Pembuatan Bakteri Probiotik Terenkapsulasi
Tahapan enkapsulasi bakteri probiotik L. acidophilus (La RRM-01) atau B. longum (Bl RRM-01) ditunjukkan pada Gambar 5. Metode enkapsulasi yang digunakan berdasarkan hasil modifikasi dari Reyed (2007). Proses enkapsulasi probiotik diawali dengan penumbuhan L. acidophilus (La RRM-01) atau B.
longum (Bl RRM-01) (5% v/v kultur kerja) dalam MRSB (deMan Rogosa Sharp Broth), diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam, dan dipanen pada fase log (fase pertumbuhan). Sel-sel bakteri dipisahkan melalui sentrifugasi dingin (pada suhu 4 C, 10 000 G selama 20 menit). Sel dari 50 ml broth dilarutkan pada 100 ml larutan 10% susu skim (w/v), 5% gliserol (v/v) dan 0.1% CaCO3 (w/v), inulin 2% (untuk L. acidophilus dan B. longum), kemudian diperangkap selama 45 menit di dalam 100 ml larutan alginat steril dengan konsentrasi 3%. Campuran tersebut diteteskan pada larutan CaCl2 0.1 M menggunakan spuit selama satu jam. Gel yang terbentuk dipindahkan ke dalam larutan NaCl fisiologis (0.85%) untuk mengompakkan struktur gel. Gel-gel yang terbentuk selanjutnya dimasukkan ke air destilasi dan diputar secara perlahan selama satu jam untuk menghilangkan residu CaCl2. Pengeringan butiran gel hasil enkapsulasi menggunakan alat freeze dry. Karakterisasi hasil enkapsulasi meliputi pengamatan terhadap morfologi dan ukuran partikel dengan menggunakan scanning electron microscope (SEM).
Pembuatan Kultur Starter dengan Probiotik Terenkapsulasi dalam Bentuk Granul (Ansel 1989; Fardiaz 1992)
Pembuatan kultur starter dalam bentuk granul dengan probiotik terenkapsulasi diawali dengan inokulasi kultur starter yang digunakan, yaitu
S. thermophilus (St RRM-01) dan L. bulgaricus (Lb RRM-01) sebagai kultur starter yogurt, serta L. plantarum (Lp RRM-01) sebagai kultur starter dadih sebanyak 5% v/v kedalam susu skim cair steril untuk menghasilkan kultur kerja. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C dengan lama inkubasi sesuai dengan fase logaritmik masing-masing kultur starter. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan jumlah dan kondisi kultur starter yang optimal dan juga untuk menghindari fase
lag atau fase adaptasi yang terlalu lama sebelum aktif memfermentasi susu. Waktu inkubasi S. thermophilus (St RRM-01) dan L. bulgarigus (Lb RRM-01) selama 10 jam dan L. plantarum (Lp RRM-01) diinkubasi selama 14 jam. Selanjutnya setelah waktu inkubasi berakhir, ditambahkan maltodekstrin 4% sebagai bahan pengisi dan laktosa 6% sebagai zat pelindung, kemudian dihomogenkan dengan cara pengadukan. Bubuk kultur starter kering diperoleh melalui proses pengeringan dengan metode spray dry (suhu inlet 180 C dan outlet 80 C).
Bubuk kultur starter yang diperoleh kemudian diproses lanjut untuk menghasilkan granul dengan metode granulasi basah. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan formulasi granul kultur starter terdiri atas kultur starter dalam bentuk bubuk hasil spray dry, probiotik terenkapsulasi kering hasil
freeze dry, laktosa, larutan sukrosa 60% (b/v) sebagai bahan pengikat dan digunakan hingga granul terasa lembab, sodium starch glycolate (SSG) dan susu skim. Tahapan proses granulasi basah terdiri atas penimbangan bahan-bahan yang digunakan, pencampuran hingga homogen, penambahan larutan sukrosa sebagai larutan pengikat, dan pengayakan tahap pertama dengan ayakan ukuran 12 mesh.
