Potensi Bakteri A. rhizogenes untuk Peningkatan Perakaran Bibit Manggis
Hasil penelitian yang telah dilaksanakan menunjukkan bahwa bakteri
A. rhizogenes yang dapat menginokulasi akar bibit tanaman manggis mampu meningkatkan perakaran dan pertumbuhan tajuk bibit manggis. Peningkatan perakaran ditandai dengan meningkatnya panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan jumlah akar tersier. Sedangkan peningkatan pertumbuhan tajuk bibit manggis ditandai dengan meningkatnya diameter batang, tinggi tanaman dan jumlah daun. Adanya peningkatan perakaran dan pertumbuhan tajuk bibit manggis ini disebabkan karena tertransfernya sebagian DNA (T-DNA) dari
Agrobacterium ke dalam sel tanaman.
Fragmen DNA yang ditransfer ke dalam sel tanaman merupakan daerah TR dan TL-DNA. Plasmid Ri yang terdapat pada A. rhizogenes
mempunyai satu atau dua macam T-DNA yaitu left T-DNA (TL-DNA) dan right T-DNA (TR-T-DNA). Berbeda dengan TL-T-DNA, TR-T-DNA mempunyai persamaan
dengan T-DNA A. tumefaciens. TR-DNA mengandung dua gen sintesis
manopin (mas 1 dan mas2) dan satu gen sintesis agropin (ags). Selain itu TR-DNA juga terdapat gen yang membentuk auksin yaitu IaaM dan IaaH. IaaM menyandi pembentukan triptofan 2 monooksigenase yang akan mengkatalisis perubahan L-triptofan menjadi senyawa indol-3-asetamida. Sedangkan IaaH menyandi enzim amino hidrolase yang mengubah indol-3-asetamida menjadi asam indol-3-asetat (IAA) (Jeng-seng 2001). Sedangkan TL-DNA mengandung gen-gen rol (root loci) yaitu : rolA, rolB, rolC dan rolD yang berperan dalam menginduksi akar rambut, rolA, rolB, rolC dan rolD ini merupakan open reading frame (ORF) dari TL-DNA yang ditransfer dan diekspresikan bersama-sama (Chriqui 1996). Gen rolA berfungsi untuk mereduksi kandungan asam giberelin, gen rolB mengkode ß–glukosidase yang menghidrolisa indol ß-glukosida, yang berfungsi untuk melepas IAA dalam tanaman dari indol-3-asetil ß-glukosidase yang tidak aktif dan menaikkan konsentrasi IAA intraseluler. Gen rolB merupakan kunci utama untuk induksi akar rambut. White et al. (1985) juga melakukan pengujian pada empat gen rolA, rolB, rolC dan rolD, hasil pengujian menunjukkan bahwa protein produk dari berbagai gen rol tersebut berperan
dalam meningkatkan sensivitas sel tanaman terhadap adanya auksin. Selain itu produk gen rol juga diduga mendorong tanaman inang untuk mensintesis auksin sehingga mengakibatkan terjadinya pembentukan akar.
Pemanfaatan A. rhizogenes telah berhasil untuk meningkatkan perakaran pada tanaman buah-buahan, seperti pada kiwi (Rugini et al., 1991), apel (Sutter & Luza 1993; Damiano & Monticelli 1998), almond (Damiano et al., 1995), walnut (Caboni et al. 1996) dan pada beberapa tanaman tahunan berkayu, seperti pada pinus (McAfee et al. 1993; Li & Leung 2001), Larix (McAfee et al. 1993) dan Eucalyptus (MacRae & Staden 1993). Dari hasil penelitian tersebut dilaporkan bahwa kemampuan berakar, jumlah akar, dan massa akar meningkat jika T-DNA dapat tertransfer dan terintegrasi dalam genom tanaman. Berbagai gen pada T-DNA yang ditransfer dan terintegrasi dalam genom tanaman, akan terekspresi di dalam sel sehingga mengakibatkan terjadinya produksi fitohormon endogenous atau reaksi hipersensitif sel tanaman terhadap fitohormon.
