METODE PENELITIAN
3.3 Prosedur Kerja
3.3.5 Pembuatan media
3.3.5.3 Pembuatan media perlakuan
Pembuatan media perlakuan diawali dengan proses yang sama ketika membuat media kontrol (MS0+BAP1,5). Akan tetapi untuk media perlakuan pada larutan MS0+BAP1,5 ditambahkan antibiotika berupa PPM dan/atau propolis sesuai dengan perlakuan yakni sebesar 0 ml/l, 0,5 ml/l, 1ml/l, 1,5 ml/l dan 2 ml/l. Penambahan antibiotika ini (PPM dan/atau propolis) dilakukan sebelum larutan MS0+BAP1,5 diencerkan dengan air aquades hingga volume akhir 1 liter terdapat pada media yang sudah lengkap.
Setelah larutan media perlakuan selesai dibuat, larutan tersebut lalu diukur dengan menggunakan pH meter. Pada umumnya pH media yang digunakan yakni 5,6-5,8, bila larutan Ph>5,8 maka dilakukan penambahan HCL dan jika pH< 5,6 maka dilakukan penambahan NAOH. Selanjutnya larutan media ditambahkan dengan agar-agar sebanyak 6 gr/l dan dimasak hingga mendidih. Setelah itu larutan dituang kedalam botol-botol kultur sebanyak 10 ml. Lalu botol ditutup dengan rapat dan beri label. Langkah selanjutnya yaitu melakukan sterilisasi media tersebut dalam autoclave pada suhu 121⁰C-126⁰C dengan 1,5 atm selama 20 menit.
3.3.6 Penanaman
Penanaman eksplan pulai dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Setelah dilakukan sterilisasi pada eksplan kemudian eksplan dimasukan ke dalam petridish dan potong bagian tumbuhan yang terkena bahan sterilan lalu tanam dalam media kultur, setelah selesai penanaman botol kultur diletakan dalam ruang kultur.
3.4 Pengamatan
Pengamatan dilakukan selama kurang lebih 8 minggu setelah tanam dan pengambilan data dilakukan setiap satu minggu sekali. Hal yang diamati yaitu : - Jumlah eksplan yang hidup ditandai dengan jumlah eksplan yang berwarna
kehijauan.
- Jumlah eksplan yang mati ditandai dengan jumlah eksplan yang mengalami browning (pencoklatan) atau berwarna merah dan tidak muncul tunas.
- Jumlah eksplan yang mengalami kontaminasi ditandai dengan adanya jamur (cendawan) dan bakteri.
Selain itu, untuk mengetahui pengaruh pemberian antibiotika pada pertumbuhan eksplan pulai maka dilakukan pengamatan terhadap :
- Jumlah tunas yang tumbuh - Pertambahan tinggi tunas - Jumlah daun yang tumbuh
3.5 Rancangan Percobaan
Percobaan ini dilakukan pada tahap inisiasi dengan jenis eksplan pucuk. Adapun rancangan percobaan ini dirancang dengan menggunakan percobaan faktorial dua faktor dengan dasar rancangan acak lengkap (RAL). Faktor pertama adalah jenis antibiotika yang terdiri dari : Plant preservative mixture (PPM) dan Propolis. Faktor yang kedua yakni konsentrasi yang terdiri dari lima taraf yaitu 0ml/l, 0,5 ml/l, 1 ml/l, 1,5 ml/l, dan 2 ml/l. Dengan demikian terdapat 52 = 25 perlakuan dan setiap perlakuan terdiri dari 10 ulangan sehingga seluruhnya terdapat 250 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri dari satu botol
yang berisi satu eksplan. Berikut merupakan gambaran interaksi antar faktor dari percobaan yang dilaksanakan :
Tabel 4. Interaksi faktor jenis antibiotika dengan konsentrasinya PPM (ml/l)
(A)
Propolis (ml/l) (B)
0 (B0) 0,5 (B1) 1 (B2) 1,5 (B3) 2 (B4)
0 (A0) A0B0 A0B1 A0B2 A0B3 A0B4
0,5 (A1) A1B0 A1B1 A1B2 A1B3 A1B4
1 (A2) A2B0 A2B1 A2B2 A2B3 A2B4
1,5 (A3) A3B0 A3B1 A3B2 A3B3 A3B4
2 (A4) A4B0 A4B1 A4B2 A4B3 A4B4
Keterangan : A0B0 = Kontrol
3.6 Analisis Data
