagai hari ke-0 dari kehamilan.
Asam valproat diberikan secara oral pada induk tikus bunting hari ke-18. Tikus percobaan dibagi menjadi 2 kelompok dengan masing-masing kelompok terdiri atas6 tikus betina. Kelompok A merupakan kontrol normal yang diberikan aquadest. Kelompok B adalah kelompokyang diberikan dosis tunggal asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada kebuntingan hari ke-18.
Pembedahan dilakukan pada saat anak tikus berumur 8 dan 16 minggu. Pada pengujian ini tikus dianastesi dengan menggunakan ketamin secara intra peritoneal. Tikus diletakkan di atas papan bedah dengan posisi ventral menghadap peneliti. Bagian perut tikus dibedah dengan gunting, organ dikeluarkan dan disimpan pada vial berisi buffer formalin 10%.Pembuatan preparat histologi dilakukan dengan menggunakan metode pewarnaan Hemotoksilin Eosin (HE).
Pankreas yang telah dipisahkan dimasukkan ke dalam cairan formalin 10%, kemudian dibuat preparat histologi dengan pewarnaan HE. Prosedur pembuatan preparat histologi adalah sebagai berikut: fiksasi, dehidrasi, pembeningan, infiltrasi dan penanaman(embedding), pemotongan, penempelan, dan pewarnaan.
18
telah tercapai, kemudian preparat dicelup dengan destilasi water (DW) selama 5 menit. Dilanjutkan dengan pewarnaan sitoplasma sel dengan eosin 5 menit dengan cara meneteskan larutan eosin diatas sayatan organ, lalu dibilas dalam DW selama beberapa detik dan dilanjutkan dengan pengontrolan di bawah mikroskop untuk melihat hasil pewarnaan eosin. Dicuci dengan air kemudiandidehidrasi, clearing, mounting, kemudian preparat diberi 1 tetes entelan danobjek glass ditutup.
Pengamatanmikroskopikdilakukan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 4x untuk melihat populasi dan menghitung jumlah rata-rata pulau Langerhans dalam satu lapang pandang. Mikroskop dengan perbesaran 40 x untuk pemeriksaan dan menghitung rata-rata jumlah sel pankreas dari 4 pulau Langerhans dalam setiap preparat. Data kuantitatif rata-rata jumlah pulau Langerhans dan sel endokrin pankreas anakan tikusdianalisis secara statistik menggunakan ANOVA satu arah.
Hasil
Tabel 3.1 Rerata Jumlah Pulau Langerhans Dalam Satu Lapang Pandang Kelompok Rata-rata Jumlah Pulau
Langerhans umur 8 minggu (dalam satu lapang pandang)
Rata-rata Jumlah Pulau Langerhans umur 16 minggu (dalam satu lapang pandang)
A 5.2+0.83 5+0.71
B 4.6+0.55 4.8+0.84
Tidak berbeda bermakna p>0,05 (Uji Anova satu arah).
A : Kontrol normal. B: kelompok yang diberikan asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada kebuntingan hari ke-18.
Gambar 3.1 Gambaran Histologi Pulau Langerhans Pankreas Tikus F1 dengan Pewarnaan Hemotoksilin-Eosin Dalam Satu Lapang Pandang. Jumlah pulau Langerhans tidak berbeda.
19
Tabel 3.2 Rerata Jumlah Sel Endokrin Pankreas Tikus F1 yang Induknya Diberi Asam Valproat dosis 250 mg/kg BB.
Kelompok Tikus
Jumlah Sel Umur 8minggu
Jumlah sel Umur 16minggu
1 90 100
A 2 120 119
3 110 109
Rerata 106,66+15,27 109,33+9,50
1 64 100
B 2 65 86
3 84 61
Rerata 71+11,26* 82,33+19,75*
(*) menunjukkan ada perbedaan bermakna jumlah sel endokrin menurun p<0,05 (uji anova satu arah). A : Kontrol normal. B:kelompok yang diberikan asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada kebuntingan hari ke-18.
Gambar 3.2 Gambaran Histologi Sel Pankreas Tikus F1 dengan Pewarnaan Hemotoksilin-Eosin. A. Kelompok kontrol normal. B. Kelompok yang induknya diberi asam valproat dosis 250 mg/kg BB pada kebuntingan hari ke-18 umur 8minggu.C.. Kelompok yang induknya diberi asam valproat dosis 250 mg/kg BB pada kebuntingan hari ke-18 umur 16minggu.