Pada penelitian tahap satu didapat hasil bahwa inokulasi A.
rhizogenes strain ATCC-15834, 509, 07-20001, A4, dan R-1000 mampu meningkatkan perkembangan akar, yaitu : panjang akar primer, jumlah akar lateral dan tersier serta pertumbuhan tajuk, yaitu : diameter batang, tinggi, dan jumlah daun tanaman yang lebih baik dibanding strain MAFF 01-1724, 510, 511, A4-J dan kontrol. Keadaan ini diduga karena adanya perbedaan keefektivitas dari masing-masing strain dalam proses transfer T-DNAnya. Hal ini biasanya berhubungan dengan virulensi strain Agrobacterium dan kerentanan dari sel tanaman.
Proses transfer T-DNA ke sel tanaman memerlukan beberapa faktor, antara lain; adanya T-DNA yaitu materi genetik yang akan ditransfer dan adanya faktor virulensi yaitu berbagai gen yang diperlukan pada proses transfer T-DNA (Gelvin 2003). Proses transfer T-DNA akan berhasil apabila terdapat kompatibilitas antara Agrobacterium dengan sel tanaman. Sel tanaman yang peka, apabila terluka akan mengeluarkan suatu metabolit yang berfungsi sebagai isyarat bagi Agrobacterium, dan sebagai penginduksi ekspresi faktor virulensi dari Agrobacterium. Sebaliknya Agrobacterium yang virulen akan menangkap isyarat yang diberikan oleh tanaman yang peka, dan dapat
mengekspresikan berbagai gen yang diperlukan dalam proses transfer T-DNA (Winans 1992; de la Riva et al 1998) (Gambar 25).
Satu atau beberapa molekul T-DNA dapat ditransfer dan berintegrasi dalam genom tanaman, sehingga dalam kromosom tanaman bisa terdapat satu atau beberapa utas T-DNA yang dapat berintegrasi pada satu situs atau pada beberapa situs yang terpisah. Situs integrasi T-DNA pada genom tanaman bersifat acak. Sekali terintegrasi di dalam genom tanaman, semua gen yang terdapat pada T-DNA akan terekspresikan (Gelvin 2003).
Pada penelitian ini hasil verifikasi inokulasi A. rhizogenes dengan amplifikasi PCR menunjukkan bahwa strain ATCC-15834 dapat mentransfer daerah TL-DNAnya pada akar bibit manggis yang dibuktikan dengan terdeteksinya gen rolB pada 780 bp. Perakaran dan pertumbuhan tajuk bibit manggis hasil inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 secara umum memang relatif lebih baik dari kontrol dan bahkan dengan hasil yang di inokulasi
A. rhizogenes strain 509, 07-20001, A4, dan R-1000 yang juga diduga efektif untuk menginfeksi bibit manggis.
Meningkatnya perakaran dan pertumbuhan tajuk bibit manggis hasil inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 karena telah terintegrasinya gen
rolB pada bibit manggis. Bibit manggis yang telah terintegrasi T-DNA selanjutnya akan mengekspresikan enzim baru, mensintesis fitohormon sehingga terjadi produksi fitohormon. Fitohormon tersebut diperlukan tanaman untuk meningkatkan sintesis protein dan memacu pertumbuhan akar primordia yang meningkatkan pertumbuhan akar. Rugini et al. (1991) melaporkan bahwa kemampuan perakaran, jumlah akar dan masa akar meningkat ketika gen
rolABC terekspresi pada tanaman kiwi. Zhu (2001) juga melaporkan bahwa gen
rolB yang terintegrasi ke sel tanaman mampu meningkatkan perakaran dan pertumbuhan tanaman apel.
Menurut Jeng-Sheng (2001) gen rolB berperan meningkatkan
kandungan auksin aktif dalam tanaman dengan menghidrolisis konjugat IAA inaktif dan mengatur sensivitas sel terhadap IAA. TL-DNA mengandung gen-gen
rol (root loci) yaitu : rolA, rolB, rolC dan rolD yang berperan dalam menginduksi akar rambut dan meningkatkan sensivitas sel tanaman terhadap adanya auksin.