Perhitungan parameter kualitatif meliputi persentase kontaminasi oleh jamur dan bakteri, browning (pencoklatan), dan kematian pada eksplan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
%Tingkat kontaminasi = ∑eksplan yang terkontaminasi x 100% N
%Tingkat pencoklatan = ∑eksplan yang mengalami pencoklatan x 100% N
%Tingkat kematian = ∑eksplan yang mengalami kematian x 100% N
%Tingkat keberhasilan = ∑eksplan yang bertunas x 100% N
Keterangan : N adalah jumlah total eksplan yang tersedia pada setiap perlakuan
Adapun model linear rancangan percobaan yang digunakanyaitu sebagai berikut (Mattjik & Sumertawijaya 2002) :
Dimana : i = 1,2 j = 1,2,3,4,5
k = 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10
Keterangan :
Yijk : Hasil pengamatan terhadap eksplan Alstonia scholaris (L) R.Br
pada pengaruh jenis antibiotika ke-i, konsentrasi ke-j, dan ulangan ke-r
µ : Nilai tengah umum (rata-rata populasi)
αi : Pengaruh perlakuan antibiotika ke-i
βj : Pengaruh perlakuan konsentrasi antibiotika ke-j
(αβ)ij : Pengaruh interaksi perlakuan antibiotika ke-i dan konsentrasi ke-j
εijk : Pengaruh acak pada perlakuan antibiotika ke-i, konsentrasi ke-j dan
ulangan ke-r.
Hipotesis : H0 : P1 = P2= Pi= 0
H1 : ada satu Pi≠ 0
Uji Hipotesis :
Terima H0 = Perbedaan taraf pemberian antibiotika pada kultur tidak
berpengaruh nyata terhadap tingkat kontaminasi pada selang kepercayaan
95% (α=0,05)
Terima H1 = Sekurang-kurangnya ada taraf pemberian antibiotika pada kultur
yang berpengaruh nyata terhadap tingkat kontaminasi pada selang
kepercayaan 95% (α= 0,05)
Untuk mengetahui pengaruh yang diberikan pada percobaan dilakukan uji- F yang diperoleh dari hasil analisis ragam atau analysis of variance (ANOVA).
Kemudian dibandingkan dengan F tabel pada selang kepercayaan 95% (α=0,05)
dengan kaidah :
1. Jika F hitung < F tabel maka H0 diterima, H1 ditolak sehingga pemberian
antibiotika pada kultur tidak berpengaruh nyata terhadap tingkat kontaminasi.
2. Jika F hitung > F tabel maka H0 ditolak H1 diterima sehingga pemberian
Jika sidik ragam memberikan hasil berpengaruh nyata, selanjutnya dilakukan uji Duncan untuk mengetahui beda antar perlakuan. Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SPSS 16.0.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Tingkat Keberhasilan Kultur
Kultur in vitro pulai merupakan salah satu metode perbanyakan yang dikembangkan dalam upaya konservasi tumbuhan pulai. Pemanfaatan perbanyakan tumbuhan pulai menggunakan metode tersebut juga tidak terhindar dari permasalahan umum yang terjadi dalam kultur in vitro. Adapun permasalahan tersebut yakni kontaminasi baik yang berasal dari bakteri maupun jamur. Penambahan antibiotika pada media merupakan salah satu upaya yang dilakukan untuk mengurangi tingkat kontaminasi yang terjadi pada kultur in vitro. Antibiotika adalah senyawa kimia khas yang dihasilkan atau diturunkan oleh organisme hidup, termasuk struktur analognya yang dibuat secara sintetik, yang dalam kadar rendah mampu menghambat proses penting dalam kehidupan satu spesies atau lebih mikroorganisme (Siswandono & Soekardjo 1995). Adapun jenis antibiotika yang ditambahkan pada media kultur in vitro dalam penelitian ini yaitu antibiotika alami (propolis), antibiotika sintetik (Plant Preservative Mixture atau PPM) dan kombinasi dari kedua antibiotika tersebut.
Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan selama 8 minggu dengan 25 jenis media perlakuan didapatkan hasil sebagai berikut (Gambar 1). Adapun persentase keberhasilan tiap perlakuan beragam mulai dari yang terkecil 10% hingga yang tertinggi yaitu 70%. Sedangkan untuk rata-rata persentase keberhasilan totalnya yaitu 50,60% atau berkisar 126 eksplan yang berhasil tumbuh. Berdasarkan gambar grafik yang disajikan dapat diketahui bahwa jenis media dengan persentase keberhasilan tertinggi terdapat pada jenis media perlakuan PPM:0 ml/l + Propolis:1 ml/l (A0B2), PPM:0,5 ml/l + Propolis:0,5 ml/l (A1B1), PPM:0,5 ml/l + Propolis: 2 ml/l (A1B4), PPM:1 ml/l + Prop:0ml/l (A2B0), PPM:1 ml/l + Propolis:0,5 ml/l (A2B1), PPM:1 ml/l + Propolis:1 ml/l (A2B2), PPM:2 ml/l + Prop:0ml/l (A4B0) (Gambar 2 ).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 A0B0 A0B1 A0B2 A0B3 A0B4 A1B0 A1B1 A1B2 A1B3 A1B4 A2B0 A2B1 A2B2 A2B3 A2B4 A3B0 A3B1 A3B2 A3B3 A3B4 A4B0 A4B1 A4B2 A4B3 A4B4 Persentase keberhasilan (%) P e r lak u an
Gambar 2 Persentase keberhasilan per media perlakuan.
Berdasarkan hasil pengamatan secara visual terhadap eksplan, perlakuan penambahan PPM 0,5ml/l dan propolis 0,5 ml/l (A1B1) memperlihatkan pertumbuhan dan perkembangan yang lebih baik dari pada 6 jenis perlakuan dengan persentase keberhasilan tumbuh tertinggi yang lain.
4.2 Perlakuan Penambahan Propolis
Berdasarkan hasil pengamatan pada perlakuan penambahan propolis dapat diketahui bahwa perlakuan penambahan propolis 1 ml/l (A0B2) merupakan salah satu perlakuan yang menghasilkan persentase keberhasilan tumbuh yang tertinggi.
Sedangkan penambahan propolis 2 ml/l (A0B4) merupakan perlakuan dengan persentase keberhasilan tumbuh yang terendah.
Perlakuan penambahanantibiotika propolis 1 ml/l (A0B2) menghasilkan eksplan dengan tingkat kontaminasi yang cukup rendah karena di dalam propolis terdapat kandungan zat aktif yang bersifat antibiotika seperti asam ferulat yang efektif terhadap bakteri gram positif dan negatif (Winingsih 2004 diacu dalam Suseno 2009). Dari adanya kandungan zat aktif tersebut maka dengan penambahan propolis pada media dapat menghambat pertumbuhan bakteri yang ada. Selain itu, propolis juga memiliki kandungan senyawa aktif antifungi dan antiviral yang mampu menghambat pertumbuhan jamur dan serangan virus. Hasil pengamatan visual terhadap eksplan pada perlakuan menunjukkan adanya respon yang positif terhadap pertumbuhan eksplan. Hal ini ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan tunas, pertambahan tinggi tunas dan jumlah daun yang tumbuh memiliki kondisi yang baik. Winingsih (2004) diacu dalam Saputra (2009) menyatakan bahwa kelebihan propolis sebagai antibiotika alami dibandingkan dengan bahan sintetik yaitu lebih aman serta dengan efek samping yang relatif kecil. Hal ini karena propolis memiliki daya selektivitas yang tinggi sebagai antibiotika sehingga cara kerja propolis yaitu melawan bakteri berbahaya tanpa membinasakan bakteri yang dibutuhkan.
