2.3. Khasiat Biologis Cincau Hijau P.oblongifolia Merr
3.3.8 Pembuatan Preparat Histologi
Proses pembuatan preparat dan pewarnaan histologi ini disesuaikan dengan metode yang biasa digunakan di Laboratorium Patologi Anatomi FKUI (Stevens & Bancroft 1990). Pemrosesan jaringan untuk dibuat menjadi preparat histopatologi melalui tahapan-tahapan sebagai berikut: fiksasi jaringan, dehidrasi, clearing, infiltrasi, embedding, trimming.
Jaringan kanker difiksasi dengan cara direndam dalam larutan formalin, kemudian dilakukan dehidrasi, penjernihan, infiltrasi lalu dibuat blok paraffin melalui proses yang disebut embedding agar jaringan yang sudah dalam bentuk blok parafin dapat dipotong menggunakan microtom rotary. Proses pemotongan jaringan dalam bentuk blok paraffin disebut dengan trimming. Sampel yang telah dipotong dengan ketebalan ± 4µm dilekatkan pada gelas objek, sampel dapat digunakan untuk proses pewarnaan seperti HE.
3.3.9. Pewarnaan HE (Stevens & Bancroft 1990)
Blok sampel jaringan dipotong, kemudian sampel siap digunakan untuk pewarnaan HE. Proses pewarnaan HE dimulai dengan penjernihan menggunakan
xylol, kemudian rehidrasi menggunakan alkohol dengan konsentrasi menurun dari 100% sampai 70%, kemudian direndam aquades selama 5 menit.
Pewarnaan inti dimulai dengan perendaman menggunakan hematoxylin selama 5-10 menit, kemudian dibilas dengan air mengalir. Hematoxylin akan mewarnai inti sel pada sampel jaringan dengan warna biru. Pewarnaan dilanjutkan dengan alkohol asam jika terlalu biru, dibilas dengan air mengalir, dan dilanjutkan dengan litium karbonat untuk memperjelas warna biru yang terbentuk.
Pewarnaan dilanjutkan dengan pewarnaan sitosol pada jaringan menggunakan eosin, setelah tahap ini sampel melalui tahapan rehidrasi menggunakan alkohol dengan konsentrasi meningkat dari 70% sampai 100%, setelah itu dilakukan penjernihan menggunakan xylol, dan sampel jaringan ditutup dengan gelas penutup dan direkatkan dengan entellan. Sampel histopatologi siap diamati di bawah mikroskop dan difoto untuk selanjutnya dianalisa.
Pembacaan sampel yang telah diwarnai menggunakan metode HE dilakukan dibawah mikroskop dengan pembesaran 200x dengan bimbingan dokter spesialis patologi anatomi. Perubahan sel yang diamati meliputi diferensiasi sel. Diferensiasi sel adalah perubahan bentuk sel dari bentuk aslinya. Diferensiasi dikatakan baik jika bentuk sel atau struktur penyusun sel menyerupai bentuk aslinya, dan dikatakan buruk jika sedikit atau bahkan tidak ada lagi sel yang menyerupai bentuk aslinya. Mitosis menunjukkan pembelahan sel yang terjadi pada jaringan kanker yang sedang diamati sedang aktif membelah. Gambaran mikroskopis secara keseluruhan dilakukan dengan melihat 5x bidang lapang pandang dengan pembesaran 200x hasilnya dirata-rata. Berikut merupakan keterangan skoring terhadap pewarnaan HE (Elston & Ellis 1991). Skor derajat diferensiasi merupakan penjumlahan dari tiga kategori yang meliputi tingkat kepadatan sel, pleomorfisme sel dan mitosis sel.
Klasifikasi dari skor derajat diferensiasi setelah dijumlahkan meliputi derajat diferensiasi antara 3-5, maka jaringan kanker termasuk dalam kelompok terdiferensiasi baik. Jika skor derajat diferensiasi sel antara 6-7, maka jaringan termasuk ke dalam kelompok diferensiasi sedang. Jika skor derajat diferensiasi antara 8-9, maka jaringan termasuk dalam kelompok diferensiasi buruk yang
berarti bahwa bentuk sel sama sekali tidak mirip dengan sel asal.
Rincian kriteria penilaian skor derajat diferensiasi dijelaskan sebagai berikut :
a. Tingkat Kepadatan Sel Tumor :
Skor 1 : tingkat kepadatan sel tumor rendah, ruang antar sel terlihat kurang rapat.
Skor 2 : tingkat kepadatan sel tumor sedang, ruang antar sel terlihat cukup rapat.
Skor 3 : tingkat kepadatan sel tumor tinggi, ruang antar sel terlihat sangat rapat. b. Tingkat Mitosis Sel :
Skor 1 : sel yang mitosis dengan jumlah sedikit (5-10 sel) Skor 2 : sel yang mitosis dengan jumlah sedang (6-10 sel) Skor 3 : sel yang mitosis dengan jumlah banyak (≥ 11 sel)
c. Pleomorfisme Inti Sel :
Skor 1 : Bentuk sel beragam dan dapat dibedakan satu dengan yang lain, ukuran sitoplasma besar, inti sel berukuran kecil, warna inti sel pada bagian dalam mulai lebih gelap pada bagian lain masih berwarna lebih terang.
Skor 2 : Bentuk sel mulai seragam, ukuran sitoplasma mulai mengecil, inti sel mulai membesar dan semakin jelas duplikasidi dalam sel, warna inti sel semakin gelap.
Skor 3 : Bentuk sel seragam, ukuran sitoplasma mengecil, inti sel berukuran sangat besar, terlihat jelas duplikasi di dalam sel dan warna inti sel gelap.