Pembahasan
Rata-rata jumlah pulau Langerhans (Tabel 3.1) yang diperoleh, dianalisis secara statistik. Uji normalitas dengan menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui apakah populasi data terdistribusi normal atau tidak. Uji homogenitas menggunakan uji Levene untuk mengetahui apakah varian populasi homogen atau tidak. Uji Anova satu arah digunakan untuk mengetahui apakah rata-rata adalah sama atau berbeda bermakna.
20
tidak berbeda bermakna. Sehingga dapat dikatakan pemberian asam valproat dosis 250 mg/kg BB padakebuntingan hari ke-18 tidak menyebabkan perubahan jumlah populasi pulau Langerhans (Gambar 3.1)
Rata-rata jumlah sel endokrin pankreas (Tabel 3.2) yang diperoleh, dianalisis secara statistik. Uji normalitas dengan menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui apakah populasi data terdistribusi normal atau tidak. Uji homogenitas menggunakan uji Levene untuk mengetahui apakah varian populasi homogen atau tidak. Uji Anova satu arah digunakan untuk mengetahui apakah rata-rata adalah sama atau berbeda bermakna dan dilanjutkan dengan menggunakan uji Tukeyuntuk melihat perbedaan bermakna antar tiap kelompok perlakuan.
Hasil penelitian dianalisis secara statistik, diperoleh hasil uji Kolmogorov-Smirnovmenunjukkan bahwa p>0,05 dan hasil uji Levene menunjukkan bahwap>0,05, artinya data terdistribusi normal dan homogen.Analisis dilanjutkan dengan metode Anova satu arah dan hasil yang didapat (p=0,000) menunjukkan bahwa (p<0,05) dannilai rata-rata mempunyai perbedaan bermakna antarkelompok perlakuan. Selanjutnya dilakukan analisa Tukey untuk melihat perbedaan yang bermakna dengan taraf signifikansi 5% antara kelompok normal (A)dan kelompok B yaitu tikus F1 yang induknya diberi asam valproat 250 mg/kg BB pada kebuntingan hari ke-18.
Pada tikus F1 umur 8 minggu,kelompok tikus yang induknya diberi perlakuan dengan asam valproat dosis 250 mg/kg BBberbeda bermakna dengan kontrol normalterjadi penurunan jumlah sel endokrinnya.Pada tikus F1 umur 16 minggu kelompok tikus yang induknya diberi perlakuan dengan asam valproat 250 mg/kg BB pada kebuntingan hari ke-18 berbeda bermakna dengan kontrol normal terjadi penurunan jumlah sel endokrinnya.
Penelitian ini menunjukkan pemberian asam valproat pada kebuntingan hari ke-18 dengan dosis tunggal250 mg/kg BB dapat menyebabkan penurunan jumlah sel endokrin pankreas anakan tikus, tetapi tidak mempengaruhi jumlah populasi pulau Langerhans pada tikus F1 yang induknya diberi asam valproat.Hubungan struktur-aktivitas menunjukkan bahwa induksi asam valproat menyebabkan gangguan perkembanganembriosecara in vivo pada masa pematangan fungsional.Sifat teratogenikasam valproat mungkin melibatkanprogramselularyang kompleks danregulasiberbagaikegiatangen.PPAR memainkan peranan utamadalam mekanisme aksi respons seluleruntukasam valproat. PPAR diaktifkan secara selektif oleh asam valproat dimana PPAR merupakan faktor pembatas dalam pengendalian diferensiasi sel (Werling et al.2001).Ada kemungkinanperubahan aktivitasHDACdapat mempengaruhifaktor transkripsiatau modifikasihistonekspresi genyang menginduksi(pre) proinsulindalam sekresiinsulin (Larsen et al. 2007).