Persentase keberhasilan kultur yang terendah terdapat pada media perlakuan penambahan propolis 2 ml/l (A0B4). Rendahnya persentase keberhasilan pada perlakuan yang diberi penambahan ppm 0ml/l dan propolis 2ml/l diduga karena terlalu tingginya konsentrasi propolis yang ditambahkan ke dalam media. Darmono (2003) menyatakan bahwa pemberian konsentrasi antibiotika yang terlalu tinggi pada tanaman dapat menyebabkan terjadinya efek fitotoksik pada tanaman sehingga dapat menyebabkan kematian. Tingginya tingkat kontaminasi pada perlakuan ini diduga karena propolis merupakan bahan antibiotika alami yang bersifat tidak membunuh bakteri dan jamur, namun hanya bersifat pengendalian atau menghambat pertumbuhan bakteri dan jamur. Abidin (2010) menyatakan bahwa propolis pada konsentrasi tertentu memiliki peranan simbiotik terhadap beberapa spesies bakteri probiotik. Berdasarkan hasil penelitian Abidin (2010) diketahui bahwa pada konsentrasi 0,6% propolis mampu
menstimulasi pertumbuhan bakteri Lactobacillus casei subsp. Rhamnosus dan aktivitas bakteri Streptococcus thermophillus yaitu dengan menstimulasi produksi asam laktat. Hasil pengamatan visual pada eksplan yang berhasil steril, ditemukan bahwa eksplan tersebut tidak mengalami pertumbuhan maupun perkembangan sehingga tunas yang tumbuh dari eksplan tersebut pun tidak mengalami perubahan. Fenomena tersebut dapat disebut bahwa eksplan yang ditanam mengalami stagnasi. Santoso dan Nursandi (2003) menyatakan bahwa stagnasi pertumbuhan dapat disebabkan oleh penggunaan bahan yang tidak merismatik atau potensial merismatik. Selain itu juga dapat disebabkan oleh tindakan sterilisasi yang berlebihan, media yang tidak cocok atau llingkungan yang tidak mendukung.
4.3 Perlakuan Penambahan Plant Preservative Mixture (PPM)
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa dari 4 jenis perlakuan penambahan antibiotika PPM dihasilkan 2 jenis perlakuan yang memperoleh persentase keberhasilan tumbuh tertinggi yakni penambahan PPM 1ml/l (A1B0) dan 2 ml/l (A2B0). Perlakuan A1B0dan A2B0mendapatkan hasil yang baik dengan persentase keberhasilan yang cukup tinggi (70%). Hal ini menunjukkan bahwa penambahan antibiotika PPM dengan konsentrasi 1ml/l dan 2 ml/l pada media mampu memberikan respon yang positif terhadap adanya kontaminasi pada eksplan dan pertumbuhan eksplan sendiri. Plant Preservative Mixture (PPM) merupakan biosida dengan spektrum yang luas sehingga mampu mencegah atau menurunkan tingkat kontaminasi mikroba pada kultur jaringan. Syatria (2010) menyatakan bahwa bahan aktif yang ada dalam PPM dapat menghambat tumbuhnya jamur atau menembus dinding sel bakteri dan menghambat aktivitas enzim kunci dalam siklus metabolisme sentral seperti siklus asam sitrat dan transpor elektron. Selain itu juga dapat menghambat proses pengangkutan monosakarida dan asam amino dari medium ke dalam sel bakteri. Adapun kandungan zat aktif yang terkandung dalam ppm yakni 5-Chloro-2 methyl-3- (CH)-isothiazolone 0,1350 % dan 2-methyl-3(H)-isothiazolone 0,0412% dan komposisi lain 99,82338%. Syatria (2010) mengemukakan bahwa dosis
penggunaan PPM yang baik berdasar rekomendasi pabrik yaitu konsentrasi antara 1-2 ml/l media.
