METODE PENELITIAN
D. Variabel Penelitian 1.Variabel Bebas 1.Variabel Bebas
8. Pembedahan Tikus
g. Memasukkan pipet yang berisi darah ke dalam tabung hemoglobin, sampai ujung pipet menempel pada dasar tabung. h. Meniup pelan-pelan. Usahakan agar tidak timbul gelembung
udara. Bilas sisa darah yang menempel pada dinding pipet dengan cara menghisap HCl dan meniupnya lagi sebanyak 3-4 kali.
i. Mendiamkan selama kurang lebih 3-5 menit.
j. Memasukan aquades tetes demi tetes sampai warna larutan (setelah diaduk sampai homogen) sama dengan warna gelas dari alat pembanding.
k. Membaca kadar hemoglobin pada skala tabung, bila sudah sama.
8. Pembedahan Tikus
a. Membius tikus dengan cara memasukkannya ke dalam toples berisi kapas yang telah dibasahi dengan menggunakan kloroform.
b. Melakukan pembedahan menggunakan discetting set,
selanjutnya mengambil organ ovariumnya, setelah tikus dibius. c. Memasukkan organ uterus dengan segera ke dalam flakon yang
berisi larutan formalin 10% 9. Pembuatan Preparat
Pembuatan preparat histologik dilakukan di laboratorium Patologi dan Anantomi FK UGM dengan menggunakan metode
9
parafin dan pewarnaan Hematoxylin-Eosin (HE). Langkah-langkahnya sebagai berikut:
a. Fixation
Uterus yang telah dilabeli dimasukkan ke dalam
fixative, yaitu formalin 10%. b. Trimming
Triming adalah tahapan yang dilakukan setelah proses fiksasi dengan melakukan pemotongan tipis jaringan setebal kurang lebih 4 mm.
c. Dehydration (Pengeringan)
Dehidrasi jaringan dimaksudkan untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam jaringan, dengan meggunakan cairan dehidran yaitu alkohol secara bertingkat dengan waktu yang tertentu yaitu:
1) Alkohol 80%, selama 2 jam 2) Alkohol 96%, selama 2 jam 3) Alkohol 96%, selama 1 jam 4) Alkohol absolut, selama 1 jam 5) Alkohol absolut, selama 1 jam 6) Alkohol absolut, selama 1 jam d. Clearing (Penjernihan)
10
Proses ini bertujuan untuk menghilangkan alkohol, agar parafin dapat masuk ke dalam jaringan. Agen penjernihan adalah Xylol dengan cara bertahap yaitu :
1) Xylol, selama 1 jam 2) Xylol, selama 1 jam 3) Xylol, selama 1 jam e. Parafination
Proses infiltrasi dilakukan didalam oven (incubactor) dengan perbandingan xylol : paraffin = 1:1 selama 120 menit pada suhu 600C. Pemberian paraffin murni pada suhu 600C selama 120 menit. Pemberian paraffin murni pada suhu 600C selama 120 menit.
f. Embedding (Penanaman)
Jaringan yang berada pada parafin kemudian dilekatkan pada balok kayu ukuran 3x3 cm atau embedding cassette. Fungsi dari balok kayu atau embedding cassette
adalah untuk pemegang pada saat blok dipotong dengan
microtom.
g. Sectioning (pemotongan menggunakan mikrotom)
1) Blok parafin yang telah berisi jaringan, diiris menggunakan scalpel sehingga bagian yang akan diiris dengan microtom berbentuk segiempat teratur. Preparat diletak di tengah, kira-kira 3-5 mm dari tepinya.
11
2) Meletakkan blok parafin pada holder kayu.
3) Memasang holder dengan blok paraffin pada rotary microtom yang direkatkan.
4) Menyiapkan tempat coupes atau pita preparat dan kuas kecil untuk mengambil coupes dari pisau mikrotom. 5) Mengatur tebal tipisnya coupes dengan mengatur pada
pengaturan di microtom.
6) Memasukkan preparat kedalam nampan yang berisi air hangat. Hal tersebut dilakukan agar coupes dapat merentang dan jaringan tidak melipat.
7) Menempelkan Coupes pada gelas benda (pada proses affixing) yang sebelumnya telah diolesi oleh putih telur atau albumin.
h. Affixing
1) Meletakkan sejumlah coupes (irisan tengah pita preparat) pada kaca benda yang telah diberi perekat dengan gliserin dan albumin.