Simpulan
21
BAB 4
PENGHAMBATAN PERKEMBANGAN SEL β PANKREAS ANAKAN TIKUS DARI INDUK YANG MENERIMA ASAM VALPROAT PADA
KEBUNTINGAN PASCA-TRIMESTER SATU
Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya penghambatan fungsi sel pankreas tikus F1 dari induk tikus bunting yang diberi asam valproat. Induk tikus bunting dikelompokkan menjadi 3, berdasarkan waktu pemberian asam valproat dosis tunggal (250 mg/kg BB) secara oral pada hari kebuntingan ke-9 (T9), ke-11(T11), dan ke-18 (T18). Anakan tikus (F1) diamati perkembangannya dan dievaluasi kadar glukosa darah dan hormon insulin darah pada umur 8, 16, dan 24 minggu. Pada waktu yang sama pankreas diambil dalam keadaan teranestesi untuk dilakukan pengamatan immunohistologi. Hasilnya pada umur 8 minggu kadar glukosa darah dan histologi pankreas menunjukkan anak tikus (F1) dari semua kelompok induk perlakuan tidak menunjukkan adanya perubahan. Pada tikus (F1) umur 16 dan 24 minggu pada kelompok T9 dan T11 terindikasi adanya peningkatan kadar glukosa darah dan insulin darah. Pada T18 yang meningkat hanya kadar glukosa darah, sedangkan konsentrasi insulin darah mengalami penurunan. Pada tikus (F1) dari T9, T11, dan T18 sel yang positif insulin mengalami penurunan, sedangkan sel yang positif glukagon hanya pada tikus (F1) dari T18 yang mengalami peningkatan hasil immunohistokimia. Dapat disimpulkan bahwa pemberian asam valproat pada masa induk tikus bunting mengindikasikan adanya penghambatan fungsi sel pankreas dari tikus F1.
Kata kunci : Panghambatan differensiasi sel , asam valproat, disfungsi sel .
The Inhibition of Pancreatic β Cells Development in Rats Born to Mother Treated
with Valproic Acid at Post-First Trimester of Pregnancy
Abstract
22
glucagon positive cells only found on offspring (F1) of T18. It can be concluded that treating valproic acid at pregnancy periode strongly indicate an inhibition of pancreatic
cells function of its offspring (F1).
Keyword: Inhibition of cells differentiation, valproic acid, disfunction of cells Pendahuluan
Perkembangan awal embrio tikus berawal dari pembuahan sel telur oleh spermatozoa di bagian ampula dari oviduk dan membentuk zigot. Kemudian akan diikuti oleh proses pembelahan yang terjadi secara lambat di sepanjang ovidukbagian tuba falopi sampai di tempat terjadinya implantasi 4,5 hari setelah pembuahan.Bentuk morula kompak dicapai kira-kira 12 jam setelah pembelahan ketiga. Setelah bentuk morula tercapai embrio mulai memasuki tanduk rahim lewat hubungan utero-tubal
junction. Di daerah ini embrio mulai membentuk blastosis, kemudian akan mengalami implantasi pada dinding tanduk rahim (Hogan et al.1994). Pada embrionik hari ke-5 sampai ke-6,5 masa implantasi. Embrionik hari ke-6,5 mulai terjadi gastrulasi dan dilanjutkan masa awal organogenesis (early organogenesis) sampai hari ke-10. Embrionik hari ke-10 sampai ke-14 adalah masa organogenesis. Dilanjutkan masa pertumbuhan fetus dan perkembangan (fetal growth and development) embrionik hari ke-14 sampai ke-19.
Pankreas tikus terbentuk pada masa organogenesis dari kebuntingan (embrionik) hari ke-8.5 sampai ke-14.5. Pada periode ini jenis sel pankreas dapat ditentukan dan memiliki pola produk gen berdasarkan DNA dan RNA yang terbentuk untuk sel endokrin pankreas, sel eksokrin, dan faktor transkripsi. Aktivitas enzim eksokrin dan hormon endokrin selama pengembangan pankreas menyebabkan peristiwa transisi regulasi. Pada tikus embrionik hari ke-9.5 sampai ke-11.5terjadi transisi primer terkait dengan penentuan organ dan konversi sel predifferensiasi ke kondisi protodifferensiasi dilihat dari protein tingkat rendah pankreas yang muncul. Transisi sekunder pada tikus embrionik hari ke-14.5 sampai ke-19.5 adalah konversi dari jaringan protodifferensia yakni sel dibedakan dengan peningkatan ukuran dalam pankreas, khususnya sintesis protein dan hilangnya kapasitas proliferasi. Transisi ketiga terjadi setelah kelahiran, menunjukkan adaptasi untuk sintesis bergantungpada penyerapan makanan dan sekresi protein pankreas yang spesifik (Jorgensen et al.
2007).
