DAN GINJAL TIKUS PERCOBAAN Pendahuluan
6 PEMBAHASAN UMUM
Hasil penapisan fitokimia yang dilakukan secara kualitatif terhadap ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak memperlihatkan bahwa jenis senyawa fitokimia yang banyak terdapat pada ekstrak air adalah senyawa dari golongan alkaloid, fenolik dan triterpenoid. Sedangkan jenis senyawa fitokimia yang banyak terdapat pada ekstrak etanol adalah senyawa dari golongan alkaloid, tanin, fenolik, flavonoid dan triterpenoid. Hasil ini diperkuat pada tampilan spektra 1H- NMR untuk kedua jenis ekstrak, dimana jumlah proton yang terletak pada area senyawa aromatik sangat kecil ditemukan pada spektra ekstrak air umbi bawang dayak, yang menandakan bahwa jenis dan jumlah senyawa aromatik pada ekstrak air lebih sedikit dibandingkan yang terkandung di dalam ekstrak etanol umbi bawang dayak. Analisis kuantitatif untuk total fenol dan total flavonoid yang dilakukan terhadap ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak kembali memperlihatkan bahwa jumlah total flavonoid dan total fenol yang terkandung di dalam ekstrak etanol (217.71 ± 3.37 mg GAE per gram ekstrak dan 65.35 ± 0.55 mg QE per gram ekstrak) sangat nyata lebih tinggi (P<0.01) dibandingkan dengan ekstrak air (139.93 ± 4.44 mg GAE per gram ekstrak dan 16.95 ± 0.55 mg QE per gram ekstrak).
Berdasarkan analisis kualitatif dan kuantitatif tersebut dapat diduga bahwa aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh ekstrak etanol umbi bawang dayak lebih besar dibandingkan dengan ekstrak air. Dugaan ini dibuktikan dengan pengukuran aktivitas antioksidan metode DPPH yang mengemukakan hasil bahwa aktivitas antioksidan setara asam askorbat, BHT, dan trolox untuk ekstrak etanol umbi bawang dayak (117.98 ± 9.69 mg asam askorbat ekivalen per gram ekstrak, 215.32 ± 20.82 mg BHT ekivalen per gram ekstrak, 187.09 ± 15.06 mg trolox ekivalen per gram ekstrak) sangat nyata lebih tinggi (P<0.01) daripada ekstrak air (70.88 ± 12.89 mg asam askorbat ekivalen per gram ekstrak, 114.10 ± 27.70 mg BHT ekivalen per gram ekstrak, 113.87 ± 20.04 mg trolox ekivalen per gram ekstrak). Nilai IC50 untuk penghambatan aktivitas radikal bebas DPPH ekstrak
etanol dan ekstrak air umbi bawang dayak masing-masing adalah 112 dan 526 ppm.
Pengujian kapasitas penghambatan enzim alfa-glukosidase dilakukan terhadap ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak secara in vitro merujuk metode yang dilakukan oleh Mayur et al. (2010). Pengukuran ini juga menyertakan acarbose sebagai kontrol agen antidiabetik komersial. Hasil yang diperoleh kembali memperlihatkan bahwa ekstrak etanol umbi bawang dayak memiliki aktivitas inhibisi alfa-glukosidase yang lebih besar dibandingkan dengan ekstrak air. Pada konsentrasi 250 ppm, aktivitas inhibisi alfa-glukosidase ekstrak etanol sangat nyata lebih besar (P<0.01) dibandingkan dengan ekstrak air umbi bawang dayak dan acarbose. Pada konsentrasi 500 ppm aktivitas inhibisi alfa glukosidase ekstrak etanol sangat nyata lebih besar (P<0.01) daripada ekstrak air, namun juga sangat nyata lebih rendah (P<0.01) daripada acarbose. Nilai IC50
penghambatan enzim alfa glukosidase untuk masing-masing ekstrak air, etanol dan acarbose adalah 505, 241 dan 288 ppm.
Ieyama et al. (2011) telah melaporkan bahwa tiga senyawa turunan
Eleutherine americana memiliki aktivitas inhibisi alfa-glukosidase. Ketiga
57
Eleutherinoside ditemukan dalam jumlah yang paling banyak dan memiliki aktivitas inhibisi yang paling tinggi (IC50 0.5 mM) di antara ketiga senyawa
tersebut.