4.4 Perlakuan Kombinasi Propolis dan Plant Preservative Mixture (PPM) Hasil pengamatan menunjukkan bahwa dari 16 jenis kombinasi propolis dan PPM dengan masing-masing konsentrasinya didapatkan 4 jenis kombinasi yang menghasilkan tingkat keberhasilan tumbuh tertinggi yakni kombinasi PPM 0,5 ml/l dan propolis 0,5 ml/l (A1B1), kombinasi PPM 0,5 ml/l dan propolis 2 ml/l (A1B4),kombinasi PPM 1 ml/l dan propolis 0,5 ml/l (A2B1),serta kombinasi PPM dan propolis 1 ml/l (A2B2)
Penambahan PPM 0,5 ml/l dan propolis 0,5 ml/l (A1B1) mampu menghasilkan persentase keberhasilan yang cukup tinggi dikarenakan adanya kandungan zat aktif pada propolis dikombinasikan dengan kandungan zat antibiotika yang ada pada PPM dapat menghambat pertumbuhan dari bakteri maupun jamur.Plant Preservative Mixture (PPM) merupakan antibiotika sintetik yang memiliki spektrum luas sehingga mampu menghambat pertumbuhan bakteri gram positif maupun gram negatif. Sedangkan propolis merupakan antibiotika alami yang juga memiliki spektrum luas dan mampu menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif dan positif. Selain itu terdapat kandungan zat antibakteri, di dalam propolis juga terdapat kandungan zat antifungi dan antiviral. Pada konsentrasi ini antara antibiotika PPM dan propolis mampu bekerja secara efektif untuk menghambat pertumbuhan bakteri ataupun jamur. Pengamatan secara visual, memperlihatkan bahwa hasil pertumbuhan eksplan dalam perlakuan ini memiliki pertumbuhan yang cukup baik dengan adanya pertambahan tinggi tunas tiap minggu, jumlah tunas yang tumbuh cukup banyak
Adanya kombinasi perlakuan penambahan PPM 0,5 ml/l dan propolis 2 ml/l (A1B4) dilihat dari perhitungan persentase keberhasilan memiliki persentase yang cukup tinggi. Hal tersebut diduga pada penambahan antibiotika dengan perbandingan konsentrasi tersebut mampu menghambat terjadinya pertumbuhan bakteri, namun masih kurang efektif dalam proses menghambat pertumbuhan jamur karena 3 eksplan dari 10 eksplan yang terkontaminasi disebabkan oleh tumbuhnya jamur. Untuk pertumbuhan eksplan pada perlakuan ini sebagian besar
kurang terlalu baik karena jumlah tunas dan daun serta pertambahan tinggi tunas pada tiap minggunya tidak terlalu berbeda.
Perlakuan penambahan PPM 1 ml/l dan propolis 0,5 ml/l (A2B1) berdasarkan hasil perhitungan persentase keberhasilan memperlihatkan persentase yang cukup baik yakni sebesar 70%. Hal ini, selain disebabkan karena antibiotika PPM dan propolis yang bersifat antibakteri dan antifungi juga karena perbandingan konsentrasi yang diberikan masih dalam selang pemberian konsentrasi yang efektif untuk menghambat terjadinya pertumbuhan bakteri dan jamur. Adanya kombinasi antibiotika pada konsentrasi tersebut memberikan hasil yang baik pula pada pertumbuhan eksplan. Kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri dan jamur yang terjadi pada perlakuan ini cukup kecil yakni masing- masing hanya 10%.