Kerusakan sel pankreas dapat terjadi saat dimulainya organogenesis saat fetus mengalami perkembangan di rahim, bersamaan dengan perkembangan neuronal tube sebagai awal perkembangan sel saraf (Kuwabara et al. 2011). Organogenesis pankreas bergantung pada interaksi pensignalan dengan jaringan di sekelilingnya. Inisiasi pertumbuhan organ dan akibat ekspresi marker molekuler pada tahap awal pertumbuhan pankreas selama embriogenesis tikus terjadi dari embrionik hari ke-8,5 sampai hari ke-14,5. Perkembangan saluran cerna ventral termasuk hati dan pankreas bergantung pada ekspresi endodermal dari homeobox gene Hhex yang mengarahkan proliferasi dari endoderm ventral dan kontrol transisi morfogenetik dari sel endodermal epithelial (Jorgensen et al. 2007).
23 perkembangan sistem saraf pusat, rudimenter organ dan lain-lain. Hal ini dapat terjadi karena kemungkinan faktor luar berpengaruh pada proses proliferasi atau differensiasi sel selama masa perkembangan embrio.
Berdasarkan kriteria keamanan obat bagi ibu hamil yang dilansir oleh FDA (Food and Drug Administration) asam valproat termasuk obat kategori C, yaitu golongan obat yang pada studi terhadap sistem reproduksi hewan percobaan menunjukkan adanya efek samping bagi janin,sedangkan pada wanita hamil belum ada studi terkontrol. Obat golongan ini hanya dapat dipergunakan jika manfaatnya lebih besar ketimbang risiko yang mungkin terjadi pada janin.
Pada masa embrional asam valproat mempunyai dampak untuk menghambat
histone deacetylase (HDAC inhibitor). Asam valproat menyebabkan hiperasetilasi histon pada sel kultur. Secara in vitro asam valproat menghambat aktivitas HDAC dengan mengikat pusat katalisis dari HDACs, akibatnya asam valproat menekan differensiasi sel. Pada perlakuan dengan asam valproat di hari ke-9stem cell terjadi hambatan differensiasi sel pankreas(Gottlicher et al. 2001).
Penelitian ini dimaksudkan untuk melihat pengaruh asam valproat yang diberikan kepada induk tikus bunting terhadap perkembangan organ tikus F1 setelah dilahirkan. Diharapkan pemberian asam valproat pada induk bunting dapat mempengaruhi perkembangan organ saat organogenesis terjadi. Berdasarkanperiode masa pembentukan organ pankreas embrio, pemberian asam valproat pada induk besar kemungkinan menyebabkangangguan pertumbuhan pankreas pada tikus termasuk kerusakan pada sel pankreas tikus (Hoganet al. 1994). Oleh karena itu perlu diinvestigasi kemungkinan penghambatan sel pankreas pada F1 setelah lahir (post natal).
Obat yang dipakai dalam penelitian ini adalah asam valproat yang merupakan obat antiepilepsi dan antikanker yang berpotensi menghambat histone deacetylase(Christensenet al. 2011). Pemberian asam valproat kepada induk di beberapa titik di dalam periode perkembangan pankreas embrio diharapkan dapat informasi lebih dalam tentang kemungkinan terjadinya penghambatan perkembangan organ pankreas
Bahan dan Metode
24
minum ad libitum. Proses kelahiran dan pemeliharaan anak dilakukan oleh induk masing-masing hingga anak umur sapih.
Evaluasi perkembangan sel endokrin pankreas tikus F1 dari semua kelompok induk perlakuan dilakukan dengan membandingkan dengan kelompok kontrol. Waktu evaluasi dilakukan pada umur 8. 16 dan 24 minggu. Parameter yang diamati dari sampel darah meliputi kadar glukosa darah dan kadar hormon insulin darah. Parameter lain adalah perubahan immunoreaktivitas sel dan sel α dari sampel jaringan pankreas. Pengambilan sampel darah dan jaringan pankreas dilakukan dalam kondisi teranestesi dengan menggunakan kombinasi ketamin 5 mg/100 g BB dan xylazin 1 mg/100 g BB secara intraperitoneal.
Hasil
Hasil pengukuran kadar glukosa darah tikus F1 umur 8 minggu dari induk T9 menunjukkan adanya nilai kadar glukosa yang tidak berbeda jika dibandingkan dengan nilai kontrol normal (70 mg/dL). Pada umur yang sama tikus F1 kelompok T11 (90 mg/dL) dan T18 (100 mg/dL) menunjukkan adanya peningkatan kadar glukosa darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Hasil pengamatan gula darah F1 pada umur 16 minggu dan 24 mingguterlihat ada peningkatan kadar glukosa darah pada semua kelompok baik T9, T11, dan T18 dibandingkan kelompok kontrol normal (Gambar 4.1).