Indole Acetic Acid (asam indol asetat = IAA) merupakan fitohormon endogen yang dihasilkan oleh Agrobacterium, dimana jalan pembentukan IAA melalui senyawa indole-3-asetamid (IAM). Menurut Davies (2004) bahwa jalur pembentukan IAA melalui senyawa intermediat indole-3-pyruvate (IPA) dan
indole-3-acetamide (IAM) biasa dilakukan oleh mikroorganisme, sedangkan jalan yang lain terdapat dalam tanaman.
Ekspresi gen yang terdapat pada T-DNA tersebut membawa konsekuensi síntesis fitohormon dan síntesis opin. Opin adalah turunan asam amino yang berfungsi sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri
membedakan jenis strain A. rhizogenesnya, karena strain yang berbeda akan mensintesis senyawa opin yang berbeda pula, sehingga dalam beberapa percobaan transformasi genetik tanaman, karakteristik ini sering digunakan sebagai marker (Zambryski et al. 1989).
Inokulasi A.rhizogenes pada manggis dilakukan pada akar bibit tanaman manggis dengan beberapa metode, yaitu metode akar ditusuk dan metode akar dipotong. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode inokulasi akar dipotong secara umum menghasilkan peningkatan perakaran dan pertumbuhan tajuk yang lebih baik dari pada metode akar yang ditusuk. Metode inokulasi ini juga berpengaruh terhadap persentase hidup bibit tanaman manggis dimana metode inokulasi dengan cara akar dipotong menghasilkan persentase bibit manggis yang hidup lebih tinggi dibandingkan dengan metode inokulasi dengan cara akar ditusuk. Dari fakta tersebut dapat disimpulkan bahwa metode inokulasi pada akar bibit manggis dengan cara akar dipotong lebih efektif untuk digunakan dibandingkan dengan metode akar ditusuk.
Banyaknya bibit manggis yang mati setelah diinokulasi dengan
A.rhizogenes disebabkan karena banyaknya akar bibit manggis yang mengalami pembusukan setelah diinokulasi. Hal ini diduga karena terjadinya infeksi bakteri yang terlalu banyak sehingga menyebabkan sel/jaringan tanaman menjadi stress dan tidak bisa tumbuh. Selain itu terjadi persaingan antara tanaman dan bakteri untuk tumbuh (Gambar 26). Menurut Winan (1992)
terdapat beberapa strain Agrobacterium yang dapat menyebabkan pembusukan
akar pada tanaman yang rentan, strain ini tidak menstransfer T-DNAnya tetapi mengeluarkan satu enzim pengurai yaitu pektinase.
Gambar 26. Bibit dan akar manggis hasil inokulasi A. rhizogenes yang mengalami pembusukan.
Setiap strain A. rhizogenes memiliki tingkat keefektivan yang bervariasi terhadap tanaman inangnya, demikian juga dengan tanamannya memberikan tanggap yang berbeda terhadap inokulasi strain A. rhizogenes. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ada perbedaan keefektivan dari masing-masing strain A. rhizogenes saat diinokulasikan pada akar bibit tanaman manggis.
Pada penelitian tahap ke dua dilakukan optimasi inokulasi strain A. rhizogenes. Hasil menunjukkan bahwa inokulasi strain ATCC-15834 menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang dan total luasan xilem akar yang lebih besar serta menghasilkan pertumbuhan rambut akar yang lebih baik dibandingkan inokulasi dengan strain 07-20001, A4, 509, R1000, dan kontrol. Dalam hal ini berarti bibit yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834 konsentrasi 1.0 paling efektif menginfeksi akar bibit manggis umur 6 minggu dibandingkan dengan strain 07-20001, 509, A4 dan R1000 konsentrasi 1.0 dan 0.7. Perbedaan keefektivan yang terjadi dari masing-masing strain tersebut diduga adanya perbedaan virulensi bakteri Agrobakterium yang digunakan.