Berdasarkan hasil perhitungan persentase keberhasilan kombinasi penambahan PPM dan propolis 1 ml/l (A2B2) pada media juga menghasilkan persentase keberhasilan yang cukup tinggi. PPM dan propolis merupakan antibiotika yang sama-sama memiliki spektrum luas sehingga mampu menghambat terjadinya pertumbuhan bakteri gram positif dan negatif. Diduga adanya kombinasi dari antibiotika sintetik dan alami mampu memberikan respon positif terhadap adanya kontaminasi baik berasal dari bakteri maupun jamur yang terjadi pada kultur jaringan pulai. Adanya konsentrasi 1 ml/l pada masing-masing antibiotika yang ditambahkan pada media juga merupakan konsentrasi yang umumnya efektif ditambahkan pada media untuk menekan terjadinya kontaminasi. Berdasarkan hasil pengamatan visual terhadap eksplan pada perlakuan ini, walaupun persentase keberhasilannya cukup tinggi namun terdapat 3 eksplan dari 7 eksplan yang steril mengalami stagnasi dalam pertumbuhan. Hal ini diduga terjadi karena adanya penambahan PPM dan propolis dengan konsentrasi yang cukup tinggi sehingga membuat media menjadi kurang cocok untuk pertumbuhan dari eksplan itu sendiri. Santoso dan Nursandi (2003) menyatakan bahwa adanya stagnasi pertumbuhan dapat disebabkan karena adanya tindakan sterilisasi yang berlebihan dan media yang tidak cocok.
4.5 Hasil Analisis Sidik Ragam
Hasil analisis sidik ragam pada selang kepercayaan 95%, menunjukkan bahwa nilai F hitung lebih kecil dari F tabel, sehingga keputusan yang diambil adalah menerima hipotesis nol. Hal ini berarti pemberian antibiotika pada kultur tidak berpengaruh nyata terhadap tingkat kontaminasi yang terjadi pada kultur in vitro pulai (Tabel 5), sehingga tidak perlu dilakukan uji lanjut wilayah Duncan. Hal ini diduga karena adanya jumlah ulangan yang tidak terlalu banyak sehingga kurang memberikan hasil yang optimal. Selain itu, waktu pengamatan 8 minggu diduga masih belum optimal untuk pengamatan kultur pohon dikarenakan jenis pohon berkayu merupakan jenis yang pertumbuhannya lebih lambat dibandingkan dengan tanaman pertanian.
Tabel 5. Rekapitulasi hasil analisis sidik ragam tingkat kontaminasi pada kultur in vitro pulai
Signifikansi minggu ke-
1 2 3 4 5 6 7 8
Perlakuan 0.716 0.906 0.972 0.928 0.882 0.805 0.737 0.737
Keterangan : Signifikansi lebih dari 0,05, tidak berpengaruh nyata
Walaupun berdasarkan hasil analisis sidik ragam pemberian antibiotika tidak memberikan pengaruh yang nyata, namun hasil pengamatan menunjukkan bahwa dengan pemberian antibiotika pada konsentrasi tertentu menghasilkan tingkat keberhasilan kultur steril dan tumbuh yang lebih tinggi dibandingkan dengan dengan kontrol. Hal ini, berarti pemberian antibiotika pada konsentrasi tertentu (PPM:0 ml/l + Propolis:1 ml/l (A0B2), PPM:0,5 ml/l + Propolis:0,5 ml/l (A1B1), PPM:0,5 ml/l + Propolis: 2 ml/l (A1B4), PPM:1 ml/l + Prop:0ml/l (A2B0), PPM:1 ml/l + Propolis:0,5 ml/l (A2B1), PPM:1 ml/l + Propolis:1 ml/l (A2B2), PPM:2 ml/l + Prop:0ml/l (A4B0)) memberikan pengaruh yang positif terhadap tingkat keberhasilan kultur in vitro pulai.
Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan dapat diketahui bahwa dari total 250 eksplan yang ditanam terdapat 126 eksplan yang tumbuh atau sekitar 50,4%. Kemudian diikuti oleh kondisi eksplan yang terkontaminasi oleh jamur sebanyak 74 eksplan dan kontaminasi bakteri sebesar 30 eksplan. Fenomena pencoklatan juga dapat ditemukan pada penelitian ini dengan jumlah 16 eksplan. Presentase terkecil terdapat pada kondisi eksplan yang gugur. Gugur
50,40% 12,00% 29,60% 6,40% 1,60% Tumbuh Bakteri Jamur Browning Gugur
yang terjadi pada eksplan disini 3 dari 4 eksplan gugur pada minggu ke-5 setelah tanam dan 1 eksplan gugur pada minggu ke-8 setelah tanam. Hal ini diduga disebabkan karena terjadinya proses metabolisme yang lebih besar daripada proses fotosintesis sehingga bahan makanan yang diserap lebih sedikit daripada yang dibutuhkan.Adapun persentase total kondisi eksplan dari hasil pengamatan yakni dapat dilihat pada gambar 3 dan gambaran dari eksplan pada gambar 4.
Gambar 3 Persentase total kondisi eksplan.
(a) (b) (c)
(d) (e)
Gambar 4 Kondisi eksplan; (a) eksplan tumbuh, (b) eksplan terkontaminasi bakteri, (c) eksplan terkontaminasi jamur, (d) eksplan browning, (e) eksplan gugur.
4.6 Kontaminasi Jamur
Kontaminasi merupakansalah satu gangguan yang umum terjadi pada kultur jaringan (Santoso & Nursandi 2003). Berdasarkan hasil penelitian persentase kontaminasi total yang terjadi sebesar 41,6% yang terbagi ke dalam dua jenis penyebab kontaminasi yaitu jamur sebesar 29,60% dan bakteri 12%. Dari total 104 eksplan yang mengalami kontaminasi 72,82% diantaranya disebabkan karena jamur (Gambar 5).Wudianto (2002) diacu dalam Gunawan (2007) menyatakan bahwa jamur atau cendawan pada umumnya berbentuk seperti benang halus yang tidak bisa dilihat dengan mata telanjang. Akan tetapi, kumpulan dari benang halus yang disebut miselium ini dapat dilihat dengan jelas.
Gambar 5 Eksplan terkontaminasi jamur
Kematian eksplan akibat kontaminasi jamur umumnya terjadi karena pertumbuhan cendawan yang lebih cepat daripada pertumbuhan eksplan sendiri. Hal ini menyebabkan cendawan dapat mendominasi permukaan media dan dapat menginvasi (menutupi) eksplan. Adanya dominasi cendawan dalam botol kultur mengakibatkan eksplan yang ditanam tidak memiliki ruang tumbuh yang cukup sehingga pertumbuhannya menjadi terhambat dan akhirnya berujung pada kematian eksplan.Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan dari 74 eksplan yang mengalami kontaminasi karena jamur dapat diketahui bahwa terdapat 2 jenis warna jamur yang berbeda. Menurut Wudianto (2002) diacu dalam Gunawan (2007) warna miselium bermacam-macam yaitu ada yang berwarna putih, cokelat, hitam, merah dan lain sebagainya. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa sebagian besar jenis jamur yang menyebabkan kontaminasi pada penelitian ini memiliki warna miselium putih. Adapun rinciannya yaitu 82,43% jamurdengan
miselium berwarna putih, 17,57 jamur dengan miselium berwarna hitam(Gambar 6).
(a) (b)
Gambar 6 Kontaminasi jamur; (a)jamur miselium warna putih, (b) jamur miselium warna hitam.
Dari keseluruhan eksplan yang terkontaminasi jamur 95,95% diantaranya sumber kontaminan berasal dari eksplan dan sisanya 4,05% berasal dari media. Gunawan (2007) menyatakan bahwa besarnya sumber kontaminasi yang terjadi pada eksplan dan tidak terjadinya browning menunjukkan bahwa adanya kegagalan sterilisasi yang terletak pada ketidakmampuan bahan yang dipakai untuk menghilangkan kontaminan jamur maupun bakteri.