Identifikasi senyawa aktif yang berperan dalam penghambatan enzim alfa- glukosidase di dalam ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak dilakukan secara kualitatif menggunakan 1H NMR spectroscopy. Identifikasi dilakukan dengan membandingkan spektra ekstrak air dan ekstrak etanol umbi bawang dayak dengan data 1H NMR yang dilaporkan oleh Ieyama et al. (2011) dan Shibuya et al. (1997) dengan bantuan J resolved NMR 2 dimensi. Analisis NMR tersebut berhasil mengidentifikasi keberadaan senyawa eleutherinoside A, eleutherol dan eleuthoside B di dalam ekstrak etanol umbi bawang dayak. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa eleutherinoside A, eleutherol dan eleuthoside B adalah senyawa aktif yang berperan sebagai inhibitor enzim alfa-glukosidase di dalam ekstrak etanol umbi bawang dayak.
Keberadaan senyawa eleutherinoside A, eleuthoside B dan eleutherol di dalam ekstrak air umbi bawang dayak tidak berhasil teridentifikasi di dalam penelitian ini akibat spektranya memiliki sinyal untuk proton aromatik yang sangat sedikit. Senyawa alkaloid, triterpenes, flavonoid, dan fenolik telah banyak dilaporkan dalam berbagai penelitian memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim alfa-glukosidase (Patel dan Mishra 2012, Lai et al. 2012, Wang et al.
2010a, Lee et al. 2008, Tadera et al. 2006). Berdasarkan hal tersebut maka diduga aktivitas inhibisi alfa-glukosidase di dalam ekstrak air merupakan kolaborasi dari berbagai senyawa fitokimia tersebut. Golongan senyawa fitokimia tersebut juga terdapat di dalam ekstrak etanol umbi bawang dayak dan ikut berperan bersama eleutherinoside A, eleutherol dan eleuthoside B dalam menghambat enzim alfa- glukosidase. Hal ini menjadikan aktivitas penghambatan enzim alfa-glukosidase yang dimiliki oleh ekstrak etanol sangat nyata lebih besar daripada ekstrak air umbi bawang dayak.
Setelah mendapatkan bukti bahwa secara in vitro ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak memiliki aktivitas antioksidan dan antidiabetik, selanjutnya dilakukan pembuktian efektivitas antioksidan dan antidiabetik kedua ekstrak tersebut secara in vivo pada tikus diabetes dan tikus non diabetes. Pengujian pada tikus non diabetes dilakukan untuk mengevaluasi keamanan konsumsi kedua jenis ekstrak terhadap fungsi dan morfologi hati dan ginjal
Kondisi diabetes melitus pada tikus percobaan dalam penelitian ini adalah akibat kerusakan sel beta pankreas yang ditimbulkan oleh pemberian senyawa aloksan monohidrat. Di dalam tubuh senyawa aloksan akan direduksi menjadi asam dialurat dan menghasilkan radikal aloksan intermediet (Szkuldeksi 2001). Radikal tersebut akan merusak sel beta pankreas. Akibat dari kerusakan sel beta pankreas maka sekresi insulin menjadi terganggu dan kadar glukosa darah meningkat (hiperglikemia). Kondisi hiperglikemia memicu pembentukan radikal bebas. Radikal bebas dapat menyerang berbagai komponen makromolekul seperti fosfolipid dan protein yang terdapat pada membran sel, termasuk pada sel beta pankreas. Sebagai akibatnya permeabilitas membran menjadi rusak dan radikal bebas dapat masuk ke dalam sel serta menyerang enzim-enzim antioksidan. Dengan demikian kapasitas enzim-enzim antioksidan menurun dan terjadilah stres oksidatif, dan kerusakan sel beta pankreas semakin meningkat dan sekresi hormon insulin terganggu. Di samping itu, gangguan metabolisme karbohidrat
58
menyebabkan terjadinya perombakan jaringan adiposa (lipolisis) dan protein (katabolisme) sebagai sumber energi seluler pengganti glukosa. Sebagai akibatnya tikus diabetes mengalami penurunan berat badan.
Pemberian ekstrak air dan ekstrak etanol umbi bawang dayak pada tikus diabetes dapat meningkatkan kemampuan enzim antioksidan, baik melalui aktivitas pembersih radikal dan pemutus reaksi radikal bebas berantai yang dimiliki ekstrak, penghematan pemakaian enzim-enzim antioksidan, dan juga melalui modulasi aktivitas dan ekspresi enzim-enzim antioksidan. Dengan meningkatnya status antioksidan pada jaringan pankreas maka laju kerusakan sel beta pankreas dapat dihambat. Penghambatan laju kerusakan sel beta pankreas memberikan kesempatan kepada sel beta untuk dapat memproduksi dan mensekresikan hormon insulin. Ketersediaan hormon insulin di dalam darah menyebabkan sel dapat memanfaatkan glukosa darah sebagai sumber energi. Di samping itu, aktivitas inhibisi alfa-glukosidase ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak bekerja di usus sehingga dapat menurunkan kadar glukosa darah
postpandrial. Dengan demikian berbagai konsekuensi yang ditimbulkan oleh
kondisi hiperglikemia seperti lipolisis, autooksidasi glukosa, dan glikasi protein dapat dicegah. Hal ini akan mencegah pula terjadinya peningkatan radikal bebas yang dihasilkan dari berbagai reaksi tersebut sehingga dapat mencegah stres oksidatif dan mecegah kerusakan lebih lanjut pada sel beta pankreas.