Hasil ayakan dikeringkan dengan oven 40 C selama 2 jam. Setelah itu dilakukan pengayakan tahap kedua menggunakan ayakan ukuran 20 mesh. Tahapan pembuatan kultur starter yogurt dan dadih dalam bentuk granul berturut-turut ditunjukkan pada Gambar 6 dan 7. Tabel 3 dan 4 menunjukkan formulasi kultur starter dalam bentuk granul pada produk yogurt dan dadih.
Tabel 3 Formulasi granul kultur starter yogurt
Bahan Granul Formulasi (%)
YL21S1 YL20S2 YL19S3
Bakteri kultur starter:
S. thermophilus 25 25 25 L. bulgaricus 25 25 25 Bakteri probiotik: L. acidophilus 1 1 1 B. longum 1 1 1 Laktosa 21 20 19 Susu skim 26 26 26
Sodium starch glycolate 1 2 3
Tabel 4 Formulasi granul kultur starter dadih
Bahan Granul Formulasi (%)
DL21S1 DL20S2 DL19S3
Bakteri kultur starter:
L. plantarum 50 50 50 Bakteri probiotik: L. acidophilus 1 1 1 B. longum 1 1 1 Laktosa 21 20 19 Susu skim 26 26 26
Sodium starch glycolate 1 2 3
Total 100 100 100
Gambar 5 Tahapan proses enkapsulasi bakteri probiotik L. acidophilus (La RRM-01) atau B. longum (Bl RRM-01).
pemisahan sel-sel bakteri melalui sentrifugasi dingin (suhu 4 C 10 000 G selama 20 menit)
dipanen pada fase logaritmik
sel dari 50 ml broth dilarutkan pada 100 ml larutan (10% susu skim bubuk, 5% gliserol dan 0.1% CaCO3, inulin 2% sebagai prebiotik
untuk L. acidophilus dan B. longum)
campuran tersebut diteteskan pada pada larutan CaCl2 0.1 M dengan spuit hingga membentuk gel
pengeringan (freeze dry) biokapsul inokulasi pada MRSB Isolat bakteri probiotik
inkubasi pada suhu 37 C sesuai dengan waktu yang diperoleh pada optimasi
diperangkap selama 45 menit dialam 100 ml larutan alginat steril dengan konsentrasi 3%
Gambar 6 Tahapan pembuatan kultur starter yogurt dalam bentuk granul.
Gambar 7 Tahapan pembuatan kultur starter dadih dalam bentuk granul. Biokapsul L. acidophilus
dan B. longum (inulin 2%) Inkubasi (10 jam)
Susu + S. thermophilus Susu + L. bulgaricus
Inkubasi (10 jam)
Penepungan (metode spray dry) Penepungan (metode spray dry)
Homogenisasi (pencampuran)
Starter yogurt bubuk
Formulasi granul
Starter yogurt dalam bentuk granul
Biokapsul L. acidophilus dan B. longum (inulin 2%)
Susu + L. plantarum Inkubasi (14 jam) Penepungan (metode spray dry)
Starter dadih bubuk
Formulasi granul
Starter dadih dalam bentuk granul
Penentuan Jumlah Koloni Kultur Starter dan Bakteri Probiotik
Jumlah koloni kultur starter dan bakteri probiotik ditentukan dengan metode hitungan cawan, untuk melaporkan hasil analisis digunakan Standard Plate Count (SPC). Pengambilan data populasi dilakukan saat awal akan dilakukan proses pengeringan (bakteri probiotik menggunakan freeze dry dan kultur starter menggunakan spray dry) dan setelah pengeringan dengan proses pemupukan. Pemupukan dilakukan dengan media deMan Rogosa Sharpe Agar
(MRSA) dengan cara 1 ml inokulan dipipet ke dalam cawan Petri steril dan selanjutnya medium MRSA yang telah dingin (suhu kira kira 37 C) dituangkan ke dalam cawan Petri steril tersebut sebanyak 12–15 ml. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara cawan Petri digerakkan dengan arah membentuk angka delapan. Cawan Petri diinkubasikan setelah agar mengeras, dengan posisi terbalik pada suhu 37 C selama 24–48 jam. Pengujian populasi bakteri probiotik sebelum dan sesudah dikeringbekukan serta bakteri kultur starter sebelum dan sesudah dikeringkan dengan metode semprot dihitung dan dianalisis dengan menggunakan t-test. Jumlah koloni per gram dihitung dengan rumus :