4.7 Kontaminasi Bakteri
Kontaminasi yang disebabkan karena bakteri memiliki persentase yang lebih kecil dibandingkan dengan kontaminasi karena jamur. Dari 104 eksplan yang terkontaminasi 28,85% disebabkan karena bakteri.Hasil pengamatan visual menunjukkan bahwa eksplan yang mengalami kontaminasi bakteri memperlihatkan adanya cairan putih yang keluar seperti lendir dari eksplan dan menyebar pada media yang berada di sekitar eksplan. Darmono (2003) menyatakan bahwa kontaminasi bakteri yang menyerang eksplan pada umumnya ditandai dengan keluarnya cairan berwarna putih keruh seperti susu dan berbau busuk. Sandra (2002) juga mengemukakan hal yang hampir sama yaitu terjadinya kontaminasi karena bakteri dapat menyebabkan pembusukan yang ditandai dengan keluarnya lendir dan bau busuk. Adanya kontaminasi yang berasal dari bakteri sebagian besar menyebabkan kematian maupun pencoklatan (browning) pada
eksplan. Gambar 7 menunjukkan kondisi eksplan yang terkontaminasi oleh bakteri.
Gambar 7 Eksplan terkontaminasi bakteri
4.8 Waktu Teriadinya Kontaminasi
Waktu terjadinya kontaminasi baik karena jamur maupun bakteri bervariasi mulai dari minggu 1 hingga ada yang baru terkontaminasi pada minggu ke-7. Perbedaan waktu kontaminasi ini terjadi karena adanya perbedaan sumber kontaminan penyebabnya. Santoso dan Nursandi (2003) mengemukakan bahwa kontaminasi yang terjadi secara bertahap tersebut membuktikan adanya sumber kontaminan yang tidak hanya berada pada bagian permukaan eksplan saja tetapi juga berada pada bagian dalam eksplan. Hasil pengamatan memperlihatkan bahwa terjadinya kontaminasi yang paling cepat yakni pada minggu pertama dengan jumlah 22 eksplan dari 104 eksplan. Sedangkan waktu kontaminasi terlama yakni terjadi pada minggu ke-7. Sumber kontaminan yang hanya berada pada bagian permukaan saja memiliki respon kontaminasi yang sangat cepat yakni dalam waktu antara 1-2 hari sudah dapat terlihat (Darmono 2003). Infeksi eksternal yang disebabkan oleh mikroorganisme pada umumnya terjadi karena sterilisasi permukaan bahan tanaman yang tidak steril (Darmono 2003). Sedangkan bila sumber kontaminan bersifat internal respon yang muncul dapat terlihat setelah beberapa hari atau bahkan sampai 1 bulan (Gunawan 2007). Menurut Darmono (2003) respon kontaminasi internal yang agak lama ini disebabkan oleh adanya mikroorganisme yang terdapat dalam ruang antar sel memerlukan waktu untuk keluar dari dalam ruang antar sel. Setelah mikroorganisme keluar maka dapat menginfeksi semua bagian eksplan.
4.9 Persentase Keberhasilan Tumbuh Eksplan Terkontaminasi
Dari keseluruhan eksplan yang terkontaminasi baik jamur maupun bakteri ditemukan 19 eksplan yang masih dapat bertahan hidup. Dari 19 eksplan terkontaminasi yang masih dapat tumbuh 2 eksplan diantaranya terkontaminasi bakteri dan 17 eksplan sisanya terkontaminasi jamur.Hal ini berarti pertumbuhan eksplan lebih cepat daripada jamur sehingga jamur tidak mampu mendominasi ataupun menginvasi eksplan dan juga karena jenis jamur yang menginfeksi tidak bersifat toksik sehingga tidak menyebabkan kematian pada eksplan (Gambar 8). Selain itu, tumbuhnya eksplan yang sudah terkontaminasi diduga karena mikroba yang menyerang adalah mikroba sistemik.
(a) (b)
Gambar 8 Kondisi pertumbuhan eksplan yang terkontaminasi; (a) kontaminasi jamur, (b) kontaminasi bakteri
4.10 Pencoklatan (Browning)
Pencoklatan merupakan peristiwa alamiah yang umum terjadi pada sistem biologi tanaman sebagai respon tanaman terhadap pengaruh fisik atau biokimia seperti pengupasan, memar, pemotongan, serangan penyakit dan kondisi yang