2) Memindahkan kaca-kaca gelas benda yang berisi
coupes tersebut ke atas hot plate dengan suhu (40-45°C), adanya kelebihan air dihisap dengan menggunakan pipet/kertas saring, dan mengarur letak
coupes dengan parafinnya direntangkan. i. Pewarnaan menggunakan Hematoxylin-Eosin
12
1) Mencelupkan kaca benda yang telah ditempeli coupes
ke dalam xylol secara berulang yaitu: Xylol (I) selama 5 menit, Xylol (II) selama 5 menit, dan Xylol (III) selama 5 menit.
2) Melakukan dehidrasi berulang yakni: Alkohol absolute (I) selama 5 menit, Alkohol absolut (II) selama 5 menit.
3) Mencelupkan coupes ke dalam aquadest selama 1 menit.
4) Mencelupkan ke dalam Hematoxyilin-Eosin selama 20 menit.
5) Mencelupkan coupes ke dalam aquadest selama 1 menit.
6) Mencelupkan coupes ke dalam acid alkohol sebanyak 2-3 celupan.
7) Mencelupkan coupes ke dalam aquadest selama 1 menit.
8) Mencelupkan coupes ke dalam aquadest selama 15 menit.
9) Mencelupkan kedalam Eosin selama 2 menit
10)Melakukan dehidrasi berulang lagi yakni: Alkohol 96% (I) selama 3 menit, Alkohol 96% (I) selama 3
13
menit, Alkohol absolut (III) selama 3 menit, Alkohol absolut (IV) selama 3 menit.
11)Mecelupkan ke dalam Xylol yaitu : Xylol (IV) selama 5 menit, Xylol (V) selama 5 menit
12)Memounting dengan per mount. 10.Pengamatan Histologik
Preparat yang sudah jadi diamati di bawah mikroskop cahaya dan dengan bantuan mikrometer okuler dan objektif dengan perbesaran 40X. Preparat diamati pada seluruh bidang pandangnya, lalu membandingkan hasil yang diperoleh antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol.
Cara mengukur ketebalan lapisan endometrium diukur mulai dari lapisan yang berbatasan langsung dengan lumen uterus sampai dengan batas antara lapisan endometrium dengan lapisan miometrium menggunakan bantuan mikrometer okuler yang telah dikalibrasi dengan mikrometer objektif. Hasil hitungan kalibrasi mikrometer okuler dengan mikrometer objektif adalah sebagai berikut:
7 okuler = 80 µm 1 okuler = 80 : 7
14
Ketebalan endometrium yang telah diketahui dikalikan dengan nilai kalibrasi 11.4, maka akan ditedapatkan ketebalan endometrium pada setiap bagian (atas, bawah, kanan dan kiri). G. Teknik Penempatan Sampel
Teknik ini perlu dilakukan untuk membagi tikus secara acak yang akan dimasukkan ke dalam masing-masing kandang. Teknik yang digunakan adalah pengambilan tikus secara acak, yaitu dengan pemberian warna merah dan hijau menggunakan spidol permanen di badan tikus. Warna serta kode tersebut adalah: merah, hijau, merah merah, hijau hijau dan merah hijau. Warna dan kode tersebut akan digunakan untuk mengisi masing-masing kandang, sehingga setiap kandang terisi 5 ekor tikus dengan warna dank ode yang telah dibuat tersebut.
Tabel 3. Pembagian Warna pada Tikus Putih sebagai Teknik Melakukan Pemilihan Sampel
Tikus Warna dan Kode Tikus Warna dan Kode 1 Merah (M) 11 Merah (M) 2 Hijau (H) 12 Hijau (H) 3 Merah Merah (MM) 13 Merah Merah (MM) 4 Hijau Hijau (HH) 14 Hijau Hijau (HH) 5 Merah Hijau (MH) 15 Merah Hijau (MH) 6 Merah (M) 16 Merah (M) 7 Hijau (H) 17 Hijau (H) 8 Merah Merah (MM) 18 Merah Merah (MM) 9 Hijau Hijau (HH) 19 Hijau Hijau (HH) 10 Merah Hijau (MH) 20 Merah Hijau (MH)
15 H. Teknik Pengumpulan Data
Pengumpulan data yang dilakukan adalah dengan pengamatan masing-masing preparat ketebalan endometrium menggunakan mikroskop dan mikrometer okuler dan objektif, kemudian melakukan penghitungan ketebalan endometrium. Penghitungan kadar hemoglobin dilakukan dengan menggunakan alat pengukur Hb pada hari ke-28.