Virulensi dari bakteri Agrobakterium dipengaruhi oleh eksudat atau metabolit yang disekresikan tanaman. Beberapa metabolit yang disekresikan tanaman yang rentan, yang tidak dijumpai pada tanaman resisten, akan
menginduksi faktor virulensi. Metabolit tersebut adalah asetosiringon, hidroksi asetosiringon, koniferil alkohol, koniferin dan etil firulat yang diperlukan dalam proses infeksi (Winans 1992). Dengan demikian efektivitas inokulasi sangat tergantung kepada strain A. rhizogenes yang digunakan, karena perbedaan strain bakteri mempengaruhi efisiensi transfer gen. Sehingga penting untuk menguji lebih dari satu strain A. rhizogenes dalam pekerjaan awal inokulasi.
Bakteri A. rhizogenes juga mampu menginduksi perakaran eksplan manggis secara in vitro, baik pada eksplan tanpa biji maupun pada eksplan dengan biji. Hal ini dapat dibuktikan dengan tumbuhnya akar adventif pada tempat yang diinokulasi (Gambar 22). Akar adventif ini dapat berkembang dan berfungsi sebagaimana akar yang normal lainnya. Hanya saja persentase tanaman yang mampu menghasilkan akar lebih dari dua masih sangat rendah, serta masih sulitnya menghilangkan kontaminasi bakteri A. rhizogenes pada media kultur in vitro. Keadaan ini menyebabkan akar tidak dapat berkembang dengan baik, diduga karena adanya persaingan antar eksplan dan bakteri A. rhizogenes untuk tumbuh.
Sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya bahwa hasil uji konfirmasi T-DNA dari akar hasil inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 secara in vivo
menggunakan polymerase chain reaction (PCR) dengan primer spesifik dapat terdeteksi adanya pita DNAnya pada 780 bp. Hal ini menandakan telah terjadinya transfer T-DNA bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834 ke dalam akar bibit manggis. Sedangkan hasil uji konfirmasi T-DNA dari akar hasil inokulasi berbagai strain A. rhizogenes secara in vitro menggunakan
polymerase chain reaction (PCR) dengan primer spesifik belum terlihat adanya pita DNA atau tidak muncul produk DNA-nya. Hal ini diduga karena T-DNA yang ditransfer berada pada level yang rendah atau jumlah kopi (copy number) T-DNA yang terdapat pada sel akar bibit manggis tersebut masih sedikit. Hasil yang serupa diperoleh Li dan Leung (2003) pada radiata pine (Pinus radiata D. Don) yang diinokulasi dengan strain A4 dan LBA9402. Sedangkan hasil penelitian Damiano dan Monticelli (1998) menunjukkan bahwa hanya 6.8% yang dikonfirmasi sebagai akar transgenik hasil inokulasi A. rhizogenes.
Hasil anatomi akar memperlihatkan bahwa akar hasil inokulasi A. rhizogenes mampu menghasilkan jumlah dan luas serapan permukaan sayatan melintang xilem yang tinggi dibandingkan dengan induksi akar menggunakan
hormon IBA (kontrol). Hal ini dapat menyebabkan penyerapan air dan unsur hara dapat berjalan dengan baik. Fakta ini menguatkan potensi dari inokulasi bakteri A. rhizogenes untuk meningkatkan perakaran bibit manggis.
Pola Hubungan antara Inokulasi A. rhizogenes dengan Anatomi Akar dan Fisiologi Bibit Tanaman Manggis
Pertumbuhan akar yang lebih baik setelah diinokulasi A. rhizogenes, merupakan salah satu indikasi terjadinya proses transfer T-DNA dari A. rhizogenes ke dalam kromosom sel tanaman. Di dalam T-DNA yang di transfer oleh strain A. rhizogenes terdapat berbagai gen penyandi protein yang mengatur proses biosintesis auksin endogen yang diperlukan untuk menginduksi pembentukan akar. Beberapa fungsi auksin adalah diperlukan dalam proses pembelahan sel dan inisiasi akar (Davies 2004). Efek lain dari auksin selain
merangsang pemanjangan sel untuk pertumbuhan primer, auksin
mempengaruhi pertumbuhan sekunder dengan cara menginduksi pembelahan sel pada kambium pembuluh dan dengan mempengaruhi diferensiasi xilem sekunder. Auksin juga meningkatkan aktivitas pembentukan akar adventif dari suatu batang tanaman (Campbell 2003).