3.3.10. Pewarnaan Imunohistokimia (Robinson et al. 1990)
Pada pewarnaan imunohistokimia ada beberapa tahapan yang harus dilakukan sebelum pewarnaan IHK dilakukan, yaitu preparasi gelas obyek disebut pelapisan (coating) yang digunakan untuk penempelan sampel menggunakan gelatin seperti pada Lampiran 31, pengirisan (sectioning) sediaan blok
embeding menggunakanan microtom rotary dengan ketebalan ± 4 µm, selanjutnya dilanjutkan dengan proses penempelan (affixing) sampel ke gelas obyek dan
kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan imunohistokimia.
Metode IHK meliputi tiga langkah utama yaitu deparaffinisasi (rehidrasi),
antigen unmasking dan pewarnaan (staining). Proses penjernihan dilakukan sebelum proses rehidrasi menggunakan xylol. Rehidrasi diawali dengan perendaman pro-analysis dengan konsentrasi menurun dari 100% sampai 70%. Proses rehidrasi diakhiri dengan perendaman menggunakan aquades. Proses selanjutnya adalah antigen unmasking. Pada proses ini dilakukan perebusan menggunakan larutan buffer natrium sitrat (lampiran 31) yang bertujuan untuk membuka epitop antigen. Suhu perebusan dijaga sekitar 850
Proses pewarnaan IHK diawali dengan perendaman sampel dengan aquades, pada proses ini penggunaan pap-pen yang mengandung 1-bromopropan untuk membatasi jaringan yang akan diwarnai. Hal ini agar larutan perendam tidak tercecer dan jaringan yang akan dianalisa dipastikan terendam oleh larutan. Proses selanjutnya gelas objek tidak lagi direndam melainkan ditetesi menggunakan pipet tetes. Proses ini dilakukan di box yang dialasi menggunakan tissu yang dibasahi agar dapat mempertahankan kelembaban supaya jaringan tidak cepat kering.
C selama 10 menit kemudian dilakukan proses pendinginan.
Proses selanjutnya inkubasi menggunakan larutan 3% H2O2 dalam dH2
Kemudian proses inkubasi dengan antibodi primer dilakukan pada suhu 4
O selama 10 menit dengan cara diteteskan. Kemudian proses pencucian menggunakan larutan PBS (phosphate buffer saline), pada larutan PBS tidak lupa ditambahkan Tween 20 yang bertujuan untuk menyatukan PBS dan protein target serta membersihkan protein-protein lain bukan menjadi target. Jaringan pada gelas obyek ditetesi dengan larutan protein pemblok (skim milk dalam PBS) sebanyak 100 - 400 µL selama 60 menit pada suhu ruang.
0
C selama semalam. Volume larutan antibodi primer yang diteteskan adalah 100-400 μL dengan pengenceran 1:100. Penetesan larutan antibodi primer dilakukan dengan mikropipet. Perendaman ini bertujuan mengefektifkan reaksi
antara antigen yang terdapat pada jaringan dengan antibodi primer (reaksi Ag-Ab). Pada penelitian ini, antibodi primer yang digunakan ada empat
pada kelinci dari Sigma (nomor produk J4644) dan anti COX-2 yang berasal dari kelinci dikembangkan pada tikus dari Cayman Chemical (nomor katalog 160116), antibodi primer antikaspase-7 yang berasal dari manusia dikembangkan pada kelinci dari Sigma (nomor produk C7724), antiphospho-ERK1/2 yang berasal dari manusia yang dikembangkan pada kelinci dari Sigma (nomor produk E7028).
Setelah diinkubasi selama semalam, larutan antibodi primer dilarutkan menggunakan larutan PBS sebanyak tiga kali, masing-masing selama 5 menit. Perendaman selanjutnya adalah perendaman jaringan dalam larutan antibodi sekunder dengan proses inkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Perendaman dengan antibodi sekunder dilakukan dengan cara diteteskan tepat di atas jaringan. Volume larutan antibodi sekunder yang diteteskan adalah 100-400 μL dengan pengenceran 1:1000. Pada penelitian ini, antibodi sekunder yang digunakan adalah antibodi sekunder IgG kambing anti kelinci yang dilabel dengan enzim HRP (horseradish peroxidase). Selanjutnya, jaringan diinkubasi dengan larutan DAB (diaminobenzidine) sebagai substrat bagi enzim HRP. Reaksi antara DAB dan enzim HRP menghasilkan warna coklat.
Selanjutnya dilakukan pencucian menggunakan aquades, kemudian dilakukan perendaman menggunakan hematoksilin untuk mewarnai inti dan jaringan terfiksasi dengan warna ungu. Perendaman dilanjutkan dengan proses rehidrasi, clearing, dan mounting.
Sampel selanjutnya siap diamati di bawah mikroskop dan direkam dengan foto digital. Pengamatan terhadap sampel dengan pewarnaan IHK adalah menghitung jumlah sel yang positif yang telah diwarnai dengan antibodi primer antiphospho-JNK 1/2, anti-COX-2, antikaspase-7 dan antiphospho-ERK 1/2 diberi skor secara terpisah oleh peneliti dengan dua kali pembacaan pada waktu yang berbeda dan dilakukan secara semikuantitatif.
Skor IHK mengikuti cara Esteva et al. (2004). Distribusi sel yang positif dan intensitas warna dievaluasi sebagai berikut:
0= tidak terdapat area berwarna coklat. 1= < 10% sel yang positif
2= 10-50% sel yang positif 3= >50% sel yang positif