Jumlah koloni/g = Jumlah koloni per cawan ×
n pengencera faktor
1
Total Plate Count (Dewan Standardisasi Nasional 1992)
Pemupukan dilakukan dengan media Plate Count Agar (PCA) dengan cara 1 ml inokulan dipipet ke dalam cawan Petri steril dan selanjutnya medium PCA yang telah dingin (suhu kira kira 40–50 C) dituangkan ke dalam cawan Petri steril tersebut sebanyak 12–15 ml. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara cawan Petri digerakkan membentuk angka delapan. Cawan Petri diinkubasikan setelah agar mengeras dengan posisi terbalik pada suhu 37 C selama 24–48 jam. Jumlah bakteri ditentukan dengan metode hitungan cawan dan untuk melaporkan hasil analisis digunakan Standard Plate Count (SPC).
Jumlah Bakteri Koliform (Dewan Standardisasi Nasional 1992)
Penentuan jumlah koliform dilakukan dengan cara sebanyak 1 ml dari inokulan dipipet ke dalam cawan Petri steril dan dipupukkan sebanyak 10–15 ml
media VRBA (suhu antara 45–48 C). Cawan Petri dihomogenkan dengan cara digerakkan membentuk angka delapan, setelah memadat sebanyak 3–4 ml media VRBA cair dituangkan kembali (overlay) di atas permukaan agar. Setelah media mengeras cawan Petri diinkubasikan pada posisi terbalik pada suhu 37C selama 24–48 jam. Jumlah mikroba ditentukan dengan metode hitungan cawan dan untuk melaporkan hasil analisis digunakan Standart Plate Count (SPC).
Prosedur Pengujian Kualitas Fisik Granul Kultur Starter serta Aplikasinya
Waktu Larut (Wells 1987)
Sampel granul sebanyak 10 g diukur waktu larutnya dengan cara memasukkan sampel ke dalam 60 ml air dalam gelas ukur bersamaan dengan dimulainya perhitungan waktu dengan menggunakan stopwatch. Kelarutan dinyatakan dalam menit.
Indeks Kompresibilitas (Wells 1987)
Sampel granul sebanyak 50 g dimasukkan dalam gelas ukur 100 ml, lalu diukur volumenya (V1). Berat jenis bulk = m/V1. Massa dalam gelas ukur diketuk-ketukkan dari ketinggian 2.5 cm sampai volume tetap (V2). Berat jenis mampat = m/V2. Kriteria indeks kompresibilitas diperlihatkan pada Tabel 5. Persamaan yang digunakan untuk menentukan indeks kompresibilitas adalah:
Indeks kompresibilitas (%) = 100% mampat jenis berat bulk jenis berat -mampat jenis berat
Tabel 5 Kriteria indeks kompresibilitas
Indeks kompresibilitas (%) Kategori laju alir < 10 Istimewa 10 – 15 Baik 16 – 20 Sedang 21 – 25 Cukup baik 26 – 31 Jelek 32 – 37 Sangat Jelek >38 Sangat-sangat jelek Sumber : United State Pharmacopeia (2005)
Nilai pH (Apriyantono et al. 1989)
Pengukuran pH menggunakan pH meter yang distandardisasi dengan larutan buffer pH 4 dan 7 sebelum digunakan. Sampel sebanyak 10 ml diambil, kemudian elektroda dibilas dengan air aquades. Elektroda dikeringkan dengan kertas tisue kemudian dicelupkan ke dalam sampel. Elektroda dibiarkan tercelup beberapa saat. Nilai yang dibaca adalah nilai saat pH meter telah stabil.