Hasil penelitian ini mendapatkan inokulasi A.rhizogenes yang dapat menginfeksi akar bibit manggis. Pada bibit manggis yang terinfeksi serta dapat tumbuh dengan baik, terjadi peningkatan perakaran dan pertumbuhan tajuk bibit manggis. Berdasarkan hasil penelitian ini didapatkan bahwa akar sekunder, tersier dan kuarter bibit manggis yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834 menunjukkan perkembangan yang lebih baik dibandingkan inokulasi dengan strain A .rhizogenes lainnya.
Auksin merangsang pembentukan akar-akar lateral dan adventif, meskipun pemanjangan akar primer dihambat oleh konsentrasi auksin lebih besar dari 10-8 M, inisiasi akar-akar lateral (cabang) dan akar-akar adventif distimulasi oleh level auksin yang tinggi. Akar-akar lateral umumnya didapatkan di atas daerah pemanjangan dan daerah akar-akar rambut dan berasal dari sejumlah kecil sel dalam perisikel. Auksin juga menstimulasi sel-sel perisikel untuk membelah. Pembelahan sel-sel secara gradual ke dalam apeks akar, dan pertambahan akar lateral melalui korteks akar dan epidermis (Taiz & Zeiger 2002).
Auksin mempunyai kemampuan untuk meningkatkan kecepatan pemanjangan sel diikuti dengan pembesaran sel dan meningkatnya bobot basah akibat meningkatnya pengambilan air oleh sel tersebut serta mempengaruhi proses fisiologis lainnya. Akar primer dan inisiasi pembentukan akar lateral dirangsang oleh auksin, di samping itu pertumbuhan serta perkembangan sistem perakaran merupakan hasil interaksi yang kompleks antara akar dengan tajuk serta antara akar dengan lingkungan.
Inokulasi A. rhizogenes ini dapat mempercepat perkembangan akar lateral dan merangsang kerapatan dan panjang rambut-rambut akar bibit tanaman manggis, sehingga bibit mampu tumbuh dan berkembang lebih baik diakibatkan adanya peningkatan penyerapan hara dan air dengan semakin besarnya luas permukaan serapan. Hasil analisis hara menunjukkan bahwa inokulasi A. rhizogenes mampu meningkatkan serapan hara bibit manggis. Inokulasi strain ATCC-15834 dan 07-20001 mampu menghasilkan serapan hara N dan P daun yang nyata lebih besar dibandingkan kontrol. Unsur hara N dibutuhkan tanaman untuk sintesis klorofil, asam amino, protein dan senyawa asam nukleat (Salisbury & Ross 1995).
Fosfor merupakan salah satu unsur hara makro yang penting dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Unsur tersebut berfungsi sebagai penyusun metabolit dalam senyawa kompleks, sebagai aktivator, kofaktor atau penyusun enzim serat dan berperan dalam proses fisiologi (Soepardi 1983) dan juga merupakan komponen struktural dari sejumlah senyawa penting, molekul pentransfer energi ADP dan ATP (Marschner 1997). Menurut Harran & Tjondronegoro (1992) ATP merupakan senyawa penting bagi reaksi metabolit yaitu reaksi biosintesis pembentukan senyawa penting bagi pemeliharaan sel pertumbuhan termasuk protein dan asam nukleat. Selain itu ATP diperlukan untuk sintesis cadangan makanan seperti lemak dan polisakarida serta diperlukan dalam proses transpor aktif dan aliran protoplasma. Fosfor juga merupakan unsur yang sangat kritikal bagi pertumbuhan tanaman, selain itu kekurangan P mengakibatkan tanaman tidak mampu menyerap unsur-unsur lain. Sebagai unsur yang penting dalam pembentukan energi bagi pertumbuhan tanaman maka ketersediaan P yang cukup akan memperbaiki pertumbuhan tanaman.
Serapan Kalium pada bibit manggis tidak berbeda antara bibit yang diinokulasi dengan kontrol. Sebab unsur K merupakan unsur hara yang bersifat sangat mobil pada semua tingkat pertumbuhan. Fungsi unsur K adalah mengatur mengatur aktivitas sel penjaga stomata untuk meningkatkan pengikatan CO2, pengatur aktivitas enzim, sintesis protein, pergerakan stomata, dan mengatur keseimbangan anion-kation (Marschner 1995). Jika energi yang tersedia dalam jumlah yang cukup maka semua proses metabolisme dapat berlangsung dengan baik, sehingga tanaman akan lebih mampu menghadapi keadaan lingkungan yang beragam dan mampu tumbuh dengan baik.
Aplikasi Praktis Inokulasi A. rhizogenes
Tertransfernya T-DNA dari A. rhizogenes ke dalam sel tanaman dapat menyebabkan penambahan satu jalur untuk produksi hormon auksin secara
endogen dalam tanaman, karena T-DNA yang berasal dari Agrobacteium
tersebut memiliki elemen-elemen pengatur seperti yang terdapat pada tanaman. Auksin endogen yang dihasilkan oleh tanaman dapat ditransportasikan dan digunakan langsung oleh tanaman, akan tetapi apabila ketersediaannya berlebih maka IAA dapat diikat oleh senyawa-senyawa tertentu menjadi IAA asam aspartat, IAA-miaoinositol dan IAA glukosa. Senyawa-senyawa tersebut tidak aktif sebagai auksin kecuali bila dihidrolisis kembali menjadi IAA bebas. Pengaturan ini penting bagi tanaman untuk mengatur ketersediaan IAA di dalam tanaman sesuai dengan kebutuhan tanaman (Wattimena 1998; Davies 2004). Sedangkan penambahan auksin eksogen sering menghambat pertumbuhan akar. Penghambatan ini sebagian disebabkan oleh etilen, karena semua jenis auksin akan merangsang berbagai sel tumbuhan untuk menghasilkan etilen, terutama bila auksin diberikan dalam jumlah besar. Etilen menghambat pertumbuhan akar dan juga batang (Lakitan 1995). Keberadaan bakteri A. rhizogenes disekitar perakaran tanaman ternyata dapat meningkatkan kandungan asam organik tanah yang berguna untuk perkembangan akar tanaman (Leyval & Berthein 1989 dalam McAfee et al 1993). Bakteri A. rhizogenes dapat membantu memperbaiki pertumbuhan tanaman. Apabila keunggulan bakteri ini dapat dimanfaatkan dengan baik, diharapkan masalah perakaran pada tanaman yang sulit berakar dapat teratasi.
Hasil penelitian ini dimenunjukkan bahwa bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834 yang dapat menginfeksi akar bibit tanaman manggis umur 6 minggu pada konsentrasi A. rhizogenes OD600 = 1.0. Dengan terinfeksinya strain ATCC-15834 pada akar bibit manggis, serapan hara (N dan P) daun, dan kandungan hormon IAA meningkat, serta menghasilkan perkembangan rambut akar yang lebih baik. Hal ini menunjukkan bahwa telah tertransfernya T-DNA dari Ri-plasmid A. rhizogenes ke sel akar bibit manggis. Keadaan seperti ini sangat menguntungkan karena akar transgenik tersebut dapat ditumbuhkan pada medium kultur jaringan menjadi tanaman lengkap pada medium sederhana tanpa manipulasi zat pengatur tumbuh (ZPT). Tanaman yang dihasilkan tersebut telah membawa T-DNA dari Ri-plasmid A. rhizogenes sehingga tidak perlu lagi untuk menginokulasikan bakteri A. rhizogenes ke bibit tanaman manggis. T-DNA dari Ri plasmid A. rhizogenes tersebut tidak akan hilang dari tanaman manggis yang sudah terintegrasi selama tanaman itu hidup. Berdasarkan penelitian Han et al. (1997) telah berhasil meregenerasikan tanaman Populus
dari akar hasil transformasi A. rhizogenes menjadi tanaman lengkap dengan pertumbuhan yang normal.
Akar bibit manggis yang telah tertransformasi T-DNA dari Ri-plasmid A. rhizogenes dapat berintegrasi dengan DNA kromosom dari sel akar bibit manggis melalui proses rekombinasi. Sehingga berbagai gen pada T-DNA dari Ri-plasmid A. rhizogenes yang ditransfer dan terintegrasi dalam sel akar bibit manggis, akan terekspresi di dalam sel akar sehingga mengakibatkan terjadinya produksi fitohormon endogenous yang diperlukan untuk menginduksi pembentukan akar. Keadaan ini menandakan adanya perubahan secara genetis pada tanaman manggis, sehingga diperoleh bibit manggis dengan sistem perakaran yang lebih baik dibandingkan menggunakan hormon tumbuh secara eksogen.
Akar yang dihasilkan setelah diinokulasi dengan bakteri A. rhizogenes
merupakan kimera transgenik sedangkan pada batang, daun dan buahnya tidak trangenik. Maka inokulasi A. rhizogenes dapat diaplikasikan setiap kali akan melakukan pembibitan manggis karena T-DNA yang telah tertransfer ke sel akar bibit manggis tidak diturunkan.
Kendala-Kendala yang Dihadapi dalam Penelitian
Kendala dalam pelaksanaan penelitian inokulasi A. rhizogenes pada bibit manggis baik secara in vivo maupun in vitro adalah ; sulitnya membuat koloni tunggal dari bakteri A. rhizogenes tersebut karena pertumbuhan dari strain-strain A. rhizogenes cepat sekali sehingga dibutuhkan suatu ketrampilan khusus untuk bisa mendapatkan koloni tunggal dari A. rhizogenes. Koloni tunggal ini sangat diperlukan karena dapat menjamin kemurnian dari strain yang akan diaplikasikan ke tanaman.
Bakteri A. rhizogenes ini setiap satu bulan sekali harus diremajakan ke media yang baru, agar pertumbuhannya tetap baik. Hanya saja pemindahan setiap bulan ini dapat menyebabkan efektivitas dari bakteri A. rhizogenes
menjadi berkurang. Untuk mengatasi hal tersebut dilakukan pengawetan bakteri
A. rhizogenes dalam bentuk serbuk sehingga dapat bertahan lama, namun itu semua dibutuhkan biaya yang cukup mahal.
Aplikasi A. rhizogenes pada media kultur jaringan cukup sulit karena pertumbuhan bakteri A. rhizogenes dimedia kultur jaringan ini susah untuk dihilangkan walaupun telah ditambahkan antibiotik xefotaxime 500 mg/l ke dalam media. Pada penelitian ini setiap 3 hari sekali dilakukan subkultur ke media yang telah ditambahkan antibiotik sampai minggu ke-12 dan bakterinya masih belum bisa dihilangkan. Keadaan ini sangat menganggu pertumbuhan tanaman, bahkan akar yang tadinya telah terbentuk lama-kelamaan mengalami pembusukkan.
SIMPULAN DAN SARAN UMUM Simpulan
1. Inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834, 07-20001, A4, 509, dan R-1000 mampu meningkatkan pertumbuhan panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan tersier serta pertumbuhan tajuk, yaitu : diameter batang, tinggi tanaman, dan jumlah daun tanaman bibit manggis. Metode inokulasi dengan cara akar dipotong lebih efektif dalam menginfeksi akar bibit manggis dibandingkan dengan akar ditusuk.
2. Di antara kelima strain A. rhizogenes tersebut, strain ATCC-15834 pada konsentrasi OD600=1.0 dapat menginokulasi akar bibit tanaman manggis umur 6 minggu. Strain ATCC-15834 dapat mentransfer daerah TL-DNAnya pada akar bibit manggis yang dibuktikan dengan terdeteksinya gen rolB 780 bp pada gel elektroforesis.
3. Anatomi akar bibit manggis hasil inokulasi strain ATCC-15834 menghasilkan