Perbaikan kapasitas enzim antioksidan dibuktikan pada Tabel 9 dan Gambar 16 (Bab 4) yang memperlihatkan kandungan enzim Cu,Zn-SOD pada ginjal tikus diabetes yang diberi ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak lebih banyak daripada tikus kontrol positif. Penghambatan laju kerusakan sel beta pankreas telah dibuktikan pada Tabel 11 dan Gambar 17 (Bab 4) yang memperlihatkan jumlah sel beta tikus diabetes yang diberi ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak sangat nyata lebih tinggi dibandingkan dengan tikus kontrol positif. Sekresi hormon insulin sebagai akibat penghambatan laju kerusakan sel beta pankreas dibuktikan pada Gambar 15 (Bab 3) yang memperlihatkan kadar insulin serum tikus diabetes yang diberi ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak sangat nyata lebih tinggi (P<0.01) dibandingkan dengan tikus kontrol positif. Perbaikan kontrol glikemik ditunjukkan pada Gambar 14 (Bab 3) yang memperlihatkan bahwa ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak dapat menurunkan kadar glukosa darah. Pencegahan perombakan lemak (lipolisis) dan katabolisme protein untuk mendapatkan sumber energi seluler pengganti glukosa ditunjukkan pada Gambar 13 (Bab 3) yang memperlihatkan bahwa pemberian ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak dapat mempertahankan berat badan tikus diabetes hingga tidak berbeda nyata dengan tikus non diabetes. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa mekanisme hipoglikemik ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak adalah melalui inhibisi enzim alfa glukosidase, penghambatan laju kerusakan sel beta, dan melalui peningkatan sekresi hormon insulin.
Aktivitas antioksidan ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak juga dibuktikan dengan pengukuran kadar peroksidasi lipid pada jaringan hati. Membran sel tersusun dari asam lemak tak jenuh dan protein. Asam lemak tak jenuh rantai panjang dari fosfolipid mudah terabstraksi oleh radikal bebas, dengan cara menarik atom hidrogen asam lemak tidak jenuh rantai panjang dari membran sel. Penarikan atom hydrogen tersebut akan menghasilkan radikal C* pada bagian hidrofobik dari membran sel. Radikal C* kemudian akan bereaksi dengan O2 yang
59
terlarut dalam membran menghasilkan radikal peroksil (O2*). Reaksi tersebut
akan berulang dan keseluruhan proses bersambung dalam reaksi berantai radikal bebas hingga sel menjadi rusak dan mati (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Proses peroksidasi lipid akan menghasilkan senyawa malonaldehid (MDA), sehingga kadar MDA dapat dijadikan parameter derajat peroksidasi lipid di dalam tubuh.
Hasil pengukuran kadar MDA hati pada serum tikus percobaan memperlihatkan kadar MDA hati tikus diabetes yang diberi ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak sangat nyata lebih rendah (P<0.01) dibandingkan dengan tikus kontrol diabetes. Rendahnya kadar MDA hati menunjukkan bahwa peroksidasi lipid yang terjadi juga lebih rendah. Hal ini membuktikan efektivitas senyawa antioksidan yang dimiliki oleh flavonoid, fenolik, dan triterpenoid yang terdapat di dalam ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak dalam membantu kerja enzim-enzim antioksidan serum (SOD, katalase, dan glutation peroksidase) dalam mengatasi stres oksidatif. Mekanisme senyawa antioksidan ekstrak (flavonoid, fenolik dan triterpenoid) dalam mengatasi kereaktifan radikal bebas dapat melalui pendonoran hidrogen, pengelatan logam, atau pembersihan singlet oksigen.
Pengukuran aktivitas enzim SOD dan katalase pada serum tikus percobaan memberikan hasil bahwa aktivitas kedua enzim tersebut di dalam serum tikus diabetes yang diberi ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak sangat nyata lebih tinggi (P<0.01) dibandingkan dengan tikus kontrol positif (Tabel 6, Bab 3). Senyawa antioksidan yang terkandung di dalam ekstrak bekerja mengatasi radikal bebas sehingga menghemat pemakaian enzim-enzim antioksidan. Dengan demikian ketersedian enzim-enzim antioksidan di dalam tubuh menjadi lebih besar yang terlihat dari lebih tingginya aktivitas enzim SOD dan katalase pada serum tikus diabetes yang diberi ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak. Ketersediaan enzim-enzim antioksidan di dalam serum pada kondisi diabetes sangat membantu mencegah terjadinya oksidasi pada LDL-kolesterol. Sebagaimana telah diketahui bahwa oksidasi LDL-kolesterol dapat menyebabkan aterosklerosis, stroke dan penyakit jantung koroner. Aterosklerosis, stroke, dan penyakit jantung koroner adalah komplikasi makrovaskuler yang umum terjadi pada penderita diabetes melitus.
Peranan ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak dalam ketersediaan enzim-enzim antioksidan pada jaringan ginjal juga telah dibuktikan dalam penelitian ini dan telah dijelaskan sebelumnya. Sama halnya dengan yang terjadi pada serum darah, di dalam jaringan ginjal enzim-enzim antioksidan juga akan mencegah stres oksidatif yang dapat menyerang lipid dan protein yang terdapat di dalam membran sel dan mencegah oksidasi LDL kolesterol di dalam mikrovaskuler pada jaringan ginjal. Hal ini akan melindungi ginjal dari kerusakan oksidatif yang dapat mengakibatkan kerusakan pada jaringan ginjal.
Dislipidemia merupakan salah satu komplikasi yang umum terjadi pada penderita diabetes melitus. Natarajan et al.1996 dan Davi et al. 1999 melaporkan bahwa kondisi hiperglikemik juga dapat meningkatkan aktivitas dan ekspresi enzim-enzim lipoksigenase. Enzim lipoksigenase dapat mengoksidasi LDL dengan mekanisme pengoksidasian asam arakidonat dan linoleat. Produk peroksidasi asam arakidonat disebut isoprostan. Isoprostan jenis 8-epi- prostaglandin (PG) F2α menunjukkan peningkatan pada penderita diabetes.
60
memperlihatkan bahwa tikus diabetes yang diberi ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak memiliki kadar LDL serum yang sangat nyata (P<0.01) lebih rendah dibandingkan dengan tikus kontrol positif. Demikian juga dengan kadar kolesterol total, pemberian ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak pada tikus diabetes memberikan kadar kolesterol total yang sangat nyata lebih rendah (P<0.01) dibandingkan dengan tikus kontrol positif. Aktivitas hipoglikemik yang dimiliki oleh ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak akan membantu menurunkan risiko aterosklerosis pada penderita diabetes melitus.
Pemberian 500 mg kg-1 bb ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak tidak menimbulkan gangguan pada fungsi hati dan ginjal. Hal ini ditunjukkan dengan hasil yang didapatkan dari pengukuran kadar SGPT, SGOT, albumin dan kreatinin serum yang memperlihatkan bahwa pemberian 500 mg/kg BB ekstrak air dan etanol umbi bawang pada tikus non diabetes tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata dibandingkan dengan kadar SGPT, SGOT, albumin dan serum yang terdapat pada tikus kontrol negatif.
Ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak juga tidak menimbulkan kerusakan pada jaringan hati dan ginjal yang dibuktikan dengan pengamatan histologi pada morfologi jaringan hati dan ginjal. Pemberian 500 mg/kg BB ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak pada tikus non diabetes tidak menyebabkan degenerasi, peradangan dan nekrosa pada jaringan hati dan ginjal. Secara umum mekanisme aksi ekstrak air dan ekstrak etanol umbi bawang dayak disajikan dalam Gambar 20.
61
Gambar 20 Mekanisme kerja antidiabetik ekstrak air dan etanol umbi bawang dayak. Keterangan: = diteliti dalam penelitian ini ; = tidak diteliti dalam penelitian ini.
Menurunkan LDL Antihiperlipidemik
Antioksidan Antidiabetik
Alkaloid, fenolik, triterpenoid Alkaloid, tanin, fenolik, flavonoid, triterpenoid, eleutherinoside A, eleuthoside B, dan eleutherol
Menghambat laju kerusakan sel beta pankreas Alfa-glukosidase inhibitor Meningkatkan produksi insulin Meningkatkan kadar insulin serum Menurunkan total kolestrol Pankreas Usus Ekstrak Etanol Ekstrak Air Menurunkan penyerapan glukosa Pankreas Melindungi sel beta dari kerusakan
oksidatif
Hati
Menurunkan tingkat lipoperoksidasi
Melindungi hati dari kerusakan oksidatif Ginjal Darah Meningkatkan aktivitas enzim antioksidan Mepertahankan jumlah enzim antioksidan Melindungi ginjal dari kerusakan oksidatif Menurunkan oksidasi LDL - kolestrol Mencegah komplikasi diabetes ( aterosklerosis, stroke, PJK, retinopathy, nephropathy, neuropath) Memperbaiki kadar glukosa darah Bawang Dayak (Eleutherine palmifolia)
62