Total Asam Tertitrasi (Fardiaz 1992)
Pengukuran total asam tertitrasi menggunakan prinsip asam basa. Sampel sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer kemudian ditambahkan 2– 3 tetes indikator phenolphtalein 1%. Sampel dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N sampai terbentuk warna merah muda dan tidak hilang dalam waktu 30 detik.
Total Asam Tertitrasi (%) = 100%
sampel V ) 1000 90 ( NaOH N NaOH V Viskositas (Rahman et al. 1992)
Pengukuran viskositas menggunakan alat rotational viscometer (Rion Viscotester VT-04F). Sampel sebanyak 100 ml dimasukkan ke dalam tempat yang tersedia. Rotor dicelupkan ke dalam sampel dan dibiarkan berputar sampai jarum skala penunjuk berhenti pada skala tertentu. Skala yang terbaca menunjukkan viskositas dari sampel dengan satuan viskositas adalah dPa.s.
Rancangan Penelitian dan Analisis Data
Rancangan penelitian yang digunakan untuk menganalisis penentuan formula terbaik masing-masing produk susu fermentasi adalah rancangan acak lengkap dengan 3 ulangan. Penentuan formula terbaik berdasarkan imbangan laktosa : sodium starch glycolate (SSG) dinotasikan sebagai berikut: L21S1, L20S2
dan L19S3 dan evaluasi granul (kompresibilitas dan daya larut). Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam atau analysis of variance (ANOVA) (Steel dan Torrie 1993) dan bila perlakuan berpengaruh nyata terhadap peubah yang diukur, maka dilanjutkan dengan Duncan Multiple Range Test (uji Duncan) untuk mengetahui perbedaan diantara perlakuan tersebut. Data pH, total asam
tertitrasi dan viskositas dianalisis menggunakan uji non-parametrik Kruskal-Wallis. Penentuan formula terbaik dilakukan dengan pemberian nilai (skoring) terhadap peubah yang dianalisis. Pemberian nilai meliputi aspek mikrobiologis granul dan aplikasi produk (populasi BAL, LA dan BL tertinggi); evalusi granul (kompresibilitas sesuai standar yang ada dan waktu larut) serta nilai pH, total asam tertitrasi sesuai standar yang ada dan viskositas. Jika diperoleh hasil yang berada dalam kisaran standar, maka diberi nilai yang sama yaitu 5. Apabila hasil yang diperoleh tidak berada dalam kisaran standar, maka pemberian nilai berdasarkan peringkat hasil terbaik. Formula terbaik imbangan laktosa : sodium starch glycolate (SSG) yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk penyimpanan granul kultur starter. Penentuan nilai (skoring) berdasarkan standar produk ditunjukkan pada Tabel 6.
Tabel 6 Penentuan nilai berdasarkan standar produk
Kriteria penilaian Standar produk Penentuan nilai Kualitas mikrobiologis:
- Populasi BAL granul dan aplikasi produk
107 CFU/g* 1. Berada dalam kisaran standar diberi nilai 5 2. Jika tidak ada yang
berada dalam kisaran standar, penilaian berdasarkan peringkat hasil terbaik (nilai tertinggi 5 dan nilai terendah 1)
- Populasi LA granul dan aplikasi produk
107 CFU/g* - Populasi BL granul dan
aplikasi produk
107 CFU/g* Evaluasi granul:
- Kompresibilitas Sesuai kriteria**
- Waktu larut Belum ada
Aplikasi produk:
- pH 4.2–4.6***
- Total asam tertitrasi 0.5–2.0%****
- Viskositas Belum ada
Ket : * = Sultana et al. (2000)
** = United State Pharmacopeia (2005) *** = Sudarmadji et al. (1989)
**** = Dewan Standardisasi Nasional (1992)
Tahap III Penyimpanan dan Evaluasi Kualitas Granul Kultur